蛇肌果糖1,6—二磷酸酯酶的R态和T态的构象

几种高活性形式的蛇肌果糖１,６－二磷酸酯酶的紫外差光谱与酶在尿素或盐酸胍中差光谱相似,它们的酶学性质及巯基暴露的程度各不相同,提示这些高活性形式的酶的构象呈稳定的松驰状态,构象松驰的程度也各不相同,受果糖２,６－二磷酸、ＡＭＰ的过量底物抑制的酶处于帮种不同的低活性状态,它们的构象特征与Ｒ态相反,提示此三种低活性酶构象处于较紧凑状态,这几种Ｔ态酶巯基暴露的程度,受蛋白水解酶限制性酶解的速度不同,说明     

人胎盘谷胱甘肽S-转移酶中巯基的研究

 用巯基试剂5.5'-二硫双(2-硝基苯甲酸)(DTNB)测得人胎盘谷胱甘肽S-转移酶(GST-π)的总巯基数为每亚基2个,均为表面巯基,,其中一个与DTNB反应快,被修饰后可导致酶活力全部丧失。另一巯基与DTNB反应较慢,可能与酶活力无关。用在12℃测定剩余巯基和Stallcup-Koshland作图法求得DTNB修饰快反应和慢反应巯基的速度常数分别为44056和162min~(-1)(mol/L)~(-1)。底物谷胱甘肽的衍生物S-正辛烷谷胱甘肽(S-o-GSH)能保护GST-π能保护的快反应巯基免受DTNB的修饰,使反应速度常数随着S-o-GSH浓度的增高而降低。S-o-GSH也能保护酶被N-乙基马来酰亚胺(NEMI)修饰失活,但不能保护慢反应巯基被DTNB修饰。另一底物2,4-二硝基氯苯(CDNB)对NEMI的修饰失活没有保护作用。上述结果提示快反应巯基参与GST-π和谷胱甘肽的结合,是组成活性中心的重要基因。     

蛇肌果糖1，6－二磷酸酯酶的R态和T态的构象

几种高活性形式的蛇肌果糖１,６－二磷酸酯酸的紫外差光谱与酶在尿素或盐酸胍中差光谱相似,它们的酶学性质及巯基暴露的程度各不相同,提示这些高活性形式的酶的构象呈稳定的松驰状态（Ｂ态）,构象松驰的程度也各不相同。受果糖２,６－二磷酸、ＡＭＰ和过量底物抑制的酶处于三种不同的低活性状态,它们的构象特征与Ｒ态相反,提示此三种低活性酶构象处于较紧凑状态（Ｔ态）。这几种Ｔ态酶流基暴露的程度,受蛋白水解酶限制性酶解的速度不同,说明这些Ｔ态酶的构象的紧凑程度是有差异的。蛇肌酶的不同的活化状态所具有不同的稳定的构象状态,在能量上可能相差很小,便于受到多种因子的调节。这可能是别构酶所普遍具有的现象。     

蛇肌果糖1,6-二磷酸酯酶精氨酸残基的化学修饰

蛇肌果糖1,6-二磷酸酯酶的精氨酸残基被苯乙二醛或2,3-丁二酮修饰后,可导致酶催化活性以及对AMP抑制的敏感性的丧失。在修饰时,有底物或AMP存在,可分别保护酶的这两种性质,表明与活力有关以及与AMP抑制有关的是两类不同的精氨酸残基。在底物保护了与活力有关的精氨酸残基后,可以观察到修饰引起酶对AMP抑制的脱敏,完全脱敏后,每一亚基有2个精氨酸残基被修饰。在本文条件下,K~ 对酶的激活作用以及K~ 存在时酶对AMP抑制敏感性增强等性质均不因精氨酸残基的修饰而变化。     

蛇肌果糖1,6-二磷酸酯酶精氨酸残基的化学修饰

蛇肌果糖1,6-二磷酸酯酶的精氨酸残基被苯乙二醛或2,3-丁二酮修饰后,可导致酶催化活性以及对AMP 抑制的敏感性的丧失。在修饰时,有底物或AMP 存在,可分别保护酶的这两种性质,表明与活力有关以及与AMP 抑制有关的是两类不同的精氨酸残基。在底物保护了与活力有关的精氨酸残基后,可以观察到修饰引起酶对AMP 抑制的脱敏,完全脱敏后,每一亚基有2个精氨酸残基被修饰。在本文条件下,K~+对酶的激活作用以及K~+存在时酶对AMP 抑制敏感性增强等性质均不因精氨酸残基的修饰而变化。     

蛇肌醛缩酶中巯基的研究

用DTNB为修饰试剂,较为详细地研究了蛇肌醛缩酶各类巯基的反应性能与作用。蛇肌醛缩酶由四个亚基组成,在尿素存在下,酶分子总的巯基数为32;而天然醛缩酶中仅测定到16个巯基,同时酶活性丧失。此外观察到天然醛缩酶中有4个对DTNB呈快速反应的巯基,它们的被修饰并不影响活性。底物存在情况下,天然蛇肌醛缩酶中,仅测到10个巯基,而酶活性基本上不受影响,这表明有6个巯基被底物所保护,这6个巯基可能就是表现酶催化活性所必需的巯基。在底物存在情况下,用NEMI修饰蛇肌醛缩酶,然后加入巯基乙醇停止反应,过量的试剂借透析除去,此时修饰了的酶制剂仍保留着绝大部分活性。再用DTNB去检测巯基,可测定到6个,同时活性也丧失了。当可逆地除去DTNB时,酶活性又重新逐渐恢复。此实验进一步支持蛇肌醛缩酶中有6个巯基是表现活性所必需的。我们过去工作指出蛇肌醛缩酶构型稍不同于兔肌醛缩酶,目前结果表明蛇肌醛缩酶的四个亚基的对称性可能不是完全相同的。     

蛇肌醛缩酶中巯基的研究

用DTNB为修饰试剂,较为详细地研究了蛇肌醛缩酶各类巯基的反应性能与作用。蛇肌醛缩酶由四个亚基组成,在尿素存在下,酶分子总的巯基数为32;而天然醛缩酶中仅测定到16个巯基,同时酶活性丧失。此外观察到天然醛缩酶中有4个对DTNB 呈快速反应的巯基,它们的被修饰并不影响活性。底物存在情况下,天然蛇肌醛缩酶中,仅测到10个巯基,而酶活性基本上不受影响,这表明有6个巯基被底物所保护,这6个巯基可能就是表现酶催化活性所必需的巯基。在底物存在情况下,用NEMI 修饰蛇肌醛缩酶,然后加入巯基乙醇停止反应,过量的试剂借透析除去,此时修饰了的酶制剂仍保留着绝大部分活性。再用DTNB 去检测巯基,可测定到6个,同时活性也丧失了。当可逆地除去DTNB 时,酶活性又重新逐渐恢复。此实验进一步支持蛇肌醛缩酶中有6个巯基是表现活性所必需的。我们过去工作指出蛇肌醛缩酶构型稍不同于兔肌醛缩酶,目前结果表明蛇肌醛缩酶的四个亚基的对称性可能不是完全相同的。     

在大肠杆菌中合成的萤火虫荧光素酶的分离和性质

用生物工程技术将萤火虫荧光素酶基因转移到大肠杆菌,在大肠杆菌中合成荧光素酶。这种工程菌已可通过发酵大量培养,并从菌体分离得到接近纯化的荧光素酶。这种酶的分子量是103kD;巯基试剂5,5’-巯基-2(2-硝基苯甲酸)“DTNB”能抑制酶的活性;对于底物荧光素的K_m为1.2μmol/L;酶反应最适pH为7.77;酶催化的生物发光峰在560nm。     

底物对变性酶的修复作用

 兎肌肌酸激酶被LDS变性后,底物能够诱导变性酶使其活力和构象得到部分恢复。变性程度不同的酶,构象和活力的恢复程度也不同:低浓度LDS变性酶,恢复程度较高;反之亦然。活力的恢复与构象的恢复两者呈对应关系。底物修复作用的pH以8.2为好。底物修复作用受其它蛋白质(例如BSA)存在的影响。等速电泳结果表明,BSA能竞争性结合LDS-酶复合物的LDS,使酶成为游离酶。变性酶先与BSA保温再加底物所得的活力恢复,大约是变性酶与含BSA的底物保温所得活力的10倍。这一结果似表明LDS变性酶仍能结合底物;被结合的底物还能使变性酶的构象发生变化。     

2-氯汞-4-硝基苯酚对人肌肌酸激酶巯基的修饰

本文用含汞试剂MNP修饰人肌肌酸激酶,结果表明,人肌肌酸激酶有6个可反应巯基。MNP首先修饰了一对与活力无关的非必需巯基,增大MNP摩尔比,则进一步修饰另外四个与活性有关的巯基。修饰酶的差吸收光谱、荧光光谱表明这三对巯基的微环境各不相同。其中第二对巯基很可能是位于活性部位的必需巯基,而第三对巯基则是由于第二对巯基,也就是必需巯基,被修饰后,微区构象发生改变而暴露出来的。比较MNP修饰人肌肌酸激酶、鸡胸脯肌肌酸激酶、兔肌肌酸激酶的结果,探讨了MNP对肌酸激酶的修饰以及人肌肌酸激酶可反应巯基的化学微环境。     

蛇肌果糖1,6-二磷酸酯酶的提纯、性质及钾离子激活的别构动力学

从乌梢蛇肌肉中提纯了果糖1,6-二磷酸酯酶,其最适pH 在中性,分子量14万,由四个亚基组成,二价金属离子镁、锰或锌为表现活力所必需,一价金属离子钾、铵和铯能激活此酶。在不同浓度的甲醇、乙二醇、甘油和二甲基甲酰胺的水溶液中测活表明,蛇肌果糖1,6-二磷酸酯酶比兔肌的这一酶更易失活,提示了在蛇肌酶分子中疏水键对维持酶的三维结构起着更大的作用。K~ 存在下,蛇肌酶的最适pH 从无K~ 时的6.6位移至7.0;而兔肌酶在同样条件下,不论有否K~ ,均为pH7.4。表明K~ 对蛇肌酶有专一性的相互作用。K~ 对蛇肌果糖1,6-二磷酸酯酶的激活是一别构激活作用,具有正协同性,但其Hill 系数随着底物浓度的增高而减小;另一方面,底物抑制的阈值随着K~ 浓度增高而上升,表明K~ 与过量底物为一对相拮抗的别构效应剂,它们与酶的结合部位之间存在着相互作用。K~ 的别构效应导致过量底物与酶的亲和力下降,使酶趋于活性状态;过景底物的别构效应对抗了K~ 的激活,使酶趋于非活性状态。在K~ 存在下,5,5'-二硫-(2-硝基苯甲酸)与酶上巯基的反应速度较无K~ 的为快,表明K~ 的存在改变了酶的构象,使巯基更易发生反应。对于过量底物有抑制作用的酶,在其底物浓度大于抑制阈值的条件下的动力学处理,本文提出了一个公式和方法。     

蛇肌果糖1,6-二磷酸酯酶的提纯、性质及钾离子激活的别构动力学

从乌梢蛇肌肉中提纯了果糖1,6-二磷酸酯酶,其最适pH在中性,分子量14万,由四个亚基组成,二价金属离子镁、锰或锌为表现活力所必需,一价金属离子钾、铵和铯能激活此酶。在不同浓度的甲醇、乙二醇、甘油和二甲基甲酰胺的水溶液中测活表明,蛇肌果糖1,6-二磷酸酯酶比兔肌的这一酶更易失活,提示了在蛇肌酶分子中疏水键对维持酶的三维结构起着更大的作用。K~ 存在下,蛇肌酶的最适pH从无K~ 时的6.6位移至7.0;而兔肌酶在同样条件下,不论有否K~ ,均为pH7.4。表明K~ 对蛇肌酶有专一性的相互作用。K~ 对蛇肌果糖1,6-二磷酸酯酶的激活是一别构激活作用,具有正协同性,但其Hill系数随着底物浓度的增高而减小;另一方面,底物抑制的阈值随着K~ 浓度增高而上升,表明K~ 与过量底物为一对相拮抗的别构效应剂,它们与酶的结合部位之间存在着相互作用。K~ 的别构效应导致过量底物与酶的亲和力下降,使酶趋于活性状态;过量底物的别构效应对抗了K~ 的激活,使酶趋于非活性状态。在K~ 存在下,5,5′-二硫-(2-硝基苯甲酸)与酶上巯基的反应速度较无K~ 的为快,表明K~ 的存在改变了酶的构象,使巯基更易发生反应。对于过量底物有抑制作用的酶,在其底物浓度大于抑制阈值的条件下的动力学处理,本文提出了一个公式和方法。     

剑麻蛋白酶的分离纯化及其部分特性的研究

采用乙醇分步沉淀和 DEAE-纤维素柱层析,可从剑麻 Agave sisalana 叶汁中分离到一个均一的蛋白酶组分,其结晶为平面六边形。该酶可为半胱氨酸和 EDTA 所激活,受 PCMB(p-chloromercuribenzoatc)、DTNB(5,5′-dithiobis(2-nitrobenzoic acid))及 Hg~(2 )、Ag~( )、Cu~(2 )的可逆抑制和碘乙酸(pH 7.5)的不可逆抑制。该酶以酪蛋白为底物时,酶反应的最适 pH 值约为7.5,最适温度为50℃,Km 值为0.0625%酪蛋白,该酶在45℃(含45℃)以下较为稳定。且在6.0—10.0的 pH 值范围内稳定。     

猪肾酰化酶作用机制的研究——Ⅱ.酶蛋白中巯基,咪唑基与酶活力的关系

(1)酰化酶能被各种巯基試剂所抑制,其中以PCMB的抑制最为明显,在所有的抑制情况下,都保留有一定的剩余酶活力。巯基乙酸能完全解除PCMB的抑制,恢复程度随所加的浓度而定,当巯基乙酸过量子抑制剂150倍时,酶活力反而高于原始活力20%,若浓度再高,酶活力又重新下降。(2)酰化酶經光氧化后活力就迅速丧失,但加对色氨酸殘基专一的試剂N-溴代琥珀酰亚胺并不影响酶的活力。溴代乙酸在較高浓度下亦能抑制酶的活力,抑制程度在作用pH为5左右时較为明显。(3)pH不影响酰化酶与底物結合的米氏常数K_M,而影响最大反应速度V。从pH对V影响的作图中求出活性基团的pK值为5.9和8.6,分別相当于酶蛋白中組氨酸和半胱氨酸的解离常数。(4)从实驗結果中推測,組氨酸和半胱氨酸是酰化酶的必需基团,它們可能与酶中金属离子以配位价的形式結合而共同构成一活性中心,在酶催化反应吋底物先通过金属离子与酶相結合,然后再进一步被催化。     

N-乙酰鸟氨酸脱酰基酶活性位点的构成研究

目的:用生物信息学软件预测出N-乙酰鸟氨酸脱酰基酶的活性中心的金属离子结合位点.方法:选用DEPC、WRK、PMSF、NBS、DTNB 5种化学试剂选择性修饰N-乙酰鸟氨酸脱酰基酶中组氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸、色氨酸和半胱氨酸;同时考察Co2、Fe3 、Mg2 、Mn2 、ZN2 、Ni2 、Cu2 等金属离子对酶活性的影响.结果:在DEPC、WRK修饰后,酶的活力明显下降,而PMSF、NBS、DTNB对酶的活力影响不大;说明组氨酸和酸性氨基酸为酶活性中心的必需氨基酸,而丝氨酸残基、色氨酸残基、半胱氨酸残基不参与酶活性中心的组成;Co2 对酶反应有促进作用,验证了生物信息学的预测结果;底物N-乙酰-D,L-蛋氨酸对酶有较好的保护作用,保护作用随浓度增加而增加.结论:本研究为深入研究酶结构与功能的关系提供实验依据,为N-乙酰鸟氨酸脱酰基酶的工业应用提供理论参考.     

底物对LDS变性肌酸激酶的修复作用

本文报导了底物能够诱导变性肌酸激酶活力和构象部分恢复的实验事实.92μm免肌酸激酶用47mMLDS在pH9.0的甘氨酸缓冲液中变性半小时,取1μl变性酶至2ml底物系统中,10分钟后可观察到酶活力的再现:半小时可达对照酶活力的10%.当把此变性酶液按同样倍数稀释至与测活系统相同的缓冲液中,不同时间取样测活,则观察不到活力再现.可见,前述活力再现来自底物对变性酶的作用.底物对变性酶修复后的活力随着变性程度的减小而增大.底物可使低浓度LDS变性酶活力恢复至天然酶水平.ATP对构象修复起着主要作用.     

蛇肌果糖1,6—二磷酸酯酶,果糖2,6—二磷酸,AMP的结…

腺苷一磷酸对４个快反应巯基被修饰的蛇肌果糖１,６－二磷酸酯酶活性的抑制作用增强,而该修饰的酶受果糖２,６－二磷酸的抑制脱敏,ＡＭＰ对酶抑制为半部位反应,酶受果糖２,６－二磷酸抑制的脱敏则表现为全部位反应,经枯草杆菌蛋白酶限制性酶解的果糖１,６－二磷酸酯酶的Ｋ１增大１０倍,但受果糖２,６－二磷酸抑制的性质不变,经胰蛋白酶限制性酶解的果糖１,６－二磷酸酯酶的活性不再为ＡＭＰ抑制,但果糖２,６－二磷酸对     

恶臭假单胞菌完整细胞的二氢嘧啶酶的性质

由恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)73104产的二氢嘧啶酶对5-苯基海因特异性较高,但也可以水解5-甲硫乙基海因和5-甲基海因;不能水解5-取代基上具有正、负电荷的海因衍生物。酶作用的最适pH因底物不同而有差异,但最适反应温度却相同。 Ag+、Cu2+和Zn2+及金属离子螯合剂对酶活力有强烈抑制作用。将细胞用EDTA处理后约有70％酶活力损失,再加入金属离子,只有Fe2+能将酶活力恢复到原来活力的90％以上,其它金属离子无此作用,证明Fe2+是酶反应所必需的。静息细胞和新鲜细胞在弱酸或弱碱条件下,于40℃以下保温均可使细胞酶活力提高2—3倍,且保温的菌悬液的离心上清液几乎无酶活力;而无细胞提取液保温后无酶活力提高现象,说明在上述条件下,保温可改善细胞膜对底物的通透性,提高酶作用效率。氧能抑制酶反应,主要是因为氧与底物形成可逆结合复合物所致。游离细胞的二氢嘧啶酶对5-苯基海因、5-甲硫乙基海因和5-甲基海因的Km值分别为1.61×10-2、2.08×10-2和1.61×10-2M。     

稳恒磁场对两种不同构象状态的离体牛肝过氧化氢酶的生物学效应研究

通过活力测定,紫外差光谱,多维荧光光谱及差示扫描量热分析,研究了0.23～0.61T稳恒磁场对两种不同构象状态的离体牛肝过氧化氢酶的生物学效应,被选择用于研究的酶的构象状态分别为4℃的钝化状态和25℃的活化状态,二者具有明显不同的构象,4℃时,酚分子处于钝化状态,经0.23～0.61T稳恒磁场处理不同的时间后,几乎不表现出任何磁生物学效应;25℃时,酶分子处于活化状态,经磁场处理后,表现出明显的磁生物学效应;酶活力增加,同时构象发生变化。构象变化导致λ210～310nm紫外差光谱的出现,荧光偏振度的增加,在λ330nm荧光发射峰发射强度的改变及差示扫描量热曲线的产生,研究结果表明：不同的初始构象状态可能是产生不同磁效应的根本原因。     

蛇肌果糖1，6－二磷酸酯酶果糖2，6－二磷酸和底物抑制的结合部位

在果糖１,６—二磷酸酯酶中果糖２,６—二磷酸可能与底物抑制的作用方式不同,因为蛇肌果糖１,６－二磷酸酯酶ｐＨ９．２的活性受到果糖２,６－二磷酸的抑制,而不受高浓度底物的影响。Ｋ＋能增强果糖２,６—二磷酸对酶活性抑制,并能较大程度地解除过量底物的抑制。快反应流基修饰酶不再受较低浓度果糖２,６—二磷酸的抑制,但高浓度果糖２,６—二磷酸仍能抑制酶活性,其ＩＣ５０增大４０倍。修饰酶受底物抑制的阈值不变。为胰蛋白酶或枯草杆菌蛋白酶限制性酶解的果糖１,６—二磷酸酯酶受过量底物和果糖２,６—二磷酸抑制的行为也不相同。以上结果可能提示在蛇肌果糖１,６—二磷酸酯酸中存在既有别于ＡＭＰ,又有别于过量底物的结合部位。