人乳头瘤病毒18型L1蛋白的包涵体和可溶性表达及纯化

目的:原核表达系统表达人乳头瘤病毒18型(HPV18)L1蛋白,建立包涵体和可溶性表达的L1蛋白的纯化方法。方法:构建重组表达质粒p GEX-4T-1-HPV18 L1,在大肠杆菌BL21中以包涵体和可溶性方式表达HPV18 L1蛋白。通过超声波破碎菌体、洗涤包涵体、碱变性、透析复性和谷胱甘肽(GST)琼脂糖凝胶4B亲和层析纯化包涵体蛋白;在菌体中加入三磷酸腺苷(ATP)和3.5 mol/L尿素孵育后,GST 4B亲和层析纯化可溶性蛋白,凝血酶酶切。SDS-PAGE和Western印迹鉴定表达和纯化产物。结果:SDS-PAGE结果表明,HPV18 L1蛋白以包涵体和可溶性方式在大肠杆菌BL21内高效表达,均产生相对分子质量约为86 000的HPV18 L1-GST融合蛋白。Western印迹结果显示,包涵体纯化后获得的融合蛋白降解条带较多;而可溶性蛋白纯化后获得的融合蛋白未降解,凝血酶酶切后得到HPV18 L1蛋白,可与HPV18 L1蛋白单克隆抗体结合。结论:采用原核系统表达了HPV18 L1-GST融合蛋白,分别建立了包涵体和可溶性蛋白的纯化方法,获得HPV18 L1蛋白,为其进一步应用奠定了基础。     

检测猪丹毒杆菌抗体重组SpaA ELISA的建立

【目的】利用表达纯化的猪丹毒杆菌表面保护性蛋白SpaA,建立检测猪丹毒杆菌抗体的间接ELISA方法。【方法】克隆扩增猪丹毒杆菌SpaA基因,并将SpaA基因与原核表达载体p GEX-6P-1连接,通过PCR、双酶切及测序鉴定后,将阳性重组质粒转化入受体菌E.coli Rosetta(DE3),并利用IPTG进行诱导表达,SDS-PAGE和Western blot鉴定表达产物。将SpaA重组蛋白按不同浓度包被酶标板,通过方阵滴定法确定最佳抗原包被浓度及血清稀释度,并对其他条件进行优化,最终建立检测猪丹毒杆菌抗体的间接ELISA方法。【结果】利用克隆表达的猪丹毒杆菌SpaA蛋白作抗原,通过方阵滴定法确定蛋白最佳包被浓度为1.0 mg/L,血清的最佳稀释度为1:100,建立了检测猪丹毒杆菌抗体的间接ELISA方法,批内及批间变异系数均小于10%,具有较好的重复性及特异性。用建立的间接ELISA方法检测猪丹毒疫苗免疫后的健康猪血清样品,检测结果与美国TSZ公司猪丹毒杆菌抗体检测试剂盒和Western blot鉴定结果进行对比,两者总符合率分别为92.20%、92.59%。【结论】试验利用原核表达的SpaA重组蛋白作抗原建立的检测猪丹毒杆菌抗体的间接ELISA方法,特异性强、重复性好、敏感性高,可用于猪丹毒杆菌的抗体检测及流行病学调查。     

布鲁氏菌L7/L12蛋白的基因克隆与原核表达

本研究对羊布鲁氏菌L7/L12蛋白进行了表达和纯化。首先从布鲁氏菌M5基因组中克隆L7/L12目的基因片段,连接至pMD-19T载体,转化入E.coli DH5α感受态细胞,PCR鉴定及测序鉴定正确后对其进行双酶切,构建重组质粒pGEX-6P-1-L7/L12并利用E.coli BL21(DE3)进行诱导表达。羊布鲁氏菌L7/L12基因片段大小为375 bp。SDS-PAGE检测蛋白大小为13 kD,与预测值相符。Western blotting方法检测其免疫学特性。实验结果表明,成功构建了pGEX-6P-1-L7/L12原核表达载体,并在大肠杆菌中成功表达了L7/L12重组蛋白,Western blotting法检测其具有免疫反应。本实验为下一步研究蛋白功能及布鲁氏菌新型疫苗的研制提供了实验基础。     

ASFV多表位融合基因MeP72基因的克隆、表达及其间接ELISA检测方法建立

[目的]建立以重组多表位融合蛋白re MeP72为包被抗原的ASFV间接ELISA检测方法。[方法]预测分析ASFV结构蛋白P72的优势抗原表位,串连优势抗原表位并优化稀有密码子以合成多表位融合抗原基因MeP72。在毕赤酵母表达系统中诱导表达,分析重组融合蛋白的反应原性。用re MeP72做包被抗原,建立ASFV的ELISA间接检测方法。[结果]成功构建了402 bp的MeP72基因片段。SDS-PAGE和Western Blotting分析该蛋白在14 k Da有条带,证明其反应原性良好。经ELISA反应条件优化,建立的ELISA方法与猪的其他病原的阳性血清不发生交叉反应,且可检测到稀释倍数为1∶512 ASFV阳性血清,证明其特异性和敏感性良好。[结论]建立了抗原包被浓度为15μg/mL,一抗、二抗稀释倍数分别为1∶200、1∶5 000倍的特异性和敏感性良好的re MeP72-ELISA检测方法。     

家兔支气管败血波氏杆菌重组百日咳杆菌粘附素（PRN）蛋白的原核表达及其间接ELISA方法的建立

目的表达支气管败血波氏杆菌（Bordetella bronchiseptica,Bb）PRN蛋白,并以此建立检测Bb抗体的间接ELISA方法。方法参照GenBank公布的猪源支气管败血波氏杆菌prn基因序列（AY376325）设计了一对特异性引物,PCR扩增出相应的核苷酸片段。将PCR扩增产物连接至原核表达载体pGEX-4T-1中,以E.coli BL21（DE3）为表达菌株进行诱导表达,以纯化重组蛋白PRN作为诊断抗原,通过探索最佳抗原包被量和抗体血清稀释倍数等,建立检测支气管败血波氏杆菌抗体的间接ELISA方法。结果成功克隆了prn全基因序列,并在E.coliBL21（DE3）中获得高效表达,经SDS-PAGE、Western blot分析显示重组蛋白PRN具有良好的抗原性。应用重组蛋白PRN为抗原建立了检测Bb血清抗体的间接ELISA诊断方法。试验确定重组蛋白PRN抗原的包被浓度为500ng/mL,最适血清稀释度为1∶40。结论建立的ELISA检测方法,不仅为Bb抗体检测提供了实用的血清学检测手段,也为进一步开发Bb检测试剂盒奠定了基础。     

家兔支气管败血波氏杆菌重组蛋白DNT1的原核表达及其间接ELISA方法的建立

目的表达支气管败血波氏杆菌（Bordetella bronchiseptica,Bb）DNT蛋白,并以此建立检测Bb抗体的间接ELISA方法。方法参照GenBank公布的猪源支气管败血波氏杆菌dnt基因序列（AB020025）针对其N-端设计了一对特异性引物,PCR扩增出相应的核苷酸片段。将PCR扩增产物连接至原核表达载体pET-28a（＋）载体中,以E.coli BL21（DE3）为表达菌株进行诱导表达,以纯化重组蛋白DNT1作为诊断抗原,通过探索最佳抗原包被量和抗体血清稀释倍数,建立检测支气管败血波氏杆菌重组蛋白DNT1抗体的ELISA方法。结果成功克隆了dntN-端的基因序列,并在E.coli BL21（DE3）中获得高效表达,经SDS-PAGE、Western blot分析显示重组蛋白DNT1具有良好的抗原性。应用重组蛋白DNT1为抗原建立了检测Bb血清抗体的间接ELISA诊断方法。试验确定重组蛋白DNT1抗原的包被浓度为6.25μg/mL,最适血清稀释度为1∶100。结论建立的ELISA检测方法,不仅为Bb抗体检测提供了一种比较实用的血清学检测手段,也为进一步开发Bb检测试剂盒奠定了基础。     

小鼠黑色素瘤相关抗原MART1的原核表达及抗体制备

目的:利用基因重组技术获得鼠黑色素瘤相关抗原MART1,并制备兔抗鼠多克隆抗体。方法:采用RT-PCR方法从小鼠黑素瘤B16-F1细胞株总RNA中扩增MART1的编码c DNA序列,并构建p ET32a-MART1原核表达质粒,将此质粒转化大肠杆菌Rosseta(DE3)菌株后用IPTG诱导表达,获得的MART1融合蛋白依次用Ni-NTA亲和层析和制备性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离纯化,纯化的MART1融合蛋白用SDS-PAGE和Western印迹鉴定;以纯化的MART1融合蛋白为抗原,皮内接种日本大耳白兔,制备多克隆抗体,采用ELISA、Western印迹和细胞免疫荧光法分别检测兔血清中抗体的效价及抗原的特异性。结果:构建出MART1原核表达质粒,小鼠MART1基因在大肠杆菌Rosseta(DE3)中可诱导性表达并有效纯化;用纯化的MART1蛋白在日本大耳白兔中制备出高效价的多克隆抗体(效价1∶1 024 000),该抗体可与原核及真核表达的MART1蛋白特异性结合。结论:建立了鼠MART1蛋白原核表达和纯化技术,制备出的高效价和特异性抗MART1多克隆抗体将为黑色素瘤的防治研究提供技术支撑。     

美洲大蠊i型溶菌酶的原核表达及多克隆抗体制备

旨在获得美洲大蠊i型溶菌酶Pa I的原核表达蛋白,并制备鼠抗Pa I多克隆抗体。PCR扩增Pa I成熟肽编码序列,构建原核表达载体p ET28a-Pa I,诱导表达、纯化Pa I-His融合蛋白,免疫Balb/c小鼠,间接ELISA法检测抗血清效价,Western blotting检测多克隆抗体的特异性。结果显示,Pa I成熟肽部分的编码序列长414 bp,由137个氨基酸组成。构建的原核表达载体p ET28a-Pa I在大肠杆菌Rosetta(DE3)中成功表达,SDS-PAGE检测显示纯化的Pa I-His融合蛋白的大小约为18 k D,间接ELISA和Western blotting分析表明免疫小鼠产生的抗血清具有较高的效价和较强的特异性。美洲大蠊溶菌酶Pa I成功实现原核表达,并获得了高效价特异性多克隆抗体。     

鞭毛蛋白FliC突变体/HPV 18 L2N融合蛋白的表达与纯化

目的:人乳头瘤病毒(HPV)的持续性感染导致女性宫颈癌的发生。HPV的次要衣壳蛋白L2可以诱发交叉中和多种型别HPV的中和抗体,但是单独免疫L2诱发的抗体滴度较低。鼠伤寒沙门氏菌鞭毛蛋白FliC是一种有效的佐剂。删除FliC超变区域的突变体可与外源抗原融合表达并且显著增强外源抗原特异性抗体的产生。本研究旨在构建鞭毛蛋白FliC超变区删除突变体与HPV 18 L2N(aa.13-154)的融合基因,通过大肠杆菌原核表达系统表达FliC突变体与HPV 18 L2N的融合蛋白并纯化,为研究鞭毛蛋白的佐剂活性及新型HPV 18L2疫苗奠定基础。方法:以鼠伤寒沙门氏菌鞭毛蛋白编码基因fliC为模板,通过重叠PCR法构建删除fliC D3区域(fliC△D3)、D3+CD2a区域(fliC△D3CD2a)、D3+D2区域(fliC△D2D3)的突变体,同时将HPV 18 L2N基因插入置换突变体的超变区删除区域。含有重组基因的表达载体在大肠杆菌中诱导表达,经SDS-PAGE及Western blot鉴定分析。表达的融合蛋白经Ni-Sepharose亲和层析纯化及Q-Sepharose离子交换层析去除内毒素。纯化后的融合蛋白经Native-PAGE鉴定分析,通过鲎试剂凝胶法测量蛋白溶液中的内毒素含量。结果:构建了pET22b-fliC△D3/18 L2N、pET22b-fliC△D3CD2a/18L2N、pET22b-fliC△D2D3/18 L2N重组载体。重组载体在大肠杆菌以包涵体形式高效表达,且主要以单体形式存在。结论:通过原核表达及层析法纯化,成功获得了无热源、高纯度的鞭毛蛋白FliC突变体与HPV 18 L2N的融合蛋白,为增强HPV L2免疫原性提供了一种新的途径,为进一步研制HPV 18 L2疫苗奠定了基础。     

人乳头瘤病毒11型L2NE7E6融合蛋白的原核表达及其诱发的T细胞免疫反应

目的:在原核表达系统中表达人乳头瘤病毒11型(HPV11)L2NE7E6融合蛋白,纯化蛋白后免疫小鼠,检测其诱发的T细胞免疫水平,并筛选HPV11 E6、E7特异的T细胞表位肽。方法:用重叠PCR方法构建HPV11L2NE7E6融合基因并插入原核表达质粒,在大肠杆菌中经IPTG诱导表达融合蛋白L2NE7E6,用SDS-PAGE和West-ern印迹鉴定融合蛋白的表达。Q柱纯化蛋白后免疫C57BL/6小鼠,分别用覆盖HPV11 E6和E7蛋白序列的肽库,采用酶联免疫斑点法(ELISPOT)检测其诱发的E7、E6特异的T细胞免疫反应,并筛选E7、E6特异的T细胞表位肽。结果:在原核表达系统中有效表达了HPV11 L2NE7E6融合蛋白,蛋白纯化后免疫C57BL/6小鼠,分别能检测到针对HPV11 E6、E7肽库刺激产生的特异性T细胞免疫反应。经肽池筛选到1条强的E6 T细胞表位肽E6aa41-55(AEI-YAYAYKNLKVVW);而E7只筛选到2条弱的T细胞表位肽,分别为E7aa53-67(QILTCCCGCDSNVRL)和E7aa73-87(DGDIRQLQDLLLGTL)。结论:HPV11 L2NE7E6融合蛋白能诱发小鼠产生E6、E7特异性细胞免疫反应,可作为尖锐湿疣免疫治疗候选疫苗。     

药用寄生植物菟丝子属,列当属和无根藤属氨基酸的分析

本文测定了菟丝子属、列当属和无根藤属某些种的种子和植株氨基酸的种类组成和含量。结果表明,3个属种子和植株氨基酸均在15种以上,且含量丰富,特别是必需氨基酸的含量较高。文中讨论了氨基酸的药用和在种子鉴定与化学分类上的作用,探讨了开发应用的前景。     

胡葱与洋葱、葱过氧化物酶同工酶研究及聚类分析

本文对胡葱与洋葱、葱的功能叶过氧化物酶同工酶电泳图谱分析和聚类分析表明：这三个种及葱的3个交种闻的亲缘关系被区分开来;胡葱与洋葱的亲缘关系比胡葱与大葱的亲缘关系更近。     

大麦与小麦属间杂种的形态学和细胞遗传学研究

通过幼胚培养技术分别获得了大麦(Hordeum vulgare L., 2n=2x=14)与普通小麦(Triticum aestivum L., 2n=6x=42)、硬粒小麦(T. durum d. sf., 2n=4x=28)以及栽培二粒小麦(T. dicoccum Schrank 2n=4x=28)之间的属间杂种,平均杂交结实率分别为3.0％、1.2％和0.8％。杂种在形态上偏向小麦,自交不孕,用父本作回交亲本获得了大麦×普通小麦杂种的回交一代。所有杂种均表现细胞学上的不稳定性。杂种减数分裂中期1 PMC染色体平均配对频率和交叉结频率分别为27.31Ⅰ 0.33Ⅱ 0.011Ⅲ,0.45;20.571 0.20Ⅱ 0.008Ⅲ,0.25和20.41Ⅰ 0.28Ⅱ 0.005Ⅲ,0.32,表明双亲染色体组间不存在同源关系。大麦×四倍体小麦杂种小孢子的染色体计数表明,杂种中未减数雄配子的频率在60％以上。     

胡葱与洋葱、葱亲缘关系初探

Allium ascalonicum L,在我国的邦名比较混乱,而且它与洋葱、葱的亲缘关系不清。作者认为,它在我国的邦名应规范为胡葱,同时,从性状比较的角度研究胡葱与洋葱、葱之间的亲缘关系。结果表明,胡葱的植物学特征和生物学特性介于洋葱和葱之间。     

Identification and nucleotide sequence of Brucella melitensis L7/L12 ribosomal protein

Abstract DNA sequencing of the gene encoding a Brucella melitensis 12-kDa protein revealed that this protein was the ribosomal protein L7/L12. The B. melitensis L7/L12 DNA sequence was identical to that of the corresponding B. abortus gene, showing the near identity of these two organisms. When comparing the sequence of this protein to that of other organisms some domains were highly conserved, especially the C-terminus, which contrasted with the lack of conservation of the sequences at the N-terminus. The finding that the ribosomal protein L7/L12 of Brucella is an immunodominant antigen provides a new rationale to explain the activity of ribosomal vaccines.     

N-乙酰-L-半胱氨酸的合成及其在医药上的应用

概述了近几十年来国内外关于Ｎ－乙酰－Ｌ－半胱氨酸的合成方法及其在医药上的应用。     

L6565小鼠白血病病毒诱发小鼠白血病

为探讨病毒与白血病发生的关系,我们用L6565小鼠白血病病毒（L6565MLV）悬液感染乳鼠,每周观察小鼠的发病情况及病理变化,并用逆转录一聚合酶链反应（RT－PCR）动态检测小鼠体内病毒核酸的分布,结果发现：小鼠感染病毒后3－5周,其脾脏和淋巴结呈早期白血病的病理改变,至第10－12周小鼠发生淋巴细胞白血病,表现出耸毛、活动减少、腹膨胀等症状。病毒核酸于感染后第2周首先在小鼠胸腺、脾脏检测到,随时间延长,病毒核酸广泛分布在外周血、胸腺、脾脏、淋巴结等多种脏器组织中。本实验表明L6565小鼠白血病病毒可诱发小鼠白血病,其机制可能与病毒促使淋巴细胞向白血病细胞转化有关。     

L6565小鼠白血病病毒诱发小鼠白血病

为探讨病毒与白血病发生的关系,我们用L6565小鼠白血病病毒(L6565MLV)悬液感染乳鼠,每周观察小鼠的发病情况及病理变化,并用逆转录一聚合酶链反应(RT-PCR)动态检测小鼠体内病毒核酸的分布.结果发现小鼠感染病毒后3～5周,其脾脏和淋巴结呈早期白血病的病理改变.至第10～12周小鼠发生淋巴细胞白血病,表现出耸毛、活动减少、腹膨胀等症状.病毒核酸于感染后第2周首先在小鼠胸腺、脾脏检测到,随时间延长,病毒核酸广泛分布在外周血、胸腺、脾脏、淋巴结等多种脏器组织中.本实验表明L6565小鼠白血病病毒可诱发小鼠白血病,其机制可能与病毒促使淋巴细胞向白血病细胞转化有关.     

祁门过路黄和过路黄核型的比较研究

报道了祁门过路黄和过路黄的核型。前者核型公式为2n=2x=24=6m 6sin 6st 6t,为首次报道;后者核型公式为2n=2x=24=2m 4sm 6st 12t。与前人报道一致．并进一步对二者的核型进行比较分析。根据核型和外部形态特征的综合分析,祁门过路黄和过路黄的差异水平已明显超过种内变异水平,故将祁门过路黄独立出来,另立新种,是比较恰当的。