采用Gateway^TM技术构建人骨形态发生蛋白-2基因重组腺病毒载体

目的：采用基于attLXattR的入噬茵体位点特异性重组系统的Gateway^TM技术构建人骨形态发生蛋白-2基因重组腺病毒载体（Ad—hBMP-2）。方法：从pcDNA3．1质粒中获取目的基因hBMP-2片段,连入带attL1、attL2位点的入门载体pENTRTM11中,形成入门克隆,将入门克隆与带attR1、attR2位点的目的载体Ad／CMV／V5-DEST在高效重组酶作用下发生体外重组形成表达克隆ad—BMP-2,经鉴定将ad—BMP-2线性化后转入293A细胞包装,通过细胞裂解法获得人骨形态发生蛋白-2的基因重组腺病毒珠Ad-hBMP-2,将其扩增,采用western blotting技术分析目的蛋白表达。结果：经酶切及测序证实目的基因BMP-2片段按正确方向重组入目的载体中,带BMP-2的目的载体在293A细胞中包装成功,获得成熟的病毒颗粒,测得病毒滴度为2.5×10^9pfu／ml,western blotting结果证实Ad—hBMP-2在293A细胞中高效表达hBMP-2蛋白。结论：本实验首次利用基于入噬菌体的位点特异性重组系统的Gateway^TM技术成功构建了Ad—hBMP-2,该技术与传统构建方法比较具有高效性和灵活性,为进一步研究BMP-2的生理功能和利用BMP-2进行骨基因治疗奠定了实验基础。     

骨形态发生蛋白在多器官组织分化发育中的作用及研究进展

骨形态发生蛋白(Bone morphogenetic proteins,BMPs)是一种多功能蛋白,是转化生长因子TGF-β超家族成员,参与骨器官发生、形成与再生的过程,同时对神经系统、造血系统的分化发育也有调控作用.目前,BMPs的研究已经涉及发育生物学、遗传学等多个领域,并在临床上具有广泛的应用前景.基于相关研究近状,对BMPs的分子结构特征及其在多器官组织分化发育中的作用进行分析,为进一步研究BMPs的体内活性及临床应用提供了理论借鉴和参考.     

人骨形态蛋白-2对椎间盘细胞蛋白多糖和Ⅱ型胶原的影响

目的研究人骨形态蛋白(human bone morphogenetic protein-2,hBMP-2)对体外培养人腰椎间盘髓核细胞Ⅱ型胶原和aggrecan的影响。方法人退变髓核细胞体外分离培养,通过免疫组织化学鉴定椎间盘细胞。利用ELISA法检测对照组和不同剂量hBMP-2(10ng/ml和100ng/ml)组Ⅱ型胶原和aggrecan的表达水平。用RT-PCR检测细胞Ⅱ型胶原和aggrecan的mRNA表达水平。结果加入hBMP-2后Ⅱ型胶原和aggrecan表达增加,并存在剂量依赖关系(P<0.01)。在第6天RT-PCR结果显示hBMP-2组aggrecan和Ⅱ型胶原mRNA的表达高于对照组,并且随剂量增高aggrecan和Ⅱ型胶原mRNA的表达量逐渐增加。结论hBMP-2可促进体外培养人腰椎间盘细胞合成代谢,Ⅱ型胶原和aggrecan表达量增加,并存在剂量依赖关系,提示hBMP-2可能对退变椎间盘具有修复功能。     

采用GatewayTM技术构建人骨形态发生蛋白-2基因重组腺病毒载体

目的:采用基于attLXattR的λ噬菌体位点特异性重组系统的GatewayTM技术构建人骨形态发生蛋白-2基因重组腺病毒栽体(Ad-hBMP-2).方法:从pcDNA3.1质粒中获取目的基因hBMP-2片段,连入带attL1、attL2位点的入门载体pENTRTM11中.形成入门克隆,将入门克隆与带attR1、attR2位点的目的载体Ad/CMV/V5-DEST在高效重组酶作用下发生体外重组形成表达克隆ad-BMP-2,经鉴定将ad-BMP-2线性化后转入293A细胞包装,通过细胞裂解法获得人骨形态发生蛋白-2的基因重组腺病毒珠Ad-hBMP-2,将其扩增,采用western blotting技术分析目的蛋白表达.结果:经酶切及测序证实目的基因BMP-2片段按正确方向重组入目的载体中,带BMP-2的目的栽体在293A细胞中包装成功,获得成熟的病毒颗粒,测得病毒滴度为2.5×109pfu/ml.western blotting结果证实Ad-hBMP-2在293A细胞中高效表达hBMP-2蛋白.结论:本实验首次利用基于λ噬菌体的住点特异性重组系统的GatewayTM技术成功构建了Ad-hBMP-2,该技术与传统构建方法比较具有高效性和灵活性,为进一步研究BMP-2的生理功能和利用BMP-2进行骨基因治疗奠定了实验基础.     

人骨形成蛋白-7成熟肽基因在巴斯德毕氏酵母中的分泌表达

目的:利用甲醇酵母表达系统,构建重组人骨形成蛋白-7(rhBMP-7)成熟肽的基因工程菌,并实现其分泌表达。方法:采用PCR方法,依据GenBank数据库中hBMP-7成熟肽序列(AccessionNo.NM_001719)设计并合成一对引物,从已构建的含hBMP-7的克隆载体中扩增获得人骨形成蛋白-7成熟肽基因片段,并以pPIC9K为表达载体构建重组表达质粒,电转化巴斯德毕氏酵母SMD1168,于30℃进行甲醇诱导分泌表达,经筛选获得rhBMP-7成熟肽表达株,并进行了表达产物的活性测定。结果:表达产物存在于培养上清中,约占分泌蛋白总量的8%。经Western印迹分析可以检测到重组表达产物,ELISA检测其具有特异性结合活性。结论:构建了重组人骨形成蛋白-7成熟肽的基因工程菌并在甲醇酵母中实现了分泌表达,为进一步的活性及功能研究奠定了基础。     

骨形成蛋白-2表达载体的构建及其转录活性测定

将骨形成蛋白-2(BMP-2)基因克隆入带HA标签的BMP-2表达载体中,得到带HA标签的重组质粒pGBKT7/HA-BMP-2,将该重组质粒转染酵母AH109、Y187细胞,Western印迹检测表明表达了与预期相对分子质量大小一致的BMP-2.BMP-2表达载体的成功构建为深入研究骨形成蛋白-2在促进骨痂生成过程中的分子机制及其生物学功能打下了基础.     

hBMP-3m基因在烟草中的表达

PCR扩增人骨形成蛋白-3成熟肽(hBMP-3m)cDNA,纯化后连接人pUC19质粒,构建克隆载体pUC19B3m;用EcoR Ⅰ和HindⅢ酶解pUC19B3m和pJIT163,将目的片段插入pJIT163,构建中间载体pJIT163-B3m;再构建植物表达载体pCAMBIA1300-B3m。利用冻融法将质粒pCAMBIA-hBMP3m转入根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)LBA4404。以烟草(Nicotiana tabacum L.)无菌苗叶盘为外植体,通过根癌农杆菌介导法进行遗传转化,获得了在含25mg／L潮霉素(Hygromycin,Hyg)的筛选培养基上再生的抗性植株,经PCR证实其中部分植株已将人骨形成蛋白-3成熟肽基因整合到烟草基因组中,Western Blot结果表明已有微量BMP表达。关键词：人骨形成蛋白-3成熟肽(hBMP-3m);烟草;根癌农杆菌介导法。     

成骨细胞的骨形成调控机制

成骨细胞在骨的形成、发育、改建、修复过程中发挥重要作用,多种生长因子可影响成骨细胞的增殖、分化及其合成细胞外基质的作用。多种生长因子对成骨细胞的作用既有相同之处,也有不同点。寻找一种或联合应用几种不同的生长因子达到既能促进成骨细胞增殖又保持其成骨活性将是今后研究的热点。     

抗感染活性骨治疗感染性胫骨骨不连的临床研究

目的:观察抗感染活性骨(ARBX)治疗感染性胫骨骨不连的临床效果。方法:回顾性分析我院自2008年1月-2015年1月收治并系统随访应用抗感染骨治疗的36例创伤后感染性骨不连病例,给予原内固定取出或外架拆除,病灶清除,去除硬化骨及死骨,髓腔再通,抗感染活性骨植骨,外架或钢板重新固定,统计患者病程时间,伤口愈合时间,患者院前手术次数,滴注引流时间及抗生素应用疗程,骨性愈合时间,内、外固定物拆除时间以及功能恢复情况,并总结治疗疗效。结果:平均随访2.4年(1年2月-4年10月),骨不连彻底治愈30例,4例患者感染控制,半皮质愈合,2例感染复发,骨不连未愈合。结论:1抗感染活性骨是治疗感染性骨不连的一种有效的植骨材料,具有控制感染,促进骨折愈合的作用;2彻底清除坏死,失活组织是控制感染,促进感染性骨不连愈合的关键;3清理断端,断端骨髓腔再通可促进成骨,促进骨折愈合。     

合成成骨生长肽的骨内外成骨活性

利用固相多肽合成人成骨生长肽（sOGP),纯度达99．2％,HPLC及毛细管电泳均一,蛋白质序列分析和质谱分析符合理论值。在体内我们观察了sOGP对兔胫骨骨折愈合的药效。用血生化、X射线、骨密度、组织学外骨痂分析、生物力学等方面测得sOGP能显著促进新生骨形成,明显增加成骨活性蛋白碱性磷酸酶（ALP）和骨钙素（BGP）的血清水平,对兔胫骨不稳定的横断骨折愈合具有一定的促进作用。尤其是实验组骨密度和外骨痂中小梁骨成分显著地加的数据,具有统计学意义。还观察了sOGP在没介质中对原代成骨细胞的成骨活性。在体外sOGP低剂量(10^-11mol/L）对原代成骨细胞有明显的增殖作用,表现双向调节。有趣的是sOGP在体外的成骨活性作用必须有血清白蛋白（BSA）和血清中某些因子的参与。     

重组人骨形成蛋白-3成熟肽的表达、纯化及诱骨活性的研究*

推测人骨形成蛋白-3羧基端的127氨基酸的肽段为其成熟肽(hRMP 3m)。将编码此成熟肽的cDNA插入含PL启动子的表达质粒pDH中,构建表达质粒pDH-B-3m,转化大肠杆菌DH5α。42℃热诱导6h后表达量达到最高水平,约占菌体总蛋白28％;表达产物以包涵体形式存在。包涵体经分离和洗涤后．溶解于尿素,在变性溶解状态下经阳离子交换层析,目的蛋白纯度至少在95％以上。再经稀释复性。然后将纯化、复性的重组人骨形成蛋白3成熟肽(rhBMP－3m)植入小鼠肌肉间隙,于不同时间取材观察,在局部可见典型的软骨形成、软骨内成骨以及骨组织形成的过程,证实所制备的rhBMP－3m具有明显的异位诱骨活性。     

人骨形成蛋白-2C端102肽的诱骨活性

为分析更短的Hbmp-2C端肽是否具有诱骨活性 ,寻求新型的有诱骨活性的基因工程Hbmp-2产品。利用温度诱导的大肠杆菌表达系统表达肽段长度为102个氨基酸的Hbmp-2C端肽及其Cys的突变体。表达产物经纯化复性后 ,植入小鼠肌袋模型中测试其诱骨活性。获得了能稳定表达Hbmp 2C端肽的工程菌 ,测序结果与预期的序列完全一致。表达产物以包涵体形式存在 ,表达量占细胞总蛋白的 3 0 %。产物经纯化复性后 ,小鼠肌袋模型测试结果表明 :Hbmp 2 10 2肽仍具有诱骨活性 ,而将C端第一位Cys突变的 10 2肽诱骨活性丧失。实验表明 :比Hbmp 2成熟肽 ( 114个氨基酸 )更短的C端 10 2肽仍具有良好诱骨活性 ,这 10 2肽N端第一个Cys对其诱骨活性可能是必需的。     

重组人骨形成蛋白—3成熟肽的表达,纯化及诱骨活性的研究

推测人骨形成蛋白３羧基端的１２７氨基酸的肽段为其成熟肽（ｈＢＭＰ３ｍ）。将编码此成熟肽的ｃＤＮＡ插入含ＰＬ启动子的表达质粒ｐＤＨ中,构建表达质粒ｐＤＨＢ３ｍ,转化大肠杆菌ＤＨ５α。４２℃热诱导６ｈ后表达量达到最高水平,约占菌体总蛋白２８％;表达产物以包涵体形式存在。包涵体经分离和洗涤后,溶解于尿素,在变性溶解状态下经阳离子交换层析,目的蛋白纯度至少在９５％以上。再经稀释复性。然后将纯化、复性的重组人骨形成蛋白３成熟肽（ｒｈＢＭＰ３ｍ）植入小鼠肌肉间隙,于不同时间取材观察,在局部可见典型的软骨形成、软骨内成骨以及骨组织形成的过程,证实所制备的ｒｈＢＭＰ３ｍ具有明显的异位诱骨活性。     

成骨分化特异性转录因子Cbfa1

近年来随着Cbfa1基因的克隆及其功能的阐明,人们对成骨分化的分子机制有了初步了解,基因调皮除、基因突变等方法证实Cbfa1作为成骨分化的特异性转录因子,对成骨细胞分化、骨的发育和形成具有关键作用。     

转化生长因子TGF-1β1／结缔组织生长因子CTGF对骨创伤愈合的调控机理研究

转化生长N子TGF—β1和结缔组织生长因子CTGF是骨形成过程中不可或缺的重要生长因子。研究发现TGF-β1和CTGF具有协同生物效应,CTGF可能作为TGF-β1的下游信号发挥作用。本文对近年来TGF-β1／CTGF通路在骨发育与创伤愈合中相关信号转导调控及分子机制研究进行讨论。尤其是对成骨细胞增殖、分化和功能的调控机理进行综述。     

Periostin 蛋白与成骨相关性的研究进展

Peiostin又称为成骨细胞特异因子2(OSF-2),是一种具有多种功能的细胞外基质蛋白,其在物种形成过程中高度保守,已知其在骨、肿瘤、心血管、呼吸系统以及组织修复中均有作用。研究表明,periostin的表达受多种生长因子和环境因子的调控,通过与整合素受体αvβ3或者Notch 1蛋白的结合,激活FAK和Akt/PKB或者c-Fos等相关信号通路,进而调控多种细胞(成纤维细胞、内皮细胞、上皮细胞、成骨细胞和平滑肌细胞)的分化、粘附、迁移和存活。在既往的研究中,学者们主要探讨了Periostin在肿瘤发生和转移中的作用。尽管其最先发现于骨,但是periostin与骨相关的研究相对较少。近几年,部分研究分析了periostin在骨生物学中的作用,并指出periostin可能参与了骨的形成。本文就已有的periostin在成骨中的研究作一综述。     

血管内皮细胞生长因子促进成骨作用的研究进展

骨组织的生长和血供密切相关 ,血管内皮细胞生长因子 (VEGF)被公认为是诱导血管生成作用最强的一种细胞因子 ,其自身也和骨形成有着直接的关系。通过对VEGF及其受体分子结构、其在骨发育和骨损伤修复中所起作用、以及目前常见应用方式的相关研究作一系统性回顾 ;阐述了VEGF在软骨内成骨、膜内成骨过程中所起的促进作用 ,对成骨细胞和破骨细胞的积极影响 ,增强其表达的相关条件 ,以及各应用方式的利弊 ;从而展示了VEGF在骨缺损修复中的良好的前景。     

重组人骨形成蛋白—3羧基端肽在大肠杆菌中表达及其诱骨活性

以双顺反子表达载体,在大肠杆菌中经ＩＰＴＧ诱导表达了人骨形成蛋白－３羧基端肽段（ｈＢＭＰ－３Ｃ）,表达量占菌体总蛋白量的１８．５％。目的蛋白为２５ｋＤ、含ｈＢＭＰ－３Ｃ端２１５个氨基酸残基组成的肽段,包括ｈＢＭＰ－３成熟肽和一部分前肽。表达产物以包涵体的形式存在,用含ＴｒｉｔｏｎＸ－１００的洗涤液和５ｍｏｌ／Ｌ以下脲溶液连续涤,可获得较高纯度的重组人骨形成蛋白－３Ｃ端肽,经复性处理成可溶性蛋白,植     

大鼠胫骨近端骨骺损伤后骨桥形成分子机制的研究

利用胫骨近端干骺端骨骺损伤的大鼠动物模型,研究骨桥形成的分子病理机制.通过Alcian blue染色观察损伤模型的建立、损伤愈合过程以及骨桥形成情况.采用Tunel试剂盒原位细胞凋亡检测,了解损伤区及周围细胞凋亡情况.利用免疫组织化学及原位杂交实验,观察损伤区周围软骨细胞改变,检测损伤区是否有软骨细胞生成,检测刀Ihh以及Ptch1表达阳性细胞.发现骨骺损伤骨桥形成过程中,完全损伤区中心没有软骨细胞特异的因子Col2al和ColX以及删Ihh和Ptch1的表达,但是完全损伤区和周围正常软骨交界间存在次损伤软骨区,存在软骨细胞凋亡,有Col X的表达,vimentin检测发现,在此区和周围正常软骨间有正常肥大区软骨细胞异常分化而来的成纤维样细胞并形成软骨外膜样结构,次损伤区和软骨外膜结构逐渐被骨桥替代,在此过程中软骨外膜样结构存在Collal、Ptch1和Ihh的表达,提示Ihh可能参与骨桥形成过程.提出骨桥形成过程中损伤中心区域存在膜内化骨,边缘区域存在软骨化骨作用机制.     

人骨形成蛋白－2AcDNA基因工程产物诱骨活性的形态学证明

人骨形成蛋白２Ａ（ｈｕｍａｎｂｏｎｅｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃｐｒｏｔｅｉｎ２Ａ,ｈＢＭＰ２Ａ）ｃＤＮＡ３′端５６７个核苷酸插入表达载体ＰＳＧ４Ｔ－２中,在大肠杆菌中获得１５％的表达,表达产物为２１ＫＤ的蛋白质,经包涵体洗涤,尿素变性和复性后,取１ｉｎｇ表达产物,植入小鼠股四头肌中,２１天后取植入区进行组织切片观察,证实这种基因工程产物具有良好的异位骨诱导活性。