藏羊肖氏隐孢子虫的分离鉴定

为了解隐孢子虫在藏羊中的感染情况,采用饱和蔗糖漂浮法检查34份藏羊新鲜粪便。通过巢式PCR扩增阳性分离株的18S rRNA、HSP70和CpA135位点基因,并采用限制性内切酶Ssp I和Vsp I对18S rRNA产物进行酶切分析。同时构建系统发育树,分析藏羊感染隐孢子虫类别。结果显示仅1只藏羊感染隐孢子虫,18S rRNA与Cryptosporidium xiaoi山羊分离株(GU553016)相似率为99.9%;HSP70与C.xiaoi绵羊分离株(FJ896041)相似率为98.7%;CpA135与C.ubiquitum人源分离株(HM358023)相似率为99.3%。18S rRNA产物经Ssp I酶切后获得3条条带493 bp、262 bp和103 bp,经Vsp I酶切后获得3条条带508 bp、181 bp和104 bp,与C.bovis酶切条带相似。基于18S rRNA和HSP70的系统发育分析显示,该分离株与C.xiaoi亲缘性最近。这是首次在藏羊体内发现肖氏隐孢子虫。     

利用松茸ITS特异性引物对松茸分离物进行鉴定

利用一对ITS通用引物(YIS4-ITS5)和一对松茸物ITS特异性引物(TMF-TMR)对来源于云南省不同地区的6个松茸(Tricholoma matsutake)子实体及其6株分离物,3个假松茸(Tricholoma bakamatsutake)子实体及其3株分离物、侧耳(Pleurotus astreatus)、金针菇(Flammulina velutipes)和双孢蘑菇(Agaricus bisporus)的子实体进行了PCR扩增,琼脂糖凝胶电泳分析,结果表明ITS4-ITS5能将所有的样品扩增,并得到600bp左右的DNA扩增条带,TMFTMR扩增时,只有松茸子实体及其对应分离物有扩增条带,DNA片段大小在500bp左右。进一步对松茸子实体(TG25)及其分离物(TM25112．2)进行WS序列测定表明两者的DNA同源性为100％,从而证明所分离到的6个菌株确为松茸的纯培养物。     

松茸组织分离物的rDNA-ITS序列鉴定

以采自云南丽江的松茸子实体为材料,进行组织分离后,利用一对ITS引物(ITS1-ITS4)对子实体(SR176B,SR172B)和分离物(SR176H,SR172H)进行了PCR扩增、琼脂糖凝胶电泳分析,得到了700bp左右的扩增条带,进一步对ITS序列进行同源性检索比对,结果表明SR176H与SR176B,SR172H与SR172B序列同源性均为100%,鉴定出该分离物就是松茸的纯培养物。     

一种鉴别临床常见致病性葡萄球菌方法的建立与初步评价

目的建立一种鉴别临床常见致病性葡萄球菌的聚合酶链反应-限制性片段长度多态性（PCRRFLP）方法。方法采用经全自动微生物鉴定系统和分子生物学方法准确鉴定的金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、溶血葡萄球菌各3株,提取细菌DNA,PCR扩增tuf基因,扩增产物Alu I、Hinf I双酶切后进行琼脂糖凝胶电泳,分析不同葡萄球菌酶切后带型的差异。收集临床分离葡萄球菌142株,采用建立的PCRRFLP对其进行分类鉴别,随机选择分类鉴别的葡萄球菌各20株,PCR扩增16S r DNA,扩增产物测序,将结果与Gen Bank数据库进行比对,初步评价该方法的准确性。结果金黄色葡萄球菌,表皮葡萄球菌,溶血葡萄球菌均能扩增出长668 bp DNA片段。扩增产物经Alu I、Hinf I双酶切后电泳条带不同,金黄色葡萄球菌出现三条带（108 bp/192 bp/217 bp）,表皮葡萄球菌出现两条带（192 bp/304 bp）,溶血葡萄球菌出现两条带（192 bp/217 bp）。PCR-RFLP结果显示,142株葡萄球菌中金黄色葡葡球菌、表皮葡葡球菌和溶血葡葡球菌分别为67、29和46株。随机挑选的20株不同种葡萄球菌16S r DNA测序结果与Gen Bank数据库对应序列的相似性均〉99%,说明建立的PCR-RFLP方法能准确区分三种常见葡萄球菌。结论 PCRRFLP能准确鉴别临床常见的致病性葡萄球菌,为葡萄球菌病的分子诊断奠定了基础。     

乙型肝炎病毒adw亚型基因组在大肠杆菌中的克隆

从乙型adw亚型肝炎慢性患者的血浆中,分离纯化了乙型肝炎病毒(HBV)DNA,将HBVDNA以ECOR I酶切,与经ECOR I酶切、磷酸单脂酶处理的pBR325质粒DNA相连接,转化至大肠杆菌RR_1菌株。经筛选鉴定,转化子中有45株含有完整的HBV基因组DNA,应用限制内切酶分析,表明其位点与已报道的adw亚型有很大的不同。     

禽流感病毒分离株NS基因同源性及等位基因类型分析

目的　克隆测定国内具有代表性的禽流感病毒 (AIV)的非结构 (NS)蛋白基因核苷酸序列 ,分析其同源性和等位基因类型 ,为进一步探索禽流感NS蛋白抗体监测方法奠定基础。方法　经RT PCR扩增了国内 3株H9N2、2株H5N1、2株H7N2亚型AIV分离株的NS蛋白基因 ,并把扩增的基因片段克隆到pGEM T载体中测序 ,将测序结果与GenBank中的核苷酸序列进行同源性比较 ,绘制基因进化树。结果　经测序获得了各AIV分离株NS基因的完整编码序列。同源性分析表明 ,3株H9亚型AIV的NS基因之间的同源性为 96 %～ 98% ;两株H5亚型AIVNS基因同源性为 91 6 % ;两株H7亚型AIV的NS基因同源性为 98 9%。H5和H9亚型分离株的NS基因之间的同源性均高于 90 % ;而H7N2亚型分离株与其它两种亚型分离株的NS基因同源性约为 6 0 %～ 70 %。在AIVNS基因系统发育进化树中 ,H5、H9亚型分离株都处于等位基因A群内 ;3株H9亚型分离株的进化关系较近 ,与香港、广东的部分H5N1病毒株起源相同 ,而 2株H5病毒的NS基因则处于不同分枝内 ;2株H7亚型分离株的NS基因都处于等位基因B群内 ,进化关系较近。结论　这 7株国内AIV分离株的NS基因之间的同源性差异较大 ,约为 6 0 %～ 99% ,且包括A、B两种类型的等位基因     

内切葡聚糖酶产生菌的分离、筛选和识别

采用6种培养基对淡水水库、反刍动物粪便和植物组织共3种环境来源的110份样品进行微生物纯培养物的分离、培养,获得414株细菌纯培养物,其中171株来源于淡水水库环境,70株来源于反刍动物粪便,173株来源于植物内生环境.以羟甲基纤维素钠(CMC-Na)作为唯一碳源对新分离菌株进行内切葡聚糖酶活性筛选,在活性初筛中获得阳性菌197株,复筛验证确认149株为内切葡聚糖酶产生菌.通过16S rRNA基因序列分析初步确定了具内切葡聚糖酶活性菌株的分类学信息,其中64株产酶活性菌株来源于淡水水库环境,归属于10个科的11个属,19株活性菌株来源于反刍动物粪便,归属于10个科的10个属,66株活性菌株来源于植物内生环境,归属于16个科的19个属.实验表明在纤维素储备丰富的自然环境中,具内切葡聚糖酶活性的细菌资源丰富多样,值得进一步深入研究.     

小克银汉霉核糖体DNA PCR扩增产物的限制性片段长度多型性

应用一对寡核苷酸引物ITSl与ITS4对核DNA G+C百分数小于30％的小克银汉霉(Cunninghamella)属的核糖体DNA(rDNA)内转录间区(ITS)进行了扩增。测试的属于10个种和变种的22株菌都得到了扩增产物。在同属不同种之间扩增的ITS片段长度有巨大差别。据此可分为三组。这三组所含分类群数及其DNA长度分别为：第一组4种1变种,小于 764碱基对(bp);第二组2种,765～824 bp;第三组2种l变种,大于825 bp。所研究的许多种中,特别是第三组,单凭其PCR产物的长度就能区分开来。但在第一、二组就需借助限制性内切酶的分析才能予以区分。我们选用了Rsa I,Tru 9 I,和Hinf I 4种限制性内切酶,对所有扩增产物进行了限制性片段长度多型性(RFLPs)的分析。在雅致小克银汉霉(C elegans),巴西玉蕊小克银汉霉(C.bertholletiae)、和布拉氏霉(C. blakesleeana )各种的限制性酶切图谱,种内非常一致而种与种之间有差别。反之,在某些种其限制性酶切图谱不仅种间互不相同,在种内不同株之间也出现1～3种酶切图型的差异。在这种情况下,只能综合各种资料才能将它们区分开来。本研究肯定了PCR-RFLP在区分小克银汉霉种和变种上的意义,并发现种内个体的差异。这在我们后来所进行的序列分析研究中得到了进一步的证实。     

中国淡水共球藻纲新记录属种——土佐牧野藻(Makinoella tosaensis Okada)

报道分别从湖北省武汉市内和云南省西双版纳小水池中分离培养的两株绿藻,对其进行了形态和18S r DNA基因序列分析,编号分别为FACHB-1783和FACHB-1784。这两株绿藻具独特的四边形群体形态,通常为4或16个细胞,细胞为宽椭圆形至不规则卵圆形、细胞壁两端无增厚,叶绿体多数、片状,具蛋白核。结合形态和分子系统发育分析,确定这两株绿藻为我国1种淡水共球藻纲新记录属种——土佐牧野藻(Makinoella tosaensis Okada)。基于18S r DNA基因的系统发育研究表明这两株绿藻与分离自韩国的土佐牧野藻基因序列相似度可达99.6%~99.9%,并且以较高的支持值与土佐牧野藻聚在一起。     

胆型螺旋杆菌（Helicobacter bilis）的分离、鉴定与序列分析

鉴定分离到的微需氧菌为螺旋杆菌,并对该菌进行分型。小鼠皮下或肌肉注射地塞米松使其免疫抑制,取小鼠肠内容物培养,对分离到的细菌,经油镜、电镜观察。然后提取细菌DNA,用根据螺旋杆菌（Helicobacter sp．）rRNA保守区设计的引物P7/P8进行扩增,并对扩增产物分别用MboI、HhaI、XspI内切酶酶切,酶切产物用10%PAGE分析。再用根据螺旋杆菌胆型（H. bilis）rRNA设计特异引物P7/Pb扩增,将扩增产物测序分析。最后,将该细菌在Scid小鼠上作动物感染。细菌在油镜下呈鸟翼状,电镜下观察到双极鞭毛,无周质纤毛。引物P7/P8扩增出374bp的特异带,此片段能分别被MboI、HhaI、Xsp内切酶酶切。引物P7/Pb扩增出364bp的条带,测得的DNA序列中存在MboI、HhaI、XspI的内切位点,与文献中H.bilis序列比较,同源性为97.5%。动物感染试验符合Koch准则。分离到的细菌确为胆型螺旋杆菌。     

大白口蘑分离菌株的DNA鉴定

以松口蘑Tricholoma matsutake子实体为外类群,对大白口蘑T. giganteum 野生子实体及其组织分离菌丝进行ITS序列测序,通过DNAStar软件进行比较分析。结果表明大白口蘑ITS序列长度为589bp,松口蘑ITS序列长度为601bp,ITS1和ITS2呈现不同程度的种间多态性;ITS序列测定证实了大白口蘑野生子实体及其组织分离菌丝的同质性,并且ITS区序列在大白口蘑种内不同菌株间的变异程度很小,表明使用通用引物ITS4和ITS5,通过PCR扩增测序即可用于大白口蘑的种质鉴定。     

大白口蘑分离菌株的DNA鉴定

以松口蘑Tricholoma matsutake子实体为外类群,对大白口蘑T.giganteum野生子实体及其组织分离菌丝进行ITS序列测序,通过DNAStar软件进行比较分析。结果表明大白口蘑ITS序列长度为589bp,松口蘑ITS序列长度为601bp,ITS1和ITS2呈现不同程度的种间多态性;ITS序列测定证实了大白口蘑野生子实体及其组织分离菌丝的同质性,并且ITS区序列在大白口蘑种内不同菌株间的变异程度很小,表明使用通用引物ITS4和ITS5,通过PCR扩增测序即可用于大白口蘑的种质鉴定。     

四川松茸内生细菌群落结构与多样性

为了解松茸的内生细菌群落结构与多样性,以采自四川7个松茸主产区的14个松茸样品为材料,通过变性梯度凝胶电泳(DGGE)分析其内生细菌的群落结构与多样性差异.结果表明： 各个产区松茸样品的内生细菌群落结构与多样性存在明显差异.但采自相近地点、相似环境的松茸样品内生细菌群落结构相似性较高;样品的丰度范围为15～25,多样性指数依次为盐源＞冕宁＞会东＞木里＞雅江＞盐边＞小金;条带回收测序构建的系统发育树显示,松茸内生细菌种群丰富,各个产区松茸优势种群存在一定的差异,但假单胞菌属、爱文菌属、芽孢杆菌属在所有样品中均有分布,而且都占据一定的优势地位.产碱杆菌属与鞘氨醇杆菌属在大部分样品中为优势种群;而杜擀氏菌属、赖氨酸芽孢杆菌属在特定样品中为优势种群.表明松茸内生细菌具有丰富的多样性,研究结果可为筛选促进松茸生长的内生菌提供依据.     

松口蘑与假松口蘑ITS序列测定和分析比较

对松口蘑和假松口蘑进行ITS序列测序,通过DNAStar软件比较分析,发现松口蘑与假松口蘑的5.8SrDNA序列完全一致,ITS1和ITS2呈现不同程度的多态性。松口蘑ITS序列长度为601bp,假松口蘑ITS序列长度为563bp。设计了扩增松口蘑和假松口蘑ITS1的特异性引物,能够快速地区别松口蘑与假松口蘑。     

Development of microsatellite markers from an ectomycorrhizal fungus, <Emphasis Type="Italic">Tricholoma matsutake</Emphasis>, by an ISSR-suppression-PCR method

An inter-simple sequence repeat (ISSR)-suppression-PCR technique established to develop microsatellite markers of plant species was applied to an ectomycorrhizal fungus, Tricholoma matsutake. Six polymorphic SSR markers were developed. All six polymorphic SSR markers were single-locused and co-dominant. Alleles produced by these six single-locused markers ranged from two to nine per locus and the expected heterozygosities were calculated as values from 0.098 to 0.803. The results indicated that the ISSR-suppression-PCR technique was effective and applicable to the development of microsatellite markers from ectomycorrhizal fungi. Furthermore, the six microsatellite loci did not amplify DNA from any other ectomycorrhizal species investigated, except for Tricholoma nauseosum (Swedish matsutake) and Tricholoma fulvocastaneum, suggesting that population genetics and reproduction of T. matsutake could be investigated by the SSR markers developed in the present study.     

松口蘑复合种形态学及生物地理学研究

松口蘑复合种含有松口蘑Tricholoma matsutake (也称松茸)、北欧口蘑T. nauseosum、喜栎口蘑T. zangii和美洲口蘑T. magnivelare等4个分类单元。在对来自中国、日本、法国、西班牙、瑞典、芬兰和美国的标本进行形态学研究的基础上,认为松口蘑、北欧口蘑、喜栎口蘑形态十分接近,它们的分类地位应该重新考虑。美洲口蘑和它们的差别也不大。对松口蘑复合种的寄主和地理分布也进行了总结,发现松口蘑和美洲口蘑的寄主范围较广,寄主专化性不强,而北欧口蘑和喜栎口蘑的寄主比较专一。在地理分布上,松口蘑和美洲口蘑形成亚洲—北美地理替代种的分布格局;松口蘑和北欧口蘑形成欧亚间断分布的分布格局;喜栎口蘑的地理分布范围完全包含在松口蘑的分布范围中。松口蘑复合种种类的分布区和它们各自寄主的分布不一定完全相同。在松口蘑复合种内,北欧口蘑和松口蘑已被认为是同一个种,而其余两个分类单元的分类地位值得进一步研究。     

松口蘑菌丝体的分离和RAPD-PCR分析

针对松口蘑 [Tricholomamatsutake(S .ItoetImai)Sing .]菌丝体分离培养困难和各种相关分离物目前难以用出菇试验鉴定的现实 ,采用 8种培养基配方 ,对 9个不同来源的松口蘑子实体的不同部位及菌根、菌土进行组织分离 ,计接种试管 81 0多支 ,结果从菌褶部位获得 94支慢生型的菌丝体分离菌株 ,从菌柄部位仅获得 1支快生型的菌丝体分离菌株。以马铃薯葡萄糖土壤滤液培养基 (PDAS)、马铃薯葡萄糖麦麸滤液培养基 (PDAW )、BM培养基、马铃薯葡萄糖琼脂培养基 (PDA)对菌褶进行组织分离 ,获慢生型菌丝体的成功率依次为 74.4%、35.5%、156%和 8.9%。以各分离菌株的来源松口蘑子实体和中日两国松口蘑研究者提供的分离菌株作为DNA参照样品 ,对从供试子实体、菌根、菌土进行组织分离获得的各种相关纯培养物进行亲菌鉴定。采用筛选的 1 7个随机引物介导 2 5个供试松口蘑子实体及其分离菌体的RAPD(RandomAmplifiedPolymorphicDNA) PCR反应 ,全部获得了清晰而稳定的DNA指纹图谱 ,结果一致表明 :每个松口蘑子实体的菌盖 (含菌褶…     

marY2N, a LINE-like non-long terminal repeat (non-LTR) retroelement from the ectomycorrhizal homobasidiomycete Tricholoma matsutake.

A LINE-like non-LTR retroelement designated marY2N was cloned from the ectomycorrhizal homobasidiomycete Tricholoma matsutake. marY2N has open reading frames that correspond to gag and pol, and a putative promoter and consensus sequences common to those of the mutators from fruit flies. While it is common to T. matsutake and Tricholoma magnivelare, marY2N does not reside in any other species of Tricholoma tested.