阿司咪唑对宫颈癌细胞HeLa自噬的影响

该研究利用蛋白质免疫印迹法(Western blot)、稳定表达m Cherry-EGFP-LC3B(microtubuleassociated proteins 1A/1B light chain 3B,LC3)自噬双标荧光细胞、mt-Keima荧光探针活细胞扫描技术在人宫颈癌细胞He La中检测了多种自噬相关标志物,探究了阿司咪唑(astemizole,AST)对He La细胞自噬的影响。结果表明,阿司咪唑在He La细胞中引起自噬标志蛋白质LC3-II与SQSTM1/p62的显著累积,并存在剂量和时间依赖性效应;阿司咪唑导致He La细胞存活率显著降低;用自噬抑制剂Bafilomycin A1(Baf-A1)阻断自噬流(autophagic flux)后,再加入阿司咪唑不能促进LC3-II进一步累积;阿司咪唑处理细胞后自噬体与自噬溶酶体的数量均显著增加;此外,阿司咪唑显著抑制了线粒体氧化磷酸化解偶联剂羰基氰化物间氯苯腙(carbonyl cyanide 3-chlorophenylhydrazone,CCCP)导致的线粒体标志蛋白质TOMM20(translocase of outer mitochondrial membrane 20)的降解,其线粒体自噬水平显著低于对照组。以上结果证明了阿司咪唑有抑制自噬流的作用,导致损伤的线粒体不能被顺利降解,并且提示该作用可能是通过抑制溶酶体功能实现的。     

NADPH氧化酶参与AtTOR调控盐胁迫诱导自噬机制的研究

盐胁迫严重限制着植物的生长发育,造成农业产量下降。植物遭受盐胁迫时,细胞代谢受到抑制,体内会积累较多活性氧(ROS)进而对植物造成氧化胁迫,诱导自噬现象的产生。本文主要研究了植物对于盐胁迫诱导的自噬及其反应的调控机制。研究中发现,在高盐浓度处理的拟南芥幼苗中自噬现象迅速产生,伴随着NADPH氧化酶活性的明显上升。此外,通过用荧光探针Lyso Tracker Red(LTR)定位自噬小体,激光共聚焦观察发现At TOR不仅可以在正常生理环境下抑制自噬小体的生成,而且可以在高盐浓度胁迫环境下抑制自噬。进而我们发现在高盐浓度处理的同时添加NADPH氧化酶抑制剂DPI后,处理过后的WT株系拟南芥根细胞自噬现象受到明显抑制,而At TOR突变体中并未有明显的变化。因此NADPH氧化酶很有可能参与At TOR对盐胁迫诱导自噬的信号通路的调控。该研究结果为进一步分析植物耐受性机理和自噬的信号通路提供理论依据。     

低温对桂花‘状元红’叶肉细胞超微结构的影响

为探讨北引桂花(Osmanthus fragrans)在低温胁迫下叶肉细胞超微结构的变化,揭示桂花于低温胁迫下细胞结构变化规律,该研究以3年生桂花品种‘状元红’(O.fragrans‘Zhuangyuan Hong’)为试材,分别于一系列低温下处理,经制样切片后,用透射电子显微镜观察叶肉细胞超微结构的变化。结果表明:常温(20~25°C)处理时,各细胞器超微结构正常;5°C低温处理时,叶绿体有轻微膨大现象,线粒体结构正常;0°C处理时叶绿体内嗜锇体增多,叶绿体肿胀加剧,线粒体数量增加,淀粉粒出现亮暗相间的轮纹;–10°C处理时,细胞器降解。在同一低温胁迫下不同细胞的叶绿体敏感程度不同,这为遭受低温后植株的恢复生长提供了细胞学基础。叶肉细胞中叶绿体、线粒体、细胞核的稳定性可作为桂花对低温响应的重要参考指标。     

线粒体自噬在缺氧条件下适应机制的研究进展

由于线粒体能敏感地感受机体内氧浓度的变化,缺氧时会影响线粒体氧化磷酸化过程中电子传递链的正常功能,抑制ATP生成,产生大量活性氧(ROS)。ROS蓄积导致氧化损伤细胞内脂质、DNA和蛋白质等大分子物质,线粒体肿胀,通透性转换孔开放,释放细胞色素C等促凋亡因子,最终严重影响细胞的存活。因此这些功能异常或受损线粒体是缺氧应激状态下细胞是否存活的危险因素,及时清除这些线粒体,对维持线粒体质量、数量及细胞稳态具有重要意义。线粒体自噬是近年来发现的细胞适应缺氧的一种防御性代谢过程,它通过自噬途径选择性清除损伤、衰老和过量产生ROS的线粒体,促进线粒体更新和循环利用,确保细胞内线粒体功能稳定,保护缺氧应激下细胞的正常生长发挥重要的调节作用。本文就线粒体自噬在缺氧条件下发生过程、参与相关蛋白及调节机制等方面研究进行了综述。     

重组骆驼蓬脂转移蛋白对宫颈癌HeLa细胞化疗的增敏作用

[目的]研究重组骆驼蓬脂转移蛋白(recombinant Peganum harmala lipid transfer protein,r Ph LTP)与顺铂(DDP)协同对宫颈癌He La细胞的抑制作用及可能的作用机制。[方法]四甲基偶氮咗蓝(MTT)法检测He La细胞生长的抑制率;Annexin-V/PI双染法检测细胞凋亡率,流式细胞术检测细胞内活性氧(ROS)的变化情况。[结果]r Ph LTP与DDP联合应用后与相应的DDP组相比,对细胞生长的抑制率显著增强(P0.01),低浓度r Ph LTP联合2.5μg/m L顺铂对He La细胞的抑制率为(42.50±0.059)%,远高于高浓度顺铂(10μg/m L)对He La细胞的抑制率(36.88±0.134)%,细胞的凋亡率显著增加(P0.01),细胞内ROS极明显升高(P0.001)。[结论]r Ph LTP能够显著增强顺铂对He La细胞的化疗敏感性(P0.001),这种作用可能与r Ph LTP增强顺铂诱导细胞内活性氧的产生导致细胞凋亡有关。     

水解南珠液抑制细胞自噬减轻人微血管内皮细胞氧化损伤

[目的]以人微血管内皮细胞(human microvascular endothelial cell-1,HMEC-1)为研究对象,采用H2O2诱导内皮细胞氧化应激,探讨南珠水解液对HMEC-1细胞氧化损伤的保护作用及机制。[方法]采用生化检验法检测南珠水解液作用后,HMEC-1细胞内超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase,SOD)和谷胱甘肽过氧化物酶(Glutathione Peroxidase,GSH-PX)活性及丙二醛(Malondialdehyde,MDA)含量变化;采用流式细胞仪检测细胞内活性氧(Reactive Oxygen,ROS)含量变化;采用透射电镜观察自噬体;采用免疫荧光实验检测细胞微管相关蛋白轻链3Ⅰ/Ⅱ(Microtubuleassociated protein light chainⅠ/Ⅱ,LC3Ⅰ/Ⅱ)表达变化。[结果]与氧化损伤组相比,不同浓度南珠水解处理组SOD活性显著增加,分别提高8.68%、24.99%和49.43%; GSH-PX活性无显著变化; MDA显著降低,分别降低36.99%、35.82%和60.25%;且给药组细胞内ROS含量相比氧化损伤模型组显著降低,分别降低5.18%、15.55%和32%;透射电镜结果显示对照组细胞内无明显自噬小体,氧化损伤组可见明显的双层膜结构的自噬小体,用不同浓度南珠水解液处理后,随着浓度的增加自噬小体含量显著减少;免疫荧光实验结果显示,与氧化损伤组相比,南珠水解液组LC3-Ⅰ/LC3-Ⅱ蛋白比值显著降低,分别降低19.21%、29.76%和33.71%。[结论]南珠水解液对氧化损伤的HMEC-1细胞有一定的修复作用,这种作用可能是通过抑制细胞自噬,并促进SOD活性水平提升,降低MDA和ROS含量,从而减轻H2O2诱导的HMEC-1细胞氧化损伤。     

雷公藤甲素诱导HeLa细胞p53依赖的自噬和凋亡

自噬与凋亡被认为是细胞程序性死亡的两种重要途径,二者的交互联系对阐明药物的抗肿瘤机理有重要价值.众多的研究表明,雷公藤甲素对多种肿瘤细胞都具有显著的抑制作用.细胞凋亡与自噬可被相同的因素所诱导,p53蛋白可以同时对二者起调控作用,在自噬与凋亡的交互作用(crosstalk)中扮演着重要角色.本文以He La细胞为模型,研究雷公藤甲素诱导He La细胞发生自噬和凋亡的机制,并通过抑制p53依赖的转录,研究雷公藤甲素诱导He La细胞p53依赖的自噬和凋亡交互联系.     

镉胁迫对拟南芥的毒害作用及自噬现象的观测

镉离子(Cd2+)具有强植物毒性,可抑制植物生长,甚至导致植物死亡。为了研究重金属镉对拟南芥的毒害作用,采用叶绿素荧光技术、流式细胞技术、激光共聚焦技术及半定量RT-PCR技术,检测光合参数的变化、活性氧(reactive oxygen species,ROS)的累积、自噬的发生,以及病原相关蛋白(pathogenesis-related protein,PR)基因表达的变化。实验结果显示,随着50μmol/L CdCl2处理时间的延长,ROS和Cd2+在细胞中大量积累。而在镉胁迫的初期,会观察到自噬的发生及PR基因表达的变化。说明植物受到外界Cd2+作用的初期,会通过自噬及增强PR基因表达来抵抗外界胁迫。但随着处理时间的延长,植物细胞内累积了大量的ROS和Cd2+,当植物不足以通过自噬途径抵抗胁迫时,就会导致生长受阻,最终对光合系统造成损伤。     

花旗松素通过激活Nrf2/HO-1/HIF1α/Autophagy信号通路对H_2O_2所致H9C2细胞氧化应激保护作用的研究

氧化应激(oxidative stress,OS)是缺血性心肌病(ischemic cardiomyopathy,ICM)的主要发病机制之一,抗氧化应激损伤是防治缺血性心肌病的关键。为了探讨花旗松素(taxifolin,tax)对过氧化氢(hydrogen peroxide,H_2O_2)诱导的大鼠心肌细胞H9C2氧化应激的影响及其可能的分子机制,将培养的H9C2心肌细胞随机分为对照组(Control)、氧化应激组(H_2O_2)、tax预处理组(tax+H_2O_2)、tax单独处理组(tax)。通过观察细胞形态的改变,检测细胞内活性氧(reactive oxygen species,ROS)和丙二醛(malondialdehyde,MDA)的生成、自噬体自噬泡的形成,以及自噬(autophagy)相关蛋白质LC3 I/II、p62的表达,验证tax对氧化应激及自噬的影响。同时,通过检测Nrf2、HO-1、HIF1α的表达,研究可能存在的分子机制。研究发现tax可缓解H_2O_2诱导的H9C2细胞氧化应激,表现为细胞肥大形态缓解、ROS生成降低、MDA产生减少,而且Nrf2/HO-1/HIF1α蛋白的表达升高,自噬水平升高。实验结果表明:tax可能通过激活Nrf2/HO-1/HIF1α/Autophagy信号通路促进自噬及抗氧化应激,从而发挥心肌保护作用。     

LC3脂质化修饰的机制和功能研究进展

LC3(包括LC3/GABARAP蛋白家族所有成员)的脂质化修饰是细胞自噬过程中的关键事件. LC3完成脂质化修饰后,由水溶性形式转化为膜结合形式,在自噬小体的形成、自噬底物的招募和自噬小体-溶酶体融合等阶段均发挥重要作用.包括营养状态和病原菌入侵在内的多种细胞内外刺激信号均可参与调控LC3的脂质化修饰过程.近年来的研究发现,脂质化的LC3不仅可以靶向细胞内双层膜的自噬小体,也可以靶向细胞内多种单层膜结构,如吞噬体和溶酶体等,参与调控细胞的内吞和微自噬等生物学过程.本文将围绕LC3脂质化修饰的机制和功能综述近年来的相关研究进展.     

乙肝病毒感染对细胞基本自噬的影响

【目的】慢性乙肝病毒(Hepatitis B virus,HBV)感染在肝硬化和肝癌的发生过程中起着重要的作用,通过研究HBV感染对细胞基本自噬的影响,为HBV感染诱发肝癌以及HBV的免疫逃逸机理研究提供新的思路。【方法】本研究利用乙肝病毒表达质粒瞬时或稳定转染不同肝细胞,通过计数绿色荧光蛋白(greenfluorescent protein,GFP)聚集数目检测自噬小体形成,western blot检测LC3(microtubule-associated proteinlight chain 3,微管相关蛋白质轻链3)脂酰化和p62的降解,通过构建HBV B型和C型X蛋白(HBx)的表达质粒并瞬时转染肝癌细胞和正常肝细胞,对不同基因型X蛋白对细胞自噬的影响进行了分析。【结果】乙肝病毒感染后促进了LC3的脂酰化和p62的降解,增加了自噬小体的形成,增强了细胞的基本自噬。进一步研究发现,HBV感染增强的细胞基本自噬水平由HBx所引发,且C型HBx比B型对细胞基本自噬的增加更加显著。【结论】HBV通过HBx增强细胞的基本自噬,且不同基因型HBx对细胞基本自噬的增强程度不同,为进一步阐明HBV感染机理奠定了基础。     

参与细胞自噬的蛋白质的翻译后修饰

细胞自噬是进化上高度保守的细胞分解代谢途径. 在代谢应激下激活,产生双层膜结构的自噬小体,将胞浆内受损细胞器和蛋白质包裹、转运至溶酶体降解,维持细胞内环境平衡,是一种典型的细胞质量控制机制.目前,经典自噬通路中的主要蛋白质已经明确.但代谢应激信号的输入引起这些蛋白质怎样的活性和功能变化,这些变化对自噬产生怎样的影响,却是知之甚少.本文从翻译后修饰角度对代谢应激状态下自噬过程中相关蛋白质的调节进行综述,有助于深入了解自噬过程.     

Pravastatin激活自噬抑制糖皮质激素引起的髓核细胞凋亡

地塞米松注射可以缓解椎间盘退变引起的腰痛症状,但是具有一定的副作用。普伐他汀(Pravastatin)被发现可以缓解骨关节炎的炎症和症状,但是其对髓核细胞及椎间盘退变的作用及其机制尚不清楚。该文培养SD大鼠原代髓核细胞,用不同浓度地塞米松(dexamethasone,DXM)作用髓核细胞48 h后, DCFH-DA和MitoSOX Red染色分析细胞总活性氧(reactive oxygen species, ROS)和线粒体ROS水平, Annexin V/PI流式和DAPI染色分析细胞凋亡水平, N-acetyl-Lcysteine(NAC)抑制ROS水平。Western blot检测LC3-II、Beclin-1和P62等自噬相关蛋白质水平,ATG5 siRNA转染抑制自噬。结果显示,随着DXM处理浓度的增加,髓核细胞内总ROS和线粒体ROS水平及凋亡率升高(P0.05)。Pravastatin增加DXM处理下髓核细胞中LC3-II和Beclin-1蛋白质水平,降低P62蛋白质水平(P0.05)。Pravastatin可以抑制DXM诱导的髓核细胞中的ROS产生和细胞凋亡,而ATG5 siRNA抑制自噬后,显著逆转Pravastatin对细胞的保护作用(P0.05)。该研究结果提示, Pravastatin可能通过激活髓核细胞自噬抑制DXM诱导的ROS产生从而减少细胞凋亡。     

EGFP-LC3稳定细胞系的建立及对Aβ自噬效应的研究

该文建立了稳定表达EGFP-LC3的HEK293细胞系,以10μmol/L的Aβ肽及其不同疏水性氨基酸含量的截短形式处理细胞24 h,计数LC3的荧光斑点数;Western blot检测LC3B表达量的变化;MTT检测特定Aβ诱导细胞自噬后对细胞活性的差异;用透射电镜确认自噬体的细胞超微结构。结果显示,G418(700μg/m L)筛选6周后,建立了稳定表达EGFP-LC3的HEK293细胞系;Aβ25-35、Aβ40和Aβ42诱导细胞内LC3荧光斑点的效果较明显;Western blot结果显示LC3B的酯化,即LC3BI向LC3BII转变;MTT检测发现,与Aβ40相比,Aβ42处理后伴随自噬的细胞毒性更强;电镜可以见到Aβ诱导的自噬小体。提示,Aβ肽及其截短的疏水性片段均可诱导自噬,且诱导自噬的效果与疏水性氨基酸含量无关;同时,Aβ42细胞损伤强于Aβ40。该研究为进一步探讨AD自噬机制提供了实验基础。     

自噬抑制剂3-MA上调H2O2损伤的PC12细胞氧化应激水平

为探究自噬抑制剂6-氨基-3-甲基腺嘌呤（3-methyladenine,3-MA）对损伤细胞氧化应激水平的影响,将3-MA作用于H2O2诱导的PC12细胞损伤模型,以自噬增强剂雷帕霉素（rapamycin,Rap）作为对照,探讨自噬与氧化应激的关系。测定线粒体的膜电位和细胞内的活性氧（reactive oxygen species, ROS）与丙二醛(malondialdehyde, MDA)含量,以及超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)和过氧化氢酶(catalase,CAT)活性,评价损伤细胞的氧化应激状态。单丹(磺)酰戊二胺（monodansylcadaverine,MDC）染色,观察损伤细胞的自噬情况。蛋白质印迹分析损伤细胞中的自噬相关蛋白质LC3-II/LC3-I比值变化。实验结果显示：与正常组相比,H2O2损伤细胞的ROS水平上升到正常组的141%,MDA含量增加(P<0.001);CAT与SOD酶活力显著降低(P<0.001),差异均有统计学意义,证明损伤细胞氧化应激水平增加;MDC染色结果表明,H2O2组自噬明显增加。Western印迹结果表明,LC3-II/LC3-I值显著升高（P<0.05）;与损伤组相比,3-MA组MDC染色结果表明,自噬水平降低。Western印迹结果表明,LC3-II/LC3-I值下降;细胞内ROS水平升高,增加到正常组的208%。MDA含量增加(P<0.001),CAT、SOD酶活力降低(P<0.001)。综上结果表明,自噬抑制剂可增加H2O2诱导的PC12细胞损伤模型的氧化应激水平,增加细胞凋亡。     

厨房油烟引起AL细胞遗传损伤和胞内自由基形成

为了解厨房油烟(cooking oil fumes,COF)对细胞的危害及其遗传毒性机制,以A细胞为实验模型,对细胞活力水平、细胞基因突变率、细胞非巯基蛋白化合物水平(NPSH)以及细胞内活性氧(ROS)产生的变化规律进行了研究。实验发现：用厨房油烟(COF)处理后,A细胞的活力下降,细胞CD59基因的突变率随着处理浓度的增加而增加,NPSH水平随着处理浓度的增加而降低,且存在一定的剂量一效应关系。检测胞内产生的ROS,发现400μg／ml COF处理30min后,细胞内ROS含量高于对照3倍多。实验结果表明：COF可引起细胞氧化胁迫,诱导哺乳动物细胞基因突变。     

基于网络药理学和实验验证探讨黄芪散治疗阿尔茨海默病的作用机制CSCD

运用网络药理学方法探讨黄芪散治疗阿尔茨海默病(Alzheimer′s disease,AD)的作用机制。通过TCMSP数据库检索黄芪散的有效成分及相关靶点;采用DisGeNET和GeneCards数据库搜集AD靶点,通过String在线数据库构建靶蛋白相互作用网络,采用R语言对关键靶点进行GO和KEGG富集分析。采用Aβ25-35诱导PC12细胞损伤作为AD细胞模型,通过MTT法检测细胞存活率,采用显微镜观察细胞形态和突触生长,通过透射电镜观察PC12细胞自噬小体,利用试剂盒检测活性氧(reactive oxygen species,ROS)含量;最后采用ELISA法和Western blot实验对网络药理学主要预测的生物过程与信号通路进行验证。结果共获得黄芪散44个有效成分,对应靶点134个,与AD相关靶点共102个,KEGG相关信号通路前20条,GO分析前20个生物学过程。细胞实验证实了黄芪散能有效增加PC12细胞的存活率和突触长度,有效促进Aβ_(25-35)诱导的PC12细胞自噬小体包裹受损线粒体,降低其炎症因子IL-1β、IL-18、TNF-α的含量,降低ROS水平,升高LC3Ⅱ/Ⅰ比值,上调PINK1、parkin、BDNF蛋白表达,下调p62、NLRP3蛋白表达。黄芪散可能是通过激活PINK1/parkin通路促进线粒体自噬,降低ROS水平进而抑制NLRP3炎症小体的活化和改善突触可塑性而发挥治疗AD作用。     

高盐低温胁迫下水稻叶细胞ROS清除系统的相关基因表达

采用Affymetrix水稻表达谱芯片,分析高盐和低温胁迫下水稻叶细胞内ROS清除系统的相关基因表达状况,探讨在响应非生物胁迫过程中水稻植株体内抗氧化防卫体系的积极作用。结果表明:(1)水稻叶细胞内ROS清除系统涉及187个基因和/或EST,由抗氧化的非酶类物质如抗坏血酸、谷胱甘肽、生育酚等和抗氧化酶如超氧化物歧化酶(SOD)、抗坏血酸过氧化物酶(APX)、过氧化氢酶(CAT)等组成。(2)在低温逆境下,籼稻(i-93-11)叶细胞表达上调基因(2倍以上,下同)有5个,下调(0.5倍以下,下同)基因有2个;粳稻(j-NJ-1)叶细胞表达上调基因5个,下调基因6个。(3)在高盐胁迫下,籼稻(i-93-11)叶细胞表达上调基因有31个、下调基因13个;粳稻(j-NJ-1)叶细胞表达上调基因27个,下调基因25个。(4)高盐和低温胁迫下水稻叶细胞ROS清除系统相关基因的表达在籼粳稻间存在较大差异,并根据水稻基因表达谱芯片数据构建了水稻响应高盐和低温胁迫ROS清除网络图。     

细胞病变型牛病毒性腹泻病毒对宿主细胞自噬作用的研究

细胞自噬(Autophagy)是一种真核生物细胞内损伤的细胞器和长寿命蛋白通过双层膜结构的自噬小泡包裹后,送入溶酶体或液泡中进行降解并得以循环利用的高度保守的分解代谢过程。本研究旨在了解细胞病变型(CEP)牛病毒性腹泻病毒(BVDV NM)对宿主细胞MDBK细胞自噬作用的影响。实验使用BVDV NM株感染宿主细胞MDBK,在不同时间点分别通过透射电镜观察自噬体形成、报告荧光GFP-LC3自噬底物检测以及Western blot方法鉴定细胞自噬标记物LC3-Ⅰ/LC3-Ⅱ和P62的表达等试验方法对自噬进行检测。结果显示,感染BVDV NM株的MDBK细胞出现了明显的细胞病变;透射电镜能观察到细胞中存在大量的双层膜结构的自噬泡;转染GFP-LC3荧光质粒后,在感染病毒的细胞内出现增多的聚集绿色荧光自噬小体;此外,随着BVDV NM株感染MDBK时间的延长可以发现LC3-Ⅰ/Ⅱ蛋白的量逐渐增加以及P62蛋白的降解。试验表明BVDV NM株感染MDBK可以促进细胞自噬的发生。     

人Dcp1a基因真核表达载体的构建及其在HeLa细胞中的定位

人脱帽酶Dcp1a(human m RNA decapping enzyme 1a)是m RNA降解过程中的重要成员之一,构建其真核表达载体,并对其表达和细胞内定位进行分析,可为进一步研究Dcp1a的功能提供基础。本研究以He La c DNA文库为模板,采用PCR方法扩增Dcp1a c DNA全长序列并克隆到pm Cherry-N1载体。转化大肠杆菌DH5α后,挑取阳性克隆提取质粒,分别进行Xho I/Sal I双酶切及测序鉴定。将重组质粒用Vigo Fect转染试剂转染He La细胞,随后用RT-PCR和Western-blot检测Dcp1a在He La细胞中的表达,并采用激光共聚焦显微镜观察Dcp1a的亚细胞定位情况。通过DNA测序分析证实目的基因Dcp1a的序列完全正确,人Dcp1a基因真核表达载体pm Cherry-N1-Dcp1a构建成功,并在He La细胞中获得表达;激光共聚焦显微镜观察显示Dcp1a蛋白定位在细胞质中,而且He La细胞中过表达Dcp1a在胞质中明显形成了P小体(processing body,P-body)。实验结果为进一步探讨该基因的功能及其与P小体的相关性奠定了基础。