Myostatin通过Smad3下调MyoD的表达来抑制骨骼肌卫星细胞的分化

Myostatin基因,是肌肉生长的负调控因子,通过下调MyoD的表达抑制骨骼肌细胞的分化,但具体机制目前尚未完全清楚。本研究以体外培养的猪骨骼肌卫星细胞为实验材料,利用RNAi 技术,以Smad3为靶基因进行干扰研究,研究干扰前后猪骨骼肌卫星细胞增殖情况的变化以及MyoD、Myostatin基因的表达规律,进一步阐述三个基因间的调控关系。结果表明,Myostatin通过下调MyoD的表达,抑制骨骼肌卫星细胞的分化,但这种抑制作用是受Smad3调节的。     

EGR1基因在牛骨骼肌卫星细胞分化不同时期的表达及定位

目的:研究EGR1基因在牛骨骼肌卫星细胞(MDSCs)分化过程的表达、定位及入核机制。方法:以牛的MDSCs为实验材料,在分化培养基中分别分化培养1 d、3 d和5 d,每组3个重复,检测不同分化时间的MDSCs中EGR1基因的表达和EGR1蛋白的定位情况;采用 CRISPRi方法干扰内源EGR1的表达,结合定点突变和激光共聚焦方法初步探索了EGR1蛋白入核的机制。结果:qRT-PCR和Western blot检测结果显示随着分化时间的进行,EGR1 基因在转录水平和蛋白水平的表达都显著高于未分化的细胞,并随时间的延长而表达逐渐升高,分化第3日时表达量最高,随后开始下降。免疫荧光检测到EGR1蛋白主要在分化的MDSCs中表达,并随肌管数量增多而表达量增加。共聚焦结果显示随着细胞分化的进行,部分EGR1蛋白转移进入细胞核。定点突变EGR1蛋白S533A后,分化的MDSCs细胞核内没有检测到EGR1蛋白。结论:在牛骨骼肌卫星细胞分化过程中,EGR1基因转录表达水平升高,部分EGR1蛋白转移入细胞核,且EGR1蛋白C端第533位丝氨酸磷酸化是入核所必需的。     

巴什拜羊骨骼肌卫星细胞分离培养及诱导分化

为了获得巴什拜羊骨骼肌卫星细胞,本研究采集出生1日龄巴什拜羔羊后肢骨骼肌组织,采用两步酶消化法结合差速贴壁法分离纯化巴什拜羊骨骼肌卫星细胞,并对分离获得的骨骼肌卫星细胞进行了鉴定、传代培养及诱导分化等研究。结果表明,本研究采用的分离纯化方法可以高效获得巴什拜羊骨骼肌卫星细胞,RT-PCR检测结果表明骨骼肌卫星细胞标志性基因pax7、Myf5、MyoD、desmin和c-Met均呈阳性表达。获得的骨骼肌卫星细胞具有较强的增殖能力,连续传代12代,细胞的形态仍保持正常,且细胞的克隆形成率仍保持在50%以上,但是当细胞传代至第18代时,逐渐表现出较为明显的衰退。细胞的生长符合典型的"S"型生长曲线,且第2代和第8代细胞的生长曲线没有明显的差异,至第14代时细胞的增殖速度逐渐降低。采用低浓度马血清培养体系,可成功诱导巴什拜羊骨骼肌卫星细胞向肌管方向分化,诱导培养至第5天时,骨骼肌卫星细胞分化标志基因MyHC呈阳性表达。由此得出结论,本研究采用的骨骼肌卫星细胞分离纯化体系高效、可靠,可以满足较高纯度巴什拜羊骨骼肌卫星细胞的分离培养。     

EGCG通过抑制wnt/β-catenin信号通路调节猪骨骼肌卫星细胞的增殖和分化

为了阐明Wnt/β-catenin信号通路在猪骨骼肌卫星细胞增殖分化中的作用,利用Wnt/β-catenin信号通路抑制剂(-)-表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)处理猪骨骼肌卫星细胞,采用MTT、流式细胞术、免疫荧光和Western印迹等方法检测了细胞增殖和分化情况.结果显示,与对照组相比,EGCG以时间、浓度依赖方式抑制猪骨骼肌卫星细胞的增殖.流式细胞术检测细胞周期结果表明,与对照组相比,经EGCG处理后,猪骨骼肌卫星细胞的G1期细胞比例上升,而G2和S期细胞比例下降,这说明细胞被阻滞在G1期,细胞的增殖受到抑制.免疫荧光检测分化过程中MyHC的表达,与对照组相比,EGCG促进猪骨骼肌卫星细胞的分化,并降低增殖标志基因MyoD以及细胞周期蛋白D的表达量,而提高了分化标志基因MyoG和MyHC的表达量.在猪骨骼肌卫星细胞增殖分化过程中,EGCG降低β-联蛋白的表达量,且核内的β-联蛋白明显减少.结果表明,EGCG通过抑制Wnt/β-catenin信号通路抑制猪骨骼肌卫星细胞的增殖,促进其分化.     

lncRNA TCONS_00815878对猪骨骼肌卫星细胞分化的影响

猪骨骼肌发育是一个复杂的生物学过程,其中骨骼肌卫星细胞分化是影响骨骼肌发育的重要环节。近年来发现长链非编码RNA (long non-coding RNA, lncRNA)在骨骼肌卫星细胞分化中具有重要作用。为探究lncRNA TCONS_00815878对猪骨骼肌卫星细胞分化的影响,本研究利用qRT-PCR技术检测出生7 d内大白仔猪6种组织(心脏、脾脏、肺脏、肾脏、背肌和腿肌)及从胚胎期到出生后5个不同时间点(35 d、45 d、55 d胚胎及产后第7 d和第200 d后腿肌肉组织) TCONS_00815878的表达情况;利用反义核苷酸(antisense oligonucleotides, ASO)在猪骨骼肌卫星细胞中敲低TCONS_00815878,检验分化标记基因MyoD、MyoG和MyHC表达情况;通过生物信息学分析预测TCONS_00815878靶基因,并利用DAVID软件在线预测其靶基因的功能与通路。结果表明:TCONS_00815878在猪心肌和腿肌中高表达;仔猪出生后7 d内,TCONS_00815878在猪肌肉组织中表达量不断升高,第7 d达到高峰;在猪骨骼肌卫星细胞增殖和分化过程中,TCONS_00815878在分化期表达量不断上升,且在分化30 h表达量达到峰值;敲低TCONS_00815878后,MyoD、MyoG和MyHC基因表达量降低,其中MyoD表达量显著下降(P0.05)。此外,功能预测结果发现,其靶基因富集到糖酵解和丙酮酸代谢等与骨骼肌卫星细胞分化相关的多个生物学过程。本研究推测,lncRNA TCONS_00815878可能对猪骨骼肌卫星细胞的分化起促进作用。     

neuronatin shRNA真核表达载体的构建及其生物学功能

目的:获得能持续干扰neuronatin（nnat）基因表达的细胞,观察nnat基因沉默对神经细胞发育与分化的影响,为研究基因功能奠定基础。方法:构建含nnat基因短发夹RNA(shRNA)表达质粒,将质粒转染大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞PC12,RT-PCR方法筛选出最有效干扰质粒,稳定转染PC12细胞后观察细胞表型变化,免疫荧光检测nnat蛋白表达,NGF诱导观察nnat表达下调对细胞分化的影响。结果:成功构建并筛选出有效的靶向nnat基因的shRNA真核表达载体;载体稳定转染PC12细胞之后能特异性沉默nnat基因的表达,PC12细胞长出突起,向神经元方向分化,加入诱导因子NGF后能促进突起生长。结论:nnat可能是作为神经分化抑制因子在神经发育与成熟过程中发挥作用。     

IGF-1剪接变构体:力生长因子

力刺激与基因表达之间的联系是生理学研究中一个新的重要领域。从基因表达水平研究力学信号的影响有着特殊的重要意义,生物有机体的存在是基因表达的结果,而力在生命活动的整个过程发挥着作用。在骨骼肌中,力刺激诱导胰岛素样生长因子-1(IGF-1)发生选择性剪接,产生能够激活卫星细胞而使细胞增殖的力生长因子(mechano growth factor,MGF),以及能促使细胞分化而形成肌管的肌肉型IGF-1(IGF-1Ea),这两种自分泌的局部生长因子在肌肉修复与再生中起着重要作用。     

Mstn基因干扰通过上调基因Cpt1b促进肌间脂肪的β氧化

肌生长抑制素(myostatin,Mstn)也被称为生长/分化因子-8(GDF-8)。敲减或敲除Mstn基因可促进肌肉发育、降低脂肪含量。本研究利用RNA干扰技术制备Mstn干扰小鼠,随后对其骨骼肌形态、骨骼肌甘油三酯(triglyceride,TG)含量、脂肪酸组成及含量进行了分析。结果显示,与对照组相比,Mstn干扰小鼠肌肉中Mstn的表达减少。小鼠骨骼肌肌纤维的横截面积显著增大,而TG含量显著降低,n-3/n-6和不饱和/饱和脂肪酸比值显著升高。通过实时荧光定量PCR检测脂肪酸代谢相关基因的表达,结果表明脂肪酸分解和转运相关基因表达上调,而脂肪酸合成相关基因表达下调。在这些基因中,与β氧化相关的基因Cpt1b的上调尤为明显。对骨骼肌中CPT1的酶活性进行了检测,结果与基因表达情况一致。为探讨其进一步作用机理,通过染色质免疫沉淀实验发现,Mstn基因下游转录因子SMAD3可与Cpt1b基因的启动子直接结合。上述结果表明,Mstn敲减后主要通过调控其下游转录因子SMAD3与Cpt1b基因启动子的结合,上调Cpt1b的表达,从而促进肌内脂肪酸的β氧化代谢。     

p38对骨髓间充质干细胞成肌分化作用的研究

目的:以5-氮杂胞苷(5-Aza-CR)诱导骨髓间充质干细胞(MSCs)成肌分化,探讨生肌调控因子中Myf5的表达及信号转导通路p38在此分化过程中的作用.方法:分离、纯化MSCs,以10 μmol/L 5-Aza-CR诱导其向成肌细胞分化,RT-PCR测定Myf5的表达,免疫组化检测肌球蛋白(myosin)的表达,Western-blot检测p38信号通路特异抑制剂SB203580作用前后磷酸化p38的变化.结果:SB203580作用后,Myf5表达由6 h延迟至9 h,诱导12 d部分MSCs表达myosin,18 d表达的数量及程度明显增加;5-Aza-CR诱导后,磷酸化p38蛋白水平较作用前增强,但在SB203580抑制后明显受抑.结论:5-Aza-CR诱导后,MSCs表达生肌调控因子并向成肌细胞分化,p38在此分化过程中起着正向信号转导作用.     

KLF转录因子家族与脂肪细胞分化

Kruppel样转录因子（Kruppel-like factors, KLF）是一类具有锌指结构的转录因子,其典型结构特征是在其羧基端具有3个C2H2锌指结构. KLF广泛参与细胞增殖、凋亡、分化以及胚胎发育等多个生命活动的调控. 近年来脂肪细胞分化研究的结果显示,KLF家族的多个成员参与脂肪细胞分化过程的调控,既有促进脂肪细胞分化的,也有抑制脂肪细胞分化的. 其中KLF4通过与Krox20协同作用,激活C/EBPβ（CCAAT-enhancer-binding protein β）基因表达,促进脂肪细胞分化;KLF5和 KLF15都通过直接结合到氧化物酶增殖体激活受体γ（peroxisome proliferator-activated receptor γ, PPARγ）基因的启动子,激活PPARγ基因表达,促进脂肪细胞分化;而KLF6则通过抑制前脂肪细胞因子（pre-adipocyte factor 1, PREF1）基因表达,促进脂肪细胞分化. 抑制脂肪细胞分化的KLF2通过结合于PPARγ的启动子,抑制PPARγ基因表达,从而抑制脂肪细胞的分化;KLF3通过募集辅助抑制因子C-末端结合蛋白（c-terminal binding protein, CtBP）形成KLF3 CtBP抑制复合体,结合于C/EBPα（CCAAT-enhancer-binding protein α）基因的启动子,抑制C/EBPα表达,进而抑制脂肪细胞的分化;KLF7通过抑制葡萄糖转运蛋白2（glucose transporter2,GLUT2）基因的表达抑制脂肪细胞的成熟. 本文综述这些KLF转录因子在脂肪细胞分化过程的作用及其作用的机制.     

Cdk6在维持ES细胞自我更新中的作用

细胞周期蛋白依赖性激酶6（cyclin dependent kinase 6,Cdk6）对胚胎早期发育有着重要的作用.然而,它在胚胎干（embryonic stem,ES）细胞中的生物学功能仍不清楚.在该研究中,我们运用RNA干扰技术和基因表达分析方法探索了Cdk6在小鼠胚胎干细胞中的功能及分子机制.结果表明：Cdk6的表达水平与小鼠ES细胞的自我更新密切相关.首先,维甲酸（RA）处理和白血病抑制因子（LIF）去除实验显示 ,随着ES细胞的分化,Cdk6的表达水平明显降低.更为重要的是,RNA干扰介导的Cdk6表达抑制导致ES细胞自我更新相关基因的显著下调,同时伴随细胞分化基因的表达激活,提示Cdk6对维持ES细胞自我更新至关重要.     

羟基脲诱导前后HEL细胞内GATA转录因子与人β—类珠蛋白基因调控元件的结合模式分析

HEL细胞是一株人红白血病细胞株,其中成年型β-珠蛋白基因不能表达。我们以往的试验证明,羟基脲诱导以后,能使HEL细胞内成年型β-珠蛋白基因表达。本文以此为模型,探索了β-珠蛋白基因在HEL细胞内诱导表达的分子机制。结果表明,羟基脲诱导之后,与人β-珠蛋白基因5’远侧端DNaseⅠ超敏感点2核心DNA序列以及近侧端启动子DNA序列相结合的GATA-1蛋白因子量明显增多,而GATA-2蛋白因子量明显减少。结果显示,GATA蛋白家族各成员在HEL细胞分化及珠蛋白基因表达的过程中扮演着不同的角色。推测GATA-1可能有促进β-珠蛋白基因的表达,使HEL细胞趋向终末分化的作用,GATA-2则可能与胚胎型珠蛋白基因表达有关,并有抑制红细胞向终末分化的功能。     

维生素A酸受体γ基因表达及其对ES细胞分化和凋亡的影响

本文以小鼠胚胎干细胞ES-5细胞为实验模型,研究了RARγ基因表达对RA诱导ES细胞分化的影响。通过把构建质粒pSG5-RARγ-neo转染ES-5细胞,获得了过度表达RARγ基因的ES-γ细胞系。ES-γ细胞保持了ES细胞的干细胞特点。体内分化潜能的研究表明,ES-γ细胞仍然保持分化多潜能性的特点,能分化形成各种组织结构,但与ES-5细胞相比,观察不到软骨组织,而肌肉组织和鳞状上皮细胞构成的角质化囊状结构较丰富。体外诱导分化研究表明,ES-γ细胞分化方向受到干扰,向成纤维样细胞分化。这些结果表明RARγ基因参与了RA诱导ES细胞分化的过程,而且RARγ基因的表达变化影响了RA诱导ES细胞分化的细胞类型。在研究中还发现,ES细胞在RA诱导分化过程中,同时还发生了细胞凋亡现象。细胞凋亡的发生与RA浓度相关,而RARγ基因的过度表达使细胞凋亡明显加剧。这些结果表明RARγ基因可能也参与了RA诱导ES细胞凋亡的过程。     

白血病抑制因子在骨骼肌损伤与肥大中的作用及其机制

白血病抑制因子(LIF)是一种肌肉因子(myokines),在损伤骨骼肌和运动后骨骼肌中高丰度表达,它可能通过JAK2和STAT3信号通路调节肌卫星细胞和成肌细胞增殖,通过PI3K信号通路抑制成肌细胞凋亡,也可以通过LIF受体信号通路调节骨骼肌局部炎症反应,同时与多种细胞因子相互作用抑制成肌细胞过早分化,从而在骨骼肌损伤修复和骨骼肌肥大中发挥重要作用。外源性补充重组LIF可促进骨骼肌损伤修复和促进骨骼肌肥大,这具有非常重要的临床应用价值。LIF可能成为治疗急性肌肉损伤和促进骨骼肌肥大的一种新手段,有关LIF在骨骼肌方面的研究也将会成为一个新的研究热点。     

高表达FoxO1抑制猪骨骼肌成肌细胞的分化

FoxO1(Forkhead box O1)是调控肌肉生长、代谢和细胞分化的重要转录因子,但其在成肌细胞分化中的作用还不甚清楚。为了研究FoxO1对哺乳动物成肌细胞分化的影响,以原代培养的长白仔猪成肌细胞作为实验材料,用2%马血清诱导分化,采用实时荧光定量PCR、Western blotting和脂质体转染等方法检测FoxO1及早期和晚期生肌调节因子MyoD和myogenin在猪成肌细胞分化过程中的表达变化。结果显示,在猪成肌细胞分化过程中,FoxO1mRNA表达量显著增加,但总蛋白量变化不显著,其磷酸化水平显著上调。同时,高表达FoxO1的猪成肌细胞中,生肌调节因子MyoD和myogenin mRNA表达受到显著抑制,而MyoD蛋白变化不显著,myogenin却显著下调(P0.05)。以上结果表明,FoxO1能够推迟猪成肌细胞的分化时间并抑制分化;同时推测,FoxO1可能通过抑制生肌调节因子的表达控制骨骼肌纤维类型的终末分化。     

微小RNA调控骨骼肌增殖、分化的研究进展

骨骼肌损伤、萎缩等疾病的防治一直是困扰临床医生的难题。这些骨骼肌疾病的康复离不开肌细胞增殖、分化的调节。微小RNA（microRNA）作为基因表达的调节因子,通过对骨骼肌细胞增殖、分化机制的开启、促进和抑制等方式,对骨骼肌发育过程中的初始肌细胞、成肌细胞以及生物体成熟以后的肌卫星细胞的增殖、分化均进行着精细调节。因此,研究microRNA调节骨骼肌增殖、分化的机制已成为科研工作者的当务之急,并具有广阔的应用前景。     

骨骼肌卫星细胞对肉品质的影响及其分化调控

骨骼肌卫星细胞是一种肌源性干细胞, 在骨骼肌的生长、发育及肌肉损伤修复中有着至关重要的作用。肌卫星细胞通过增殖、分化融合肌纤维形成新的肌核从而导致骨骼肌纤维的肥大以及骨骼肌纤维类型的相互转化, 进而影响肉品质的形成。文章从肌纤维的发育与肉品质形成、卫星细胞分化与肌纤维特征的相关性等方面, 对卫星细胞的Notch等经典遗传信号通路和miRNA等表观遗传调控及其对肉品质的影响进行了综述。     

异丙肾上腺素在C2C12细胞分化中的作用及机制

该研究主要探讨异丙肾上腺素(isoprenaline,ISO)在C2C12细胞分化与肌萎缩中的作用及可能的机制。在利用免疫组化分析C2C12细胞肾上腺素能受体表达特征的基础上,以2%的马血清高糖培养基建立C2C12细胞分化的实验体系,随后分别按单次或连续单次给予10~(–5) mol/L ISO后观察其分化差异;接着再比较连续单次给予不同浓度的ISO(10~(–8) mol/L、10~(–7) mol/L、10~(–6) mol/L、10~(–5) mol/L)处理;利用细胞免疫荧光化学和Western blot方法检测C2C12细胞分化后肌球蛋白重链(myosin heavy chain,MYH)的水平,并定量分析分化后骨骼肌细胞的肌管细胞核融合数目;同时,利用Western blot检测C2C12细胞分化调节有关的肌细胞生成蛋白(myogenin,Myo G)、p-p38MAPK(phosphorylated p38-mitogen-activated protein kinase)及p-AKT(phosphorylated/protein kinase B)的水平变化。结果显示,C2C12细胞呈现出α-肾上腺素和β-肾上腺素能受体表达的特征。分化培养诱导下,C2C12细胞随着时间的延长,分化成肌管的数量逐渐增多,在第8 d达峰值。单次一次给予10~(–5) mol/L ISO没有连续单次给予ISO抑制C2C12细胞分化成骨骼肌细胞显著,且连续单次给予ISO随着其浓度的增加,C2C12细胞分化为肌管细胞核融合数目逐渐减少并在ISO浓度为10~(–5) mol/L时最显著。与此同时,随着连续单次给予不同浓度(10~(–8) mol/L、10~(–7) mol/L、10~(–6) mol/L、10~(–5) mol/L)的ISO,MYH和Myo G的表达水平呈现随着浓度增加而逐渐降低的特征,而且p-p38MAPK及p-AKT的水平也呈连续单次给予ISO浓度增加而降低的趋势,在ISO浓度为10~(–5) mol/L时降低最显著。该研究提示,连续单次给予ISO显著抑制C2C12细胞分化为成熟骨骼肌细胞,且与p-p38MAPK、p-AKT及Myo G水平的降低密切相关,从而为交感神经长期过度兴奋所伴随的肌萎缩提供新的研究模型和治疗靶点。     

甲基转移酶METTL21C影响鸡骨骼肌细胞成肌的发育

本研究旨在探究甲基转移酶METTL21C在家禽骨骼肌发育分化过程中的作用。采用实时荧光定量PCR (quantitative Real-time PCR, qPCR)检测METTL21C基因在鸡不同组织中的表达情况,绘制其组织表达谱;选取3个时间点,检测其在骨骼肌组织中的表达情况。通过酶消化法从鸡骨骼肌组织中分离得到原代细胞;将METTL21C超表达载体转染至原代鸡骨骼肌细胞,通过qPCR和Western blotting检测Pax7、MyoD、Myf5、MyoG等基因的表达水平。结果显示,METTL21C在心肌和骨骼肌组织中的表达量显著高于其他组织,在胚胎期和幼龄期骨骼肌中的表达呈上升趋势;超表达METTL21C后,成肌相关基因Pax7、MyoD、Myf5、MyoG的表达量显著升高。本研究初步发现甲基转移酶METTL21C具有促进家禽骨骼肌发育分化的作用,为骨骼肌发育的分子机理的研究及相关医学研究提供数据支持。     

五指山猪不同组织中肌细胞生成素基因Myf4及生肌调节因子Myf6的表达

本文通过运用Real-time PCR技术,检测肌细胞生成素基因Myf4和生肌调节因子Myf6在出生后的第30天、第210天、第360天(出生到体成熟)的五指山猪肌肉组织中的表达变化,以及Myf4、Myf6在体成熟五指山猪肌肉、心、肝、脾、肺、肾、胃、小肠组织中mRNA相对表达情况。结果表明:Myf4及Myf6基因在五指山猪出生后在肌肉组织中的mRNA表达水平随着五指山猪的生长年龄生长而显著增长(p<0.05);Myf4及Myf6基因在成年五指山猪以上8种组织中均有表达,其中在肌肉组织中相对表达量最高。本研究结果将为五指山猪肌肉生长发育及矮小性状形成机理提供参考。