鹤望兰类黄酮3′,5′-羟化酶基因SrF3′5′H的克隆及表达分析

采用RT-PCR和RACE方法从鹤望兰黄色花萼中克隆到类黄酮生物合成途径关键基因SrF3′5′H。该cDNA全长1 766 bp,具有完整的开放阅读框（ORF）,共1 509个碱基,编码503个氨基酸。氨基酸同源性分析表明,SrF3′5′H编码的氨基酸序列与已报道的其他植物的F3′5′H蛋白具有很高的同源性。系统进化树分析显示,鹤望兰SrF3′5′H与非洲紫罗兰蛋白亲缘关系较近。应用半定量PCR分析表明,SrF3′5′H在始花期转录水平达到最高,且在蓝色花瓣中表达最高,在黄色花萼中几乎没有表达。     

黄秋葵类胡萝卜素合成基因LCYB的克隆与分析

本研究应用RT-PCR和RACE技术克隆得到cDNA全长1797 bp的黄秋葵番茄红素β-环化酶基因LCYB,开放阅读框(ORF) 1509个碱基;预测编码503个AA,理论分子量(Mw)为56.288 kD,等电点(pI)为4.577;编码的蛋白与陆地棉(Gossypium raimondii)、黄麻(Corchorus olitorius)和可可(Theobroma cacao)同源蛋白的相似性均在88%以上,显示其高度的保守性,将基因命名为HyLCYB,GeneBank登录号为：KX257998。Motif Scan分析显示,蛋白氨基酸序列88 ~ 481位为HyLCYB保守结构域,并在88 ~ 113位含有1个FAD结合域。通过荧光定量PCR 分析表明,LCYB基因在黄秋葵根、茎、叶、花和果荚中都有表达;叶片生长中以成熟叶中表达最高,果实发育中以花后7天高表达。建立与优化了黄秋葵类胡萝卜素超高效液相检测体系,黄秋葵中主要含有β-胡萝卜素和叶黄素。β-胡萝卜素在成熟叶中含量最高, 果实以花后7天的果实含量最高,与LCYB基因的表达存在一定的相关性。     

外源ABA及其抑制剂钨酸钠对木薯块根类胡萝卜素相关基因和蛋白的影响

旨在研究外源ABA及其抑制剂钨酸钠(Na_2WO_4)对木薯块根类胡萝卜素相关基因和蛋白的影响。以木薯品种华南9号(Manihot esculenta Crantz SC9)为材料,HPLC测定块根β-胡萝卜素;Western blot分析相关蛋白表达量;QPCR分析相关基因表达量。结果显示,外源ABA及钨酸钠能提高块根β-胡萝卜素的含量;其中外源ABA与钨酸钠都提高了类胡萝卜素合成途径基因PSY2与LCYB表达,并抑制降解相关的ZEP与NCED3基因的表达,从而能够在转录水平的变化上解释β-胡萝卜素含量的变化,且LCYB与ZEP在转录与翻译水平具有一致性;与质体相关PAP1基因和FBN1a在处理下上调表达在一定程度上增加了质体小球的数量;外源ABA及钨酸钠使活性氧(ROS)相关的超氧化物歧化酶(Fe-SOD和Cu/Zn-SOD)表达量升高保护了块根中类胡萝卜素的稳定。这三者共同作用,提高了块根β-胡萝卜素的含量。     

黄秋葵番茄红素β-环化酶LCYB基因的克隆与分析

应用RT-PCR和RACE技术克隆得到cDNA全长1797 bp的黄秋葵(Hibiscus esculentus L.)番茄红素β-环化酶基因LCYB,开放阅读框(ORF)包含1509个碱基;预测编码503个氨基酸,理论分子量(Mw)为56.288 kD,等电点(p I)为4.577;编码的蛋白与陆地棉(Gossypium hirsutum L.)、黄麻(Corchorus capsularis L.)和可可(Theobroma cacao L.)同源蛋白的相似性均在88%以上,显示其高度的保守性,将基因命名为HeLCYB,GenBank登录号为:KX257998。Motif Scan分析显示,蛋白氨基酸序列88~481位为HeLCYB保守结构域,并在88~113位含有1个FAD结合域。通过荧光定量PCR分析表明,HeLCYB基因在黄秋葵根、茎、叶、花和果荚中均有表达;叶片生长中以成熟叶中表达最高,果实发育中以花后7d高表达。建立与优化了黄秋葵类胡萝卜素超高效液相检测体系,结果显示黄秋葵中主要含有β-胡萝卜素和叶黄素。β-胡萝卜素在成熟叶中含量最高,果实以花后7 d含量最高,与HeLCYB基因的表达呈正相关。本研究揭示了HeLCYB基因表达和类胡萝卜素积累的特性,为开展黄秋葵类胡萝卜素分子调控机制研究奠定了基础。     

木薯品种(系)类胡萝卜素代谢相关基因和蛋白表达水平分析

以白心木薯华南6068、华南9号、紫叶黄心木薯BGM019和粉红木薯Mirasol为材料,探究木薯块根膨大期和成熟期与类胡萝卜素代谢通路相关的14个基因和4种蛋白质表达水平变化。用HPLC检测块根β-胡萝卜素含量的变化,分别用qRT-PCR和Western blot方法对类胡萝卜素代谢通路相关基因和蛋白酶的表达水平进行分析。以华南6068为对照,研究结果表明:华南9号和紫叶黄心木薯BGM019成熟期中的类胡萝卜素合成途径关键基因PSY2、LCYB基因显著高于膨大期,而降解相关的关键基因CCD1、NCED3在成熟期的表达量显著低于膨大期(P0.05)。粉红木薯Mirasol成熟期中PSY2、LCYB的显著下调与CCD1、NCED3的显著上调(P0.05)是造成β-胡萝卜素含量差异的原因之一。通过分析不同木薯品种(系)在膨大期和成熟期块根类胡萝卜素代谢途径相关基因的表达水平,有助于解析β-胡萝卜素积累的分子机理。此外,Western blot结果显示抗坏血酸过氧化物酶、谷胱甘肽还原酶、超氧化物歧化酶和HSP70虽然和块根类胡萝卜素代谢途径没有直接关联,但它们在木薯膨大期和成熟期块根表达水平有显著差异(P0.05)。     

石榴赤霉素合成相关基因PgKO的克隆及表达分析

该研究以‘红玉石籽’(Punica granatum cv.Hongyushizi)石榴为试验材料,采用RT-PCR和RACE技术,从石榴花中克隆得到赤霉素合成关键酶——内根贝壳杉烯氧化酶(KO)基因,命名为PgKO(GenBank登录号为MG208017)。PgKO全长cDNA为1 729bp,包含1 542bp开放阅读框(ORF),编码513个氨基酸,相对分子量为141.16kD,理论等电点为4.9。多重序列对比显示,PgKO与苹果MdKO、白梨PcKO、葡萄VvKO的相似性分别为61.28%、64.56%和73%,并且具有CYP450结构域(脯氨酸富含域、氧还原位点和血红素结合域)。系统进化树分析表明,PgKO与其他物种的起源相同,并与桉树EgKO的亲缘关系最近。荧光定量PCR发现,在石榴蕾期和盛花期,PgKO基因的表达量均为筒状花高于钟状花,且PgKO基因在两种花型的子房、花药、花萼中均有表达,但筒状花中子房的表达量最高,花萼的表达量最低;钟状花中花药的表达量最高,子房的表达量最低。     

桃果实发育阶段肉色形成与类胡萝卜素的变化分析

为了分析不同肉色类型桃果实发育过程中类胡萝卜素成分的变化特点及其颜色差异形成的因素,选择‘半斤桃’(红肉)、‘图八德’(黄肉)、‘正姬’(白肉)桃品种为试材,采用紫外分光光度计和高效液相色谱法(HPLC)对桃果实类胡萝卜素及其组分含量进行定性定量分析.结果显示:(1)桃果实的主要类胡萝卜素成分为叶黄素、玉米黄素、β-隐黄质、α-胡萝卜素和β-胡萝卜素.(2)随着果实的发育,‘半斤桃’和‘正姬’的类胡萝卜素总含量逐渐降低,而‘图八德’则是先降低后上升,且明显高于前二者;3种类型桃果实的叶黄素均逐渐降低,果实成熟时接近0;玉米黄素呈先降后升的趋势,果实成熟时达到最大值;‘半斤桃’和‘正姬’的β-隐黄质、α-胡萝卜素和β-胡萝卜素呈逐渐下降的趋势,而‘图八德’的β-隐黄质含量先升后微降最后上升、α-胡萝卜素和p-胡萝卜素含量则逐渐增加,且均在果实成熟时达到最大值.(3)‘图八德’成熟果实中的类胡萝卜素总含量达到最大值,其中β-胡萝卜素含量最高,占5个成分之和的75.99％.研究表明,桃果实肉色形成与类胡萝卜素的含量与成分有着紧密的联系,尤其是其中的β-胡萝卜素含量.     

蕙兰MADS基因APETALA1/FRUITFULL-like的克隆和时空表达特性

为研究兰花成花转变及花发育的调控机理,利用反转录RT-PCR和RACE的方法,从蕙兰萼片中克隆出一个APETALA1/FRUITFULL-like(AP1/FUL-like)基因,命名为CfAP11,GenBank登录号为JQ031272.1.该基因编码的氨基酸序列与MADS-box蛋白家族中类APl/FUL亚家族中球花石斛FRUITFULL-like具有较高的同源性(84％),系统进化分析表明该蛋白的氨基酸序列与APl/FUL转录因子亚家族中的蛋白聚为一类.生物信息学分析推测表明,该基因编码的蛋白具有MADS保守域和相对保守的K区,二级结构中α-螺旋所占比例较高(58.97％),三级结构与月季、水稻和水仙非常相似.相对荧光定量PCR分析结果表明:CfAPll在根中表达痕量,生殖期比营养期叶片中表达量低、盛花期比花蕾期花葶中表达量高,由此推测,CfAP11可能与蕙兰的成花诱导、花发育有关;并发现CfAP11在盛花期花葶和子房中表达量远高于其他组织,表明其可能以某种机制参与果实的形成过程.     

观赏向日葵八氢番茄红素脱氢酶基因PDS的cDNA克隆与表达特性分析

采用RT-PCR和RACE技术从观赏向目葵‘闽葵3号’黄色花瓣中克隆到类胡萝卜素合成途径关键基因HaPDS的cDNA,该cDNA全长2017bp,具有一个1710bp的完整开放阅读框（ORF）,编码一个570个氨基酸的蛋白质。序列分析表明,HaPDS编码的氨基酸序列与其他植物的PDs蛋白具有很高的同源性,在N-端有一个辅助因子结合结构域,C-端有一个类胡萝卜素结合域。系统进化树分析显示,观赏向日葵HaPDS与万寿菊、菊花蛋白亲缘关系较近。实时荧光定量RT-PCR技术分析表明,胁肋路因在花发育的盛花期表达量最高;不同组织中的表达量舌状花瓣〉苞片〉叶片〉绿色管状花〉黑色管状花：随着基因表达量的增加,花色由白色到黄色、金黄色转变。     

牙鲆cbx2基因的分子特征与组织表达

为鉴定牙鲆(Paralichthys olivaceus)色素框同源蛋白(Chromobox homolog,CBX)基因cbx2及探讨其在牙鲆性腺中的表达,通过PCR克隆和测序获得了cbx2 cDNA序列;利用多种生物信息学方法在线分析了牙鲆CBX2蛋白质的理化性质与空间结构,并比较了脊椎动物中cbx2的基因结构、氨基酸同源性、系统进化;运用RT-PCR技术分析了cbx2基因在牙鲆成体不同组织的表达情况。结果表明获得的牙鲆cbx2 cDNA序列包含1 584 bp的开放阅读框,编码527个氨基酸,其蛋白质分子量和等电点分别为56 578.98和10.03,是一种偏碱性的亲水性蛋白,该蛋白无信号肽,无跨膜区域,且编码该蛋白的氨基酸中以丝氨酸(Sr)的含量为最高;空间结构分析发现,牙鲆CBX2蛋白以α螺旋和无规则卷曲为主,其二级结构中含有1个染色质结构域和4个低复杂结构域,该染色质结构域常结合甲基化氨基酸残基。基因结构、氨基酸同源性和系统进化分析表明cbx2基因在脊椎动物进化中较为保守,牙鲆cbx2与尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus)、青鳉(Oryzias latipes)的基因结构更为相似,其氨基酸同源性与杜氏鰤(Seriola dumerili)最高,为89%。RT-PCR结果显示牙鲆cbx2基因在精巢的表达量最高,卵巢次之,而在其他组织中仅有较低的表达。这些结果提示了cbx2基因在牙鲆的性腺发育中可能具有重要作用。     

滇水金凤花距发育相关基因GRF的克隆及表达分析

采用RT-PCR技术对滇水金凤(Impatiens uliginosa Franch.)GRF基因进行克隆,对其编码蛋白序列进行同源性分析和系统进化分析,并利用qRT-PCR方法分析GRF基因的时空表达模式。结果显示,从滇水金凤中成功获得两个GRF基因,其cDNA全长分别为1137和903 bp,分别编码378和300 aa,分别命名为IuGRF1和IuGRF2,二者均具有QLQ和WRC结构域。除了保守区域外,滇水金凤GRF基因编码产物序列与其他物种的同源性较低。系统进化分析结果表明,IuGRF1和IuGRF2分别位于两个不同的进化分支。基因表达分析发现,IuGRF1在花苞期和盛花期距部表达量最高,而在檐部的表达随花距的发育逐渐降低。IuGRF2在花苞期檐部表达量最高,随着花距的发育逐渐降低。此外,IuGRF1和IuGRF2基因均在始花期花距弯部表达量最高,且随着花距的发育,在尖部和弯部的表达量逐渐降低,而在基部的表达量逐渐升高。推测滇水金凤的两个基因为同源基因,IuGRF1主要参与花距距部的生长和发育,而IuGRF2主要参与檐部的生长和发育。     

三疣梭子蟹卵巢发育过程中主要类胡萝卜素组成变化及其与抗氧化性能的关系

实验研究了三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)卵巢发育过程中(Ⅰ—V期)组织色泽、类胡萝卜素组成与含量、抗氧化和非特异性免疫指标的变化规律,进一步探讨了肝胰腺中类胡萝卜素含量变化与抗氧化指标的关系。结果表明:(1)卵巢发育期间,卵巢指数(GSI)显著增加(P<0.05),肝胰腺指数(HSI)整体呈先升后降的趋势;卵巢的红度(a*)值和黄度(b*)值、肝胰腺的亮度(L*)值和b*值均呈显著上升趋势,但卵巢中L*值呈下降趋势。(2)在卵巢发育过程中,卵巢中的总类胡萝卜素、虾青素、叶黄素和β-胡萝卜素含量均为先升后降的趋势,虾青素含量在Ⅳ期最高;肝胰腺中的虾青素含量呈上升趋势,而β-胡萝卜素含量为显著下降趋势;内表皮中的总类胡萝卜素、虾青素、叶黄素、海胆烯酮和β-胡萝卜素含量均呈现下降趋势;就不同组织中类胡萝卜素含量而言,内表皮中虾青素含量最高。卵巢和肝胰腺的L*值与总类胡萝卜素含量呈显著负相关,卵巢的a*值和b*值均与总类胡萝卜素、虾青素、叶黄素、海胆烯酮和β-胡萝卜素含量呈显著正相关。肝胰腺的a*值与各类胡萝卜素含量无显著相关性, b*值仅与虾青素含量呈显...     

小麦ζ-胡萝卜素脱氢酶cDNA全序列的克隆

目的:从普通小麦品种EM12中克隆ζ-胡萝卜素脱氢酶(ζ-carotene desaturase,ZDS)基因的cDNA全长序列.方法:根据已报道的EST序列,应用cDNA末端快速扩增(RACE)技术,对EST两端未知序列进行扩增、克隆和测序.结果:克隆得到cDNA全长序列2 150bp,其ORF序列为1 707bp,预测编码568个氨基酸残基,推测蛋白质分子量62.5kDa,带有一段19aa的信号肽序列.结论:根据同源序列分析,该序列与水稻ZDS蛋白的同源性为97%,与玉米ZDS蛋白的同源性为91%,而且与其他高等植物的ZDS都具有较高的同源性.该基因序列的分离与克隆为进一步开展小麦β-胡萝卜素生物合成机制的研究和利用转基因技术提高小麦β-胡萝卜素含量的研究奠定了基础.     

小苍兰芳樟醇合酶基因的克隆及表达分析

芳樟醇是小苍兰花香的主要成分,为了研究小苍兰芳樟醇合酶的合成与代谢机理,采用RT-PCR方法从小苍兰‘金童’花瓣中克隆到1个芳樟醇合酶(linalool synthase,LIS)基因,含有完整的c DNA开放阅读框(open reading frame,ORF),共1 779个碱基(Gen Bank收录号KX452731)。与其他物种的芳樟醇合酶氨基酸序列有40%~95%的同源性。系统进化树分析显示,‘金童’LIS与小苍兰首先聚为一类,其次与百合、姜、芭蕉的单贴合酶亲缘关系较近。应用荧光定量PCR分析表明,在小苍兰品种White Wing-2中LIS表达量最高,在花瓣中高表达,且在花发育的始花期表达量最高。     

葡萄果实(E)-β-丁香烯合酶基因的克隆及其表达分析

利用生物信息学方法,通过电子克隆获得葡萄(Vitis vinifera Linn.) (E)-β-丁香烯合酶基因的cDNA序列;以从葡萄品种‘德引84-1’(‘Deyin 84-1’)果肉中提取的mRNA为cDNA模板,利用特异PCR技术克隆得到1个全长1 880 bp的基因,被命名为Vv-ECar(GenBank登录号JF808010),该基因序列包括开放阅读框1 674 bp、3’非翻译编码区209 bp和poly+ (A) 28 bp,可编码557个氨基酸.比对结果显示:葡萄Vv-ECar基因的核苷酸序列与葡萄VvGwECar2基因的同源性达93％,二者编码的氨基酸序列同源性达90.8％,均含有植物萜类合酶家族共有的保守域DDXXD;葡萄Vv-ECar与茶[Camellia sinensis (Linn.)0.Kuntze]和杨(Populus balsamifera subsp.trichocarpa×P.deltoids)的萜类合酶相关基因同源性均在73％以上;分子进化树的分析结果也显示葡萄Vv-ECar基因编码的氨基酸序列与其他植物的同源序列具有高度保守性.半定量RT-PCR和荧光定量PCR分析结果显示:在葡萄果实发育的不同阶段均有Vv-ECar基因的表达,但其相对表达量随果实的发育呈先低后高的趋势,其中在幼果期相对表达量最高.     

紫丁香查尔酮异构酶基因SoCHI的克隆及表达分析

采用RACE技术从紫丁香(Syringa oblata Lindl.)花中克隆获得查尔酮异构酶基因(CHI)的cDNA全长序列,命名为SoCHI,其编码的蛋白质为SoCHI蛋白。序列分析结果表明:SoCHI基因的开放阅读框(ORF)长度为684bp,编码227个氨基酸残基,并且,该基因全部由外显子构成,无内含子。SoCHI蛋白理论相对分子质量24 988,理论等电点p I 5.53,不稳定系数为47.58,平均亲水指数为-0.096,并包含2个氢键结合位点、2个活性催化位点和7个底物结合位点;在该蛋白质的二级结构中,α-螺旋、延伸链和无规则卷曲分别占该蛋白质氨基酸残基总数的31.7%、20.3%和48.0%。同源性比对结果表明:紫丁香与其他9种植物CHI蛋白的同源性很高(均在76%以上),与同科[木犀科(Oleaceae)]植物桂花(Osmanthus fragrans Lour.)和油橄榄(Olea europaea Linn.)CHI蛋白的同源性更高(达88%)。实时荧光定量PCR扩增结果表明:SoCHI基因的相对表达量在紫丁香的嫩叶中最高,在成熟叶中次之;该基因的相对表达量在紫丁香花发育过程中先上升后下降,并在花蕾期达到最高。研究结果显示:SoCHI基因编码的氨基酸序列相对保守,且其表达与紫丁香花呈色关系密切。     

黄鳝(Monopterus albus)P450(11β)基因cDNA的克隆和表达分析

11β-羟化酶(11β-hydroxylase)由P450(11β)(Cytochrome P450 11β-hydroxylase)基因编码,是一种重要的线粒体酶,指导合成11-羟睾酮,11-羟睾酮是合成硬骨鱼中最重要的雄性激素11-KT的前体物质,参与精子发生过程。本研究首先利用RT-PCR和RACE技术克隆了黄鳝(Monopterus albus)P450(11β)基因c DNA全长序列,然后利用生物信息学进行了分析,最后利用RT-PCR和荧光定量PCR方法对不同组织的表达情况进行了研究。结果显示:黄鳝P450(11β)基因c DNA全长为1 812 bp,开放阅读框1 632 bp共编码544个氨基酸氨基酸,5'非编码区(5'UTR)9个碱基,3'非编码区(3'UTR)168个碱基。黄鳝P450(11β)基因结构的保守性较高,具有细胞色素P450超家族基因的5个特征区域。氨基酸序列同源性分析表明黄鳝与其他鱼类的同源性在64%~76%之间,与舌齿鲈同源性最高为77%,但与人和老鼠的相似度仅为41.9%和37.7%。系统进化树分析以哺乳类为外群,黄鳝与点带石斑鱼、罗非鱼、舌齿鲈等聚为一大支。基因表达显示黄鳝P450(11β)基因在性腺和脑组织中表达,尤其在精巢中高表达,在卵巢中几乎检测不到。表明该基因对精子发生和精巢发育过程起着一定的作用。     

小桐子类固醇还原酶基因Jc5β-StR的克隆和表达分析

以小桐子(Jatropha curcas L.)cDNA为模版,克隆了Jc5β-StR基因的CDS序列,并对其序列进行了生物信息学分析。序列分析表明该基因包含1 173 bp开放阅读框(ORF),编码390个氨基酸。预测其编码蛋白质的相对分子量为44.23 k D,理论等电点为5.22。Blast搜索结果及进化分析结果表明,Jc5β-StR与蓖麻5β-St R蛋白序列一致性最高(87%)且亲缘关系最近。Jc5β-StR是一个短链还原酶,该蛋白编码有一个短链还原酶家族(SDRs)的黄体酮5β还原酶(5β-POR),还含有SDRs的6个保守结构域。组织表达结果显示Jc5β-StR在小桐子根、茎、叶、花、果皮和种子中都有表达,在种子中表达量最高,且随种子发育过程表达量逐渐上升,在种子生长发育的后期(50 d)达到最高值后下降。非生物胁迫(PEG、Na Cl、低温和机械损伤)诱导下,Jc5β-StR的表达量都不同程度上调,推测其参与小桐子非生物胁迫响应。     

牙鲆emx1基因的克隆及表达

为阐述空通气孔同源框1(empty spiracles homeobox 1,emx1)基因在牙鲆发育中的作用,通过PCR技术克隆牙鲆emx1基因,运用Bio Edit、MEGA等软件分析其序列结构特征,并采用荧光定量PCR技术分析其在牙鲆早期发育和组织分布中的表达情况。结果成功获得一长度为1 127 bp的牙鲆emx1 c DNA序列,其中包括708 bp的开放阅读框,编码235个氨基酸。同源性比对发现,牙鲆emx1基因的氨基酸序列与雀鲷和花鳉同源性最高,为95%,与其它物种如斑马鱼、墨西哥脂鲤、原鸡、热带爪蟾、小鼠和人的同源性分别为87%、84%、83%、80%、72%和72%。系统进化树分析显示,牙鲆Emx1蛋白与鱼类Emx1紧密聚为一支。荧光定量PCR显示,emx1基因在牙鲆卵巢中的表达量丰富,精巢中次之,而在其他各组织的表达量则较低。emx1在从原肠胚到孵化后10 d的牙鲆早期发育中也发现了相对较高的表达,且在胚孔封闭和心跳期有最高的表达。结果表明emx1基因很可能在牙鲆早期发育和生殖系统中发挥重要作用。     

发酵法生产β-胡萝卜素菌丝体中氨基酸含量的分析

采用日立８３５－５０型氨基酸分析仪,测定了发醇法生产的β－胡萝卜素菌丝体及提取β－胡萝卜素后剩余的菌渣中氨基酸含量,结果表明：在氨基酸总含量中,必需氨基酸含量较高;在β－胡萝卜素菌丝体、菌渣中,赖氨酸含量较高,谷氨酸含量最高。