通过CRISPR/Cas9基因编辑手段构建白念珠菌CaHSL1基因的失活突变体及其表型分析

钙离子稳态和钙离子信号途径对白念珠菌的形态发生、耐药性以及毒力都十分重要。白念珠菌和酿酒酵母菌的细胞质膜蛋白质Rch1p均富集在母细胞和子细胞之间的芽颈部位,负向调控胞外钙离子的内流。与细胞周期调控相关的蛋白激酶Hsl1p也存在于白念珠菌和酿酒酵母菌的芽颈部位。该研究发现,抑制CaHSL1基因的表达或者通过CRISPR(clustered regularly interspaced short palindromic repeat)/Cas9新方法失活CaHSL1基因,均可导致白念珠菌对钙离子敏感,这种钙离子敏感性可以被钙调磷酸酯酶的专一性抑制剂环孢霉素抑制。这个结果表明,钙离子稳态和钙信号转导途径可能与细胞周期调控有关。此外,CaHSL1基因失活突变体对十二烷基磺酸钠、氟康唑、酮康唑、刚果红、潮霉素B、卡泊芬净和Anidualafungin敏感,表明CaHsl1p与细胞质膜和细胞壁胁迫的应答相关。     

白念珠菌钙稳态系统及钙信号途径的研究进展

白念珠菌是临床重要的条件致病菌,其胞内的钙稳态及钙信号途径与宿主侵染、压力应答等诸多生理过程紧密相关。研究该菌的钙稳态系统及钙信号调控网络,对明确白念珠菌的侵染机制与耐药机理,以及开发具有新靶点的抗真菌药物具有重要意义。本文对这些内容的研究进展进行了综述。     

钙调磷酸酶信号调控真菌生长代谢、毒力及抗逆性能

钙调磷酸酶是一种丝氨酸/苏氨酸(Ser/Thr)蛋白磷酸酶,在真菌中普遍保守,上游信号途径由Ca2+通道(Cch1)、转运蛋白(Mid1)、钙离子感应蛋白(CaM)、钙调蛋白依赖性磷酸酶等组成。钙调磷酸酶受钙离子和钙调蛋白调节,在调控真菌Ca2+稳态的钙信号级联途径中发挥着中心作用,通过钙信号级联途径参与生物学过程,调控真菌生长、发育和毒力形成来响应外界环境因素的变化,使真菌能够适应不同环境,维持正常的生命活动。本文综述了真菌钙调磷酸酶信号的组成和上下游信号转导途径、调控细胞生长代谢、毒力形成以及抗逆性能调控的研究进展;结合对真菌代谢产物合成的调控作用,对钙调磷酸酶信号作为重要合成生物学元件及调控开关进行了展望。     

酿酒酵母细胞中钙离子信号传导途径的研究进展

酿酒酵母（SaccharomycescP增v括fdP）细胞可以通过ca2＋／钙调磷酸酶信号途径来应对许多外界环境胁迫。在交配信息素、盐或者其他环境压力存在的条件下,钙离子会通过细胞质膜上的未鉴定的钙转运蛋白x和M或者由Cchl和Midl组成的钙通道进入细胞质。胞质内钙离子浓度的增加会激活细胞质里的钙调磷酸酶（calcineurin）。钙调磷酸酶的一个非常重要的作用是去磷酸化细胞质内的转录因子Crzl,造成它快速地从细胞质转移到细胞核,从而诱导包括液泡膜上钙泵蛋白基因PMCl以及内质网膜和高尔基体膜上钙泵蛋白基因尸脚,在内的目标基因的表达。这两个钙泵蛋白和液泡膜上的Ca2＋／H＋交换蛋白Vcxl一起作用,将细胞质内的钙离子浓度控制在50～200nmol／L的正常生理浓度内．使细胞能够正常生长。该综述主要论述了酿酒酵母细胞内Ca2＋／钙调磷酸酶信号途径的最新研究进展。     

钙离子:进入细胞浆的途径与血管平滑肌收缩机制

血管平滑肌收缩所需的钙离子源于细胞外流入和细胞内释放。钙流入途径主要有膜电位依赖式和与受体耦联的钙通道。释放钙离子机制受除极IP_3、cIP_3和钙离子作用而激发。进入细胞浆的钙离子与钙受体蛋白结合而引起收缩。血管平滑肌没有肌钙蛋白C,由钙调蛋白或Leiotonin C代之。钙调蛋白通过使肌球蛋白磷酸化;而Leiotonin C则通过直接激活肌动蛋白,引起血管收缩。     

钙离子信号与细胞凋亡

细胞凋亡的分子机制是什么?这个问题当前引起人们广泛的研究兴趣。作为重要的第二信使,钙信号在许多生理和细胞活动中都起到了十分重要的作用。钙信号是否也在凋亡的调控中起作用呢?虽然在过去十多年中,许多研究证据都表明钙信号参与凋亡的调控,但是,钙信号如何作用于凋亡过程的具体机理仍然是众说纷纭。事实上,许多研究结果仍存有争议。文章总结了近几年来大量关于钙信号与凋亡研究的成果,集中讨论了两个问题：1)在凋亡前期“决定阶段”有没有钙离子信号的参与?2)钙离子信号与哪些凋亡调控因子(包括Bcl-2族蛋白)相互作用及如何作用?这问题还牵涉到亚细胞结构中钙库的作用(包括细胞质、内质网和线粒体)。根据作者自己的实验结果,文章对这些文献中不同的说法作了一些具体的评估。最后,文章还提出了一个钙离子信号参与调控细胞凋亡的可能模型。     

线粒体钙离子转运的研究进展

线粒体内的钙离子浓度对于线粒体的ATP合成、线粒体通透性转变孔道的开放及细胞质内钙信号的调节具有重要影响。线粒体的钙离子转运调节平衡是线粒体除合成ATP和诱导细胞凋亡以外的又一重要功能。线粒体中存在钙吸收和钙释放两种重要的钙转运机制。文章就线粒体外膜钙离子的转运、内膜钙离子的吸收和释放等线粒体钙离子转运方式的研究历史和最新研究进展进行了综述。     

碱性pH条件下白念珠菌钙离子通道CCH1和MID1基因对钙内流的影响及Crz1p转录因子对其的调控作用

白念珠菌Candida albicans对环境pH的适应能力与其致病性有密切关系,钙信号转导途径介导许多环境压力的应答并伴随胞内钙离子浓度的瞬间变化。通过构建钙通道基因CCH1和MID1的缺失突变株,在碱性pH条件下,研究其对胞内钙内流的影响以及转录因子Crz1p对CCH1和MID1基因的调控作用。使用二步法PCR介导的基因敲除技术构建cch1Δ/Δ和mid1Δ/Δ突变菌株,利用流式细胞术比较野生型和突变型菌株在碱性pH条件刺激下胞内钙的瞬间变化,进一步构建pPHO89-LacZ重组质粒并利用β-半乳糖苷     

白念珠菌Ras/cAMP/P KA途径研究进展

白念珠菌引起的真菌感染严重威胁着人类健康。Ras/cAMP/PKA途径在白念珠菌菌丝发育、生物被膜形成、有性生殖以及耐药性中起着重要的调控作用,该通路由GTPases(Ras1和Ras2)、腺苷环化酶(Cyr1)、cAMP水解酶(Pde1和Pde2)以及PKA激酶(包括催化亚基Tpk1和Tpk2,调节亚基Bcy1)构成。环境因子通过Ras/cAMP/PKA途径调控下游转录因子,进而调节白念珠菌多种生物学行为。文中综述了近年来白念珠菌Ras/cAMP/PKA信号通路感应胞外环境因子和调控细胞行为等方面的研究进展。     

钙/钙调素信号途径在胁迫中的作用研究进展

钙调素普遍存在于真核生物细胞中,是多种生物学作用的信号组分.钙/钙调素信号途径由钙离子,钙调素以及下游的靶蛋白组成,通过与靶蛋白作用而传递信号并且发挥生物学功能.本文主要对于旱,盐,冷以及热胁迫下钙调素结合蛋白的作用进行综述,并对相关研究领域的未来研究方向进行了展望.     

白念珠菌MAPK信号通路研究进展

白念珠菌是人类最常见的条件致病菌。促分裂素原活化蛋白激酶（MAPK链）是真核生物信号传递网络中的重要途径之一,在基因表达调控和细胞质功能活动中发挥关键作用。在白念珠菌中主要有4条MAPK途径：Mkcl途径、Cekl途径、Cek2途径和HOG途径。其中HOG途径在白念珠菌MAPK信号通路起着重要的作用。对于白念珠菌MAPK信号通路的作用及相关调控机制的了解,可以为寻找新的药物作用靶点,治疗念珠菌病提供帮助。     

CRISPR/Cas9方法失活白念珠菌CaMIT1基因及其突变株表型分析

目的构建白念珠菌CaMIT1基因突变株,研究CaMIT1基因在白念珠菌中的功能。方法本文采用CRISPR(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeat)/Cas9这种新的方法构建CaMIT1失活突变株,并通过倍比稀释的方法初步研究CaMIT1的功能。结果成功获得了CaMIT1基因的纯合子失活突变株,表型实验结果显示该基因突变株对钙离子、锂离子、十二烷基磺酸钠、克霉唑、酮康唑、Anidualafungin敏感,对刚果红耐受。结论 CaMIT1与白念珠菌的细胞质膜和细胞壁完整性以及钙离子的稳态相关。     

白念珠菌TFP1基因与钙调神经磷酸酶通路的相关性分析

目的构建白念珠菌TFP1基因敲除株,并初步分析白念珠菌TFP1基因与钙调神经磷酸酶通路相关基因的关系。方法通过融合PCR将白念珠菌TFP1基因上下游和营养缺陷筛选标记连接组成基因敲除组件,再运用醋酸锂转染法将一条基因敲除组件转入白念珠菌工程菌SN152,在营养缺陷平板上筛选出TFP1~(+/-)菌株,再运用同样的方法敲除第2条等位基因。采用实时荧光定量PCR的方法检测TFP1~(-/-)菌株、TFP1~(+/-)菌株以及SN152菌株RTA2和CRZ1基因的表达量。结果成功构建白念珠菌TFP1双等位基因敲除株,并且双等位基因敲除株中RTA2和CRZ1基因表达量均下降。结论敲除白念珠菌TFP1基因影响钙调神经磷酸酶通路相关基因RTA2和CRZ1的表达。     

酿酒酵母中与钙离子稳态调控因子ScRCH1细胞质膜定位相关的转录因子基因的筛选检测

酿酒酵母细胞中ymr034c基因与白念珠菌的Carch1基因同源,CaRCH1与白念珠菌对钙离子、锂离子和硝唑类药物的耐受性相关。因此,把ymr034c命名为Scrch1。前期研究结果显示,在胞外高钙离子胁迫条件下,ScRCH1定位于细胞质膜上。为了研究Scrch1基因表达的调控机理,通过荧光显微镜技术对酵母细胞基因组中编码转录因子的223个单基因缺失菌株进行了筛选,分别检测了ScRCH1-GFP融合蛋白在它们中的亚细胞定位情况。结果发现,钙离子处理后,ngg1、hal9、crz1、ada2和swi6五个转录因子基因的缺失造成ScRCH1-GFP没有细胞质膜定位,而ino2基因的缺失导致ScRCH1-GFP在不经钙离子处理的条件下即定位到细胞质膜上。     

钙离子结合蛋白及其在神经系统疾病中的作用

钙离子作为第二信使参与多种途径的调控,钙离子结合蛋白在此过程中起着重要的作用．通过对钙离子结合蛋白的分布特征、结构分析,新的成员以及新的功能不断地被发现．在疾病发生过程中,钙离子结合蛋白动态平衡的破坏与线粒体的异常、自由基的损害有密切的关系,并已在多种疾病特别是神经系统的疾病中得到了证实．本文就钙离子结合蛋白的特征以及在主要神经系统疾病中作用的研究进展进行简要综述．     

白念珠菌CaSPO75基因的敲除与功能研究

酿酒酵母中ScCsc1是一个最近鉴定的钙离子通透性压力门控阳离子通道蛋白,参与调控胞内离子稳态。ScSpo75是ScCsc1的一个同源蛋白,可能参与孢子壁的装配过程。在白念珠菌中存在一个与ScSPO75同源的基因CaSPO75,其功能尚不清楚,因此采用SAT1-flipper方法敲除CaSPO75的两个等位基因以研究其功能。通过表型筛选,发现该基因的缺失导致白念珠菌对特比萘芬(Teb)、荧光增白剂(CFW)、氯化锰和氯化锌耐受,对酮康唑(KCZ)敏感。因此,CaSPO75基因可能参与白念珠菌耐药性和细胞壁压力反应的调控,以及胞内锰离子和锌离子稳态的调控。     

在钙离子敏感性方面与RCH1遗传互作的酿酒酵母基因的筛选

酿酒酵母ScRCH1是白念珠菌CaRCH1的同功基因,作为人体溶质转运蛋白SLC10A7的同源蛋白,两者都是细胞质膜上钙离子内流的抑制因子。为了研究酿酒酵母RCH1与基因组中其他基因之间的遗传互作,利用合成遗传阵列(Synthetic Genetic Array,SGA)方法构建了RCH1分别与其他非必需基因之间的双基因缺失株文库。钙离子表型筛选表明RCH1与17个基因之间存在遗传互作,其中4个基因BUD9、THR1、RAS2和CPR7在钙离子敏感性方面的功能以前没有报道过。这些结果为深入研究Rch1对钙离子稳态的调控提供了参考。     

白念珠菌CaPPEl的克隆及其在酿酒酵母形态发生中的功能研究

白念珠菌的致病性与其形态转变相关,白念珠菌的形态转换受各种外界信号和细胞内信号转导途径的调控。转录因子Flo8在酿酒酵母形态发生中起重要作用,我们将白念珠菌基因组文库导入flo8缺失株中,筛选能够校正flo8缺失株侵入生长缺陷的基因,分离得到一个与酿酒酵母蛋白磷酸酯酶甲基酯酶PPEl同源的基因,命名为CaPPEl。CaPPEl的基因编码区全长1083bp,推测编码一个361氨基酸的蛋白。在单倍体酿酒酵母中,CaPPEl基因的表达可以部分回复flo8缺失株的侵入生长缺陷,但是在MAPK途径缺失株中不能进行侵入生长。在双倍体酿酒酵母中,CaPPEl基因的表达可以部分激活MAPK途径成员缺失株的菌丝生长缺陷,但却只能在flo8缺失株中产生微弱的激活作用。结果表明CaPpel在酿酒酵母的假菌丝生长和侵入生长中参与的信号转导途径不同。     

白念珠菌CaPPE1的克隆及其在酿酒酵母形态发生中的功能研究

白念珠菌的致病性与其形态转变相关,白念珠菌的形态转换受各种外界信号和细胞内信号转导途径的调控.转录因子Flo8在酿酒酵母形态发生中起重要作用,我们将白念珠菌基因组文库导入flo8缺失株中,筛选能够校正flo8缺失株侵入生长缺陷的基因,分离得到一个与酿酒酵母蛋白磷酸酯酶甲基酯酶PPE1同源的基因,命名为CaPPE1.CaPPE1的基因编码区全长1083bp,推测编码一个361氨基酸的蛋白.在单倍体酿酒酵母中,CaPPE1基因的表达可以部分回复flo8缺失株的侵入生长缺陷,但是在MAPK途径缺失株中不能进行侵入生长.在双倍体酿酒酵母中,CaPPE1基因的表达可以部分激活MAPK途径成员缺失株的菌丝生长缺陷,但却只能在flo8缺失株中产生微弱的激活作用.结果表明CaPpe1在酿酒酵母的假菌丝生长和侵入生长中参与的信号转导途径不同.     

青蛙心肌细胞膜在调节肌浆钙离子浓度中所起作用的定量考虑

在骨胳肌兴奋-收缩耦联过程中,肌浆钙离子浓度主要由肌浆网系调节。青蛙心肌细胞的肌浆网系不发达,没有横管,且细胞直径很小,因此肌浆钙离子浓度很可能由发生在肌膜上的过程调节。本文从定量角度验证这一设想的可能性。假定青蛙心肌细胞兴奋时钙离子顺浓度差从细胞外跨膜扩散入细胞使肌浆钙浓度升高,又经肌膜上类似载体作用的主动过程将钙离子排出细胞,由此计算静息蛙心肌在某一频率的重复刺激下肌浆钙离子浓度随刺激次数的变化以及对不同刺激频率当收缩张力达稳态时肌浆内钙浓度值。利用肌肉稳态收缩张力和细胞内钙离子浓度之间已知的单值关系可以看到,计算结果同实验记录的蛙心肌稳态张力与刺激频率间的“阶梯”关系符合得很好,说明青蛙心肌细胞膜在调节肌浆钙离子浓度中起决定作用这一想法从定量角度考虑也完全是可能的.