低温冻存对骨髓基质细胞生物学特性的影响

目的：探讨低温冻存对骨髓细胞和贴壁基质细胞生物学特性的影响。方法：取新鲜骨髓和经Dexter法培养14d的骨髓贴壁基质细胞(称“基质细胞”),经-196℃液氮冻存(前者称“冻存骨髓”,后者称“冻存基质细胞”)2周,复温,再用Dexter法培养这些细胞,检测细胞增殖、细胞形态、细胞化学染色、细胞表面抗原及基质细胞支持另一骨髓造血细胞形成的鹅卵石造血区(CAFC),长期培养起始细胞(LTCIC)的变化,比较冻存对骨髓细胞和基质细胞生物学特性的影响。结果：生长特性：冻存骨髓比新鲜骨髓、冻存基质细胞比新鲜基质细胞培养后融合成片的时间延迟,细胞增殖数比也有减低。细胞成分：冻存骨髓比新鲜骨髓形成的成纤维细胞、内皮细胞比率下降,而巨噬细胞和脂肪细胞比率升高,冻存基质细胞上述现象更明显：冻存后含凋亡小体的细胞在骨髓细胞和基质细胞内均有增加。细胞表面抗原：冻存骨髓、冻存基质细胞CD14、HLA-DR抗原表达百分率比新鲜骨髓、新鲜基质细胞高,CD45、CD33反之。支持造血：冻存前后骨髓和基质细胞支持形成的CAFC和LTC-IC,生长良好,无显著差异。结论：骨髓细胞和经培养生成的贴壁基质细胞,经冻存和复温,生物学特性有一定变化,但仍可以保留良好的支持造血重建功能。     

融合热释放对低温冷冻人骨髓细胞的核酸与酶类活性的影响

本文用定性定量组织细胞化学方法,对冻前及不同降温条件冻存的人骨髓细胞的 DNA、碱性磷酸(ALP)、过氧化物酶(POX)活性进行测定。在程序降温过程中,没有消除融合热的骨髓细胞的 DNA、ALP、POX 活性均显著下降。消除融合热后,冻存骨髓细胞 DNA 活性没有改变,ALP、POX 活性略有下降。因而,融合热的释放是骨髓细胞生物活性下降的重要因素。     

冷冻保护剂DMSO对人骨髓细胞部分化学成份的影响

冻存前的多数骨髓细胞质内充满了深蓝色的POX反应颗粒,棕黄色的ANAE反应颗粒及粉红色的糖原颗粒。用5％和20％BMSO作为低温保护剂于液氮中冻存7天的骨髓细胞含破碎细胞成份较多,完整细胞内POX、ANAE及糖原反应均弱。用10％DMSO作为低温保护剂冻存的骨髓细胞中糖原、ANAE反应减弱不明显,POX反应强度略增加。用MPV-Ⅱ型显微分光光度计对上述样品进行定量测定的结果显示5％、20％DMSO低温冻存组骨髓细胞三种化学成份含量均明显降低,10％DMSO低温冻存组骨髓细胞中糖原、ANAE含量均降低,POX含量稍有增加。结果表明10％DMSO对骨髓细胞某些化学成份影响较小。     

造血细胞活力冷冻损伤的可恢复性

人骨髓冻存后其造血祖细胞活力有一定程度下降,本研究对这种下降的可逆性作了初步观察。结果发现,用双层法和单层法作CFU-GM培养时,未冻存骨髓集落产率相近,冻存骨髓双层法的CFU-GM产率高于单层法。骨髓细胞用20％FM-CM、PHA-LYCM、PHA-PMCM预孵育2h后,分别测定其CFU-GM、BFU-E与CFU-Mix,发现这种孵育过程对未冻存骨髓的集落产率无明显影响,而冻存骨髓的集落产率在孵育后可升高(GEMmeg除外)。说明骨髓造血祖细胞对冻存的损伤反应不均一,部分受损细胞在一定条件下可以恢复其增殖活力。这对于用冻存骨髓作骨髓移植可能有一定意义。     

BALB/C小鼠杂交瘤细胞冻存初探

自从Polge(1949)用甘油作为保护剂成功的冻存了Hela和L细胞以来,细胞冻存技术已日趋完善。本文对细胞株的冻存分别采用-70℃冰箱和常用的液氮深低温的方法。定期复苏,测定抗体效价,最后作染色体比较,至今已一年多,其结果令人满意。现将结果简要报告如下。方法1.细胞冻存:选择生长旺盛期,形态良好的细胞,按每ml细胞冻存液内含活细胞约1×106个,每支冻存管1ml。细胞冻存管置-20℃冰箱内15小时左右,分别放入液氮和-70℃冰箱内。经不同时期后取出作复苏及抗体效价比较。2.细胞复苏:取出冻存管,迅速浸入37℃水浴中,在1分钟内解冻后转种到已预制…     

卵巢组织冻存与移植生育力保存的应用现状与研究进展

年龄增长、疾病以及抗肿瘤治疗等均可能会造成女性生育力的下降甚至丧失。随着诊疗技术的发展,癌症死亡率逐渐下降,因此患者的生育力保存需求较前增加。胚胎冻存、卵母细胞冻存和卵巢组织冻存是目前常用的女性生育力保存方式。卵巢组织冻存与移植至今仅有20余年历史,现已成为临床上具备医学指征的生育力保存方式,有助于重建患者的内分泌和生育功能,已有超200多例患者通过此技术成功完成生育。为提高冻存卵巢组织再移植的安全性,现有研究将卵母细胞体外成熟技术、人工卵巢技术与之相结合,避免携癌风险高的冻存卵巢组织移植后的癌症复发风险。较多的研究均已证实了卵巢组织冻存与移植技术的有效性和安全性。尽管卵巢组织冻存与移植技术得到了快速发展,但是该技术仍面临如何通过减少卵泡储备损失进而延长卵巢组织移植后有效性等挑战,尚需要更多的基础和临床研究促进卵巢组织冻存和移植技术的进步与发展。     

斑马鱼精子冻存与复苏实验方法与流程

斑马鱼是研究胚胎发育及其遗传机制的重要模式脊椎动物。目前人们已经积累了大量的突变体和转基因鱼系, 如何安全、妥善地长期保存这些品系是每一个研究斑马鱼的实验室都会面临的问题。精子冻存与复苏技术是目前最为简单有效的一种长期保存斑马鱼遗传品系的方法。应用这一技术不仅可以节省大量的鱼房空间与人力、物力, 使鱼系的使用与保存更加灵活和持久, 更重要的是能够防止珍贵鱼系的意外丢失, 为鱼系保种提供额外的保障。这类方法一般是通过体外挤出精子或研磨精巢获取新鲜的精子, 用适量的冻存液混匀后, 分装保存在液氮罐中。需要时可以随时通过体外授精的方法使精子复苏。经过30年的发展, 随着冷冻保护剂的不断改良和冻存与复苏条件的不断优化, 斑马鱼精子冻存与复苏技术已逐渐成熟。文章简单回顾了斑马鱼精子冻存与复苏技术的历史与发展, 并重点介绍本实验室自2005年以来常规使用的斑马鱼精子冻存与复苏的方法及具体流程。
补充资料 ：冻存与复苏实验指南 [视频]     

美洲鲥雄性生殖细胞冷冻保存及移植

采用分离细胞冻存和组织块直接冻存2种方法, 进行美洲鲥(American shad, Alosa sapidissima)精巢细胞的长时间冷冻保存(>250d), 并比较分析2种不同冻存方法对美洲鲥雄性生殖细胞的冻存效果。解冻复苏后用Hochest33342和PI共染细胞核, 分析统计各期雄性生殖细胞的存活率, 结果显示组织块冻存方法所得精原干细胞和精母细胞的存活率明显高于分离细胞冻存的; 而精细胞及其他细胞存活率在2种方法间无显著差异; 特别是, 镜检发现组织块冻存方法所得精子存活率高达93.83%, 说明此冻存方法能同时高效地冻存美洲鲥各期生殖细胞, 包括成熟的精子。同时, 将组织块冻存的美洲鲥生殖细胞用PKH26染色标记后移植到出苗第1天的斑马鱼仔鱼中, 在细胞植入后5d仍能在受体中检测到供体细胞, 且有部分供体细胞能与内源生殖细胞共定位, 表明经过长时间冷冻保存的美洲鲥生殖细胞仍具有生殖细胞特性, 且能整合到斑马鱼受体性腺原基。研究结果为进一步开展美洲鲥, 或其他洄游性鱼类的生殖细胞发育、培养及种质资源保存等研究工作奠定了技术理论基础。     

深低温冻存组织工程化软骨在关节软骨缺损修复的应用

目的：探讨经深低温冻存组织工程化软骨修复关节软骨缺损的可行性。方法：分离收集3周龄新西兰大白兔关节软骨细胞进行体外培养,接种于PGA三维支架材料上,复合物体外培养1周后冻存,冻存1个月后解冻、复苏及体外培养,1周后接种于已建立的双侧兔膝关节软骨缺损模型的膝关节软骨缺损处,并设对照组。分别于手术后4周、8周、12周行大体标本及组织观察。结果：大体观察结果表明,实验组与对照组缺损处均由软骨组织修复;组织学观察可以见到实验组和对照组关节软骨缺损处有密集的软骨细胞,均有软骨生成及基质分泌,两组差异无统计学意义。结论：应用深低温冻存组织工程化软骨修复关节软骨缺损的方法是有效可行的,为其进一步临床应用提供了实验依据。     

冻存对自发性高血压大鼠精子顶体功能的影响

应用金霉素(CTC)荧光检测、精子穿卵试验和项体酶β-D-半乳糖苷酶活力测定等方法检测冻存对大鼠精子顶体的影响。CTC荧光反应显示,与未冻存精子比较,冻存后精子顶体反应的类型发生改变,AR型(发生了顶体反应)精子比例明显下降,冻存前为68.6％,冻存后为13.4.％,但是获能精子的比例未发生明显变化(92.6％对90.8％)。与未冻存的精子相比,冻存组精子的穿卵试验的受精指数下降(23.4±7.02对10.2±3.95),而且冻存后精子顶体酶——β-D-半乳糖苷酶活力明显下降(9.39±1.98对4.50±1.40)。结果表明冻存后精子的顶体功能受到较明显的破坏。实验结果为今后针对性地改进大鼠精子的冻存方法,改善大鼠精子的冻存保护剂提供实验和机制上的依据。     

不同冻存条件对甘蔗原生质体活力和再生能力的影响

为了获得活力高和再生能力强的甘蔗原生质体,该文对甘蔗原生质体的冻存液浓度、冻存温度和冻存部位进行了研究。结果表明:(1)不同的冻存液、不同的冻存温度和不同的取材部位原生质体冻存后复苏对甘蔗原生质体的活力影响有显著差异性,三个冻存液组合比较,在组合2(70%培养基+20%血清+10%DMSO),冻存30 d后复苏活力最强,高达72%;冻存90 d内复苏,-196℃液氮和-80℃冰箱冻存,甘蔗原生质体的活力差异不显著,活力均在75%以上,但90 d冻存后复苏,-196℃液氮冻存后复苏比-80℃冰箱冻存冻存后复苏原生质活力强;不同取材部位比较,幼叶冻存30 d后复苏所得原生质体活力较高(达79. 2%),茎尖冻存30 d后复苏所得原生质体活力仅为42.7%。(2)不同的冻存液和不同的冻存温度,细胞第一次启动分裂和形成细胞团的时间差异不显著,一般培养5～6 d,细胞壁基本形成完整,培养6 d后,细胞启动分裂,培养15 d后形成细胞团。不同的材料部位相比较,茎尖酶解所得原生质体再生能力最强,较幼叶酶解原生质体,形成细胞壁的时间早3 d,第一次分裂时间早2 d。     

两种不同冻存保护剂对细胞冻存效果的比较

为比较甘油和二甲基亚砜这两种细胞冷冻保护剂对同一种细胞冷冻保存的效果,通过甘油和二甲基亚砜分别与血清、基础培养基的不同配比,进而比较二者对肿瘤细胞的冻存效果,并且分别探索出二者哪种用于细胞冻存效果更好和各自最佳冻存效果的比例。本文研究成果将为细胞冻存提供更明确的冻存方法。     

一种无血清冻存液在猪胎儿成纤维细胞上的应用研究

在猪胎儿成纤维细胞(porcine fetal fibroblasts, PFF)冻存过程中,血清品质常常制约着细胞的冻存效果。为了解决这个问题,本研究旨在开发一种无血清冻存液应用于猪胎儿成纤维细胞冻存。用3种不同冻存液冻存猪胎儿成纤维细胞,每种冻存10管。冻存30 d后复苏细胞,测定冻存细胞存活率,细胞增殖活力以及电转后细胞活性。结果显示:自制无血清细胞冻存液,冻存猪胎儿成纤维细胞后存活率达95.33%;细胞增殖活力以及电转后细胞活性均显著高于标准胎牛血清冻存液(p<0.05),与特级胎牛血清冻存液效果相当(p>0.05)。因此,自制冻存液冻存猪胎儿成纤维细胞效果稳定,能够替代含血清冻存液,有良好的推广应用前景。     

光镊捕获的单个解冻人血红细胞的拉曼光谱研究

红细胞的冰冻与解冻的实施为血液的长期保存提供了有效的方法。在过去的几十年中,红细胞冻存有过数种方法,其中高甘油冻存法比较普遍,因而用此方法保存红细胞是否对红细胞产生了影响及产生了什么影响是值得研究的。作者利用激光光镊拉曼光谱系统,通过拉曼光谱对冻存人血红细胞进行研究;结果显示,红细胞冻存前后的拉曼光谱有一定的变化,解冻提取后也产生了一定的变化,这些变化主要体现在对应拉曼光谱的位置和强度上。研究结果对进一步研究红细胞的冻存具有一定的参考价值。     

人外周血淋巴细胞长期冻存后结构和功能的研究

从肝素和 ACD 抗凝血中分离的淋巴细胞,用 DMSO 或甘油作为低温保护剂,保存在液氮内,在冻前和冻后10、20、40和365天时分别检测细胞的功能活性。当冻存液内含10%DMSO 和40%人 AB 血清时,冻存效果最好。冻存一年时,淋巴细胞的回收率和存活率均大于92.5%。冻存细胞的 E 和 ME 花环形成率、ANAE 阳性率、LDH 同工酶谱和细胞超微结构与冻前相比,均无明显变化,冻存细胞的淋转能力虽在冻存初期有所下降,以后就处于稳定状态。     

人骨髓细胞长期低温保存的研究

细胞保存有重要价值 ,骨髓细胞保存的价值主要在于为骨髓细胞移植提供可靠保证。传统的骨髓细胞低温保存是采用二甲基亚砜为保护剂 ,以慢速率“二步”法降温至 - 80℃ ,直接投入液氮。理论上讲 ,细胞在这种温度下 ,一切代谢停止 ,可以永远保存。本文对 2 0例人骨髓细胞持续低温保存 15年的情况进行分析。1　材料与方法(1)材料①骨髓冻存与复温　在局麻下采集骨髓 (恶性淋巴瘤骨髓象正常 12例 ,急性白血病完全缓解 8例 ) ,肝素抗凝 (4 0ｕ/ｍｌ) ,采集平均量 6 2 0 (385～ 880 )ｍｌ,4℃下 ,自然沉降 6 0ｍｉｎ ,除去血浆及部分红细胞 ,浓集…     

乳猪肝细胞短期培养后的低温保存

本文对乳猪肝细胞短期培养后冻存法和直接冻存法进行比较。采用改良原位两步胶原酶灌注法分离乳猪肝细胞,将肝细胞接种到含10％DMSO、激素、生长因子和10％NBS的RPM1 1640培养基中,用阶段性冻存法保存肝细胞,分别对直接冻存和培养后冻存10天、20天复苏的肝细胞进行培养,动态观察其活率和功能。研究结果表明各组复苏后的肝细胞均保持较高的活率;短期培养后冻存组肝细胞活率、G-6-Pase活性、白蛋白和葡萄糖合成功能及安定转化能力均较直接冻存组为高;LDH活性低于直接冻存组;冻存时间的长短对其白蛋白、尿素和葡萄糖合成功能有一定影响。因此,短期培养后冻存法较直接冻存法为好。     

深低温冻存组织工程化软骨在喉狭窄功能重建中的应用

目的:探讨低温保存组织工程化软骨在喉狭窄功能重建中的应用价值。方法:取3周龄新西兰兔关节软骨细胞,体外培养,取第2代对数生长期培养细胞,制成细胞悬液,调整软骨细胞悬液浓度约为5×107个/ml左右,接种于PGA三维支架材料上,复合物体外培养2周后冻存,冻存6个月后解冻复苏,再行体外培养观察,2周后接种于已建立的喉甲状软骨缺损模型的软骨缺损处,并设对照组。术后12周取材,行大体及组织学观察。结果:经低温冻存的组织工程化软骨生长良好,组织学观察有软骨形成,与周围软骨组织结合紧密,与非冻存组相比差异无统计学意义。结论:深低温冻存对组织工程化软骨的生物活性无明显的影响,低温冻存的组织工程化软骨可用于喉软骨缺损的修复,重建喉功能。     

深低温冻存组织工程化软骨在喉狭窄功能重建中的应用

目的：探讨低温保存组织工程化软骨在喉狭窄功能重建中的应用价值。方法：取3周龄新西兰兔关节软骨细胞,体外培养,取第2代对数生长期培养细胞,制成细胞悬液,调整软骨细胞悬液浓度约为5×10^7个／ml左右,接种于PGA三维支架材料上,复合物体外培养2周后冻存,冻存6个月后解冻复苏,再行体外培养观察,2周后接种于已建立的喉甲状软骨缺损模型的软骨缺损处,并设对照组。术后12周取材,行大体及组织学观察。结果：经低温冻存的组织工程化软骨生长良好,组织学观察有软骨形成,与周围软骨组织结合紧密,与非冻存组相比差异无统计学意义。结论：深低温冻存对组织工程化软骨的生物活性无明显的影响,低温冻存的组织工程化软骨可用于喉软骨缺损的修复,重建喉功能。     

低浓度二甲基亚砜保护SSMC7721细胞冻存后活力

目的研究二甲基亚砜作为冻存保护剂对SSMC7721细胞冻存复苏后细胞生长相对活力和凋亡的影响。方法选择传代培养处于对数生长期SSMC7721细胞,体积分数2%、5%、10%和20%DMSO分别冻存10d、30d后复苏,采用倒置显微镜形态学观察、MTT法测定细胞相对活力、流式细胞仪检测细胞凋亡,综合分析不同浓度DMSO冻存不同时间复苏对SSMC7721的影响。结果各浓度DMSO冻存SSMC7721对细胞生长和凋亡均有影响。20%DMSO对SSMC7721细胞影响明显,细胞培养不易贴壁逐渐脱落,浓度低于5%时,细胞生长状态良好;10%和20%DMSO细胞相对活力急剧下降;随着DMSO浓度增加和冻存时间延长,细胞凋亡率明显上升,存活率明显下降,5%DMSO冻存的凋亡率10.24%,20%DMSO冻存的凋亡率93.49%。结论 2%~5%DMSO冻存肝癌SSMC7721细胞,复苏后培养有较好的细胞相对活力,能有效减少细胞凋亡,起到的冻存保护剂作用。