小鼠胎肝造血基质细胞系对CFU—GM生长的调控作用

利用本实验室建立的小鼠胎肝造血基质细胞系(MFLSC)研究了造血基质细胞对粒-巨噬系造血祖细胞(CFU-GM)生长的影响。实验结果表明,MFLSC对CFUGM集落的生成有双向调控作用,即既有刺激性作用,又有抑制性影响。这种调控有体液因子之中介,亦有细胞与细胞间近距离的效应。文中讨论了MFLSC双向调控CFUGM生长的意义及其机理。     

小鼠胎肝和骨髓造血基质细胞贴壁层对红系祖细胞生长的影响

本实验以Dexter培养体系作小鼠胎肝和骨髓造血基质细胞贴壁培养。在所获的基质细胞贴壁层上作红系造血祖细胞集落培养,观察两种来源造血基质细胞对红系集落生长的影响。实验结果表明,胎肝造血基质细胞贴壁层能明显促进早期红系造血祖细胞(BFU-E)形成集落,却不明显影响晚期红系造血祖细胞(CFU-E)的生长。成年小鼠骨髓造血基质细胞贴壁层对BFU-E和CFU-E均有刺激生长的作用;但对前者生长的刺激性影响较胎肝造血基质细胞贴壁层为弱。造血基质细胞贴壁层对红系集落生长的促进作用主要是通过体液因子实现的,细胞间短距离调节的影响亦不能除外。     

胎肝细胞输注与全胚注射液治疗再生障碍性贫血的机理探讨

本文对胎肝细胞输注或全胚注射液治疗再生障碍性贫血的可能机理作了一些实验性探讨。研究结果表明: 1.胎肝细胞在培养或解体过程中释放某些刺激红系造血的因子,有利于已经损伤的造血功能的恢复。 2.对正常小鼠注射无细胞胎肝制剂或全胚注射液后,骨髓红系细胞的分裂指数明显升高,骨髓中粒/红比值趋于降低,反映了骨髓中红系细胞增生活跃的状态。 3.对正常小鼠注射无细胞胎肝制剂或全胚注射液后,外周血网织红细胞和腹腔巨噬细胞的吞噬指数趋于平行增高,其增高程度和持续时间随注射次数的增加而加强。 小鼠注射无细胞胎肝制剂或全胚注射液后,巨噬细胞吞噬指数的增加,反映了巨噬细胞激活,这种作用除了提高机体的非特异性免疫功能,增强机体的抵抗力外,还可能通过巨噬细胞的活化,直接或间接地调控机体红系细胞的增殖,因而,对巨噬细胞在造血调控中的作用以及它在再生障碍性贫血发病机理研究中的意义提出了讨论。     

小鼠胎肝基质细胞体外扩增骨髓来源的LTC-IC

基质细胞是胎肝造血微环境的主要成分,参与造血干/祖细胞的自我更新、增殖分化的调控。为了研究小鼠胎肝基质细胞在造血微环境中的功能,采用转染SV40大T抗原基因的方法建立了小鼠胚胎期第12.5天（Embryonic-day 12.5, E12.5d）胎肝基质细胞系A4、B3,并进一步鉴定基质细胞系的一般细胞生物学特性和造血支持功能。结果：A4、B3为细胞形态、生长行为以及表面分子表达不同细胞系,二者均可维持骨髓源长期培养启动细胞（Longterm cultureinitiating cell,LTC-IC）至少4周并且有不同程度的扩增LTC-IC能力,其中B3扩增LTC-IC的能力是A4的83倍。外源性细胞因子组合SCF+IL-3+IL6+Epo在本实验体系中不影响LTC-IC数量的维持和扩增。暗示E12.5d胎肝造血微环境中基质细胞的功能是不同的,其机制有待进一步研究。     

小鼠胎肝红系细胞在分化过程中形态学观察及时序性表达分析

小鼠胎肝是小鼠发育早期主要的造血器官,红系细胞在胎肝造血过程中形态特征和组成成分等方面发生了明显变化。根据红系细胞体积的变化,利用Countstar细胞计数仪对小鼠E12．5-E17．5胎肝中直径8-14岬细胞进行数量统计,再结合观测到的红系细胞的形态特征和血红蛋白表达量的不同,将E9．5．E17．5胎肝中的细胞分为10类。统计结果显示,随着胎肝造血系统的发育,哺乳类红系细胞在终末分化时出现细胞体积减小、细胞核固缩、排核和血红蛋白表达量增加等时序性变化。红系细胞表面特异标志Terll9和CD71在EryD中高表达而在成体骨髓细胞和外周血细胞中表达较低的结果表明胎肝中红系细胞具有较高的分化能力。这些数据为研究红系分化、克隆红系分化相关基因及探讨红白血病发生的机制提供了理论依据。     

内皮和造血系统特异性敲除Rictor基因对胎肝造血的影响

目的:研究Rictor基因对胚胎发育过程中胎肝造血的影响。方法:利用Cre-LoxP基因敲除系统,特异性在小鼠内皮(VEC-Cre)和造血(Vav1-Cre)系统敲除Rictor基因;通过流式细胞术分析特异敲除Rictor基因后小鼠胚胎第15 d胎肝中的各系细胞比例的变化,并进一步分析造血干细胞的变化。结果:利用VEC-Cre和Vav1-Cre小鼠敲除Rictor基因后,胎肝中各系细胞比例均有所减少,B细胞比例的减少较为明显,造血干细胞比例也明显减少。结论:Rictor基因敲除损害胎肝组织中造血干细胞的产生和各系细胞的分化。     

胎肝造血研究进展

本文着重比较胎肝与成年骨髓CFU-S及红系造血特征的异同.胎肝造血以红系占优势,但也存在生成粒、巨噬系、巨核系及淋巴细胞的能力.     

人卵黄囊造血的探讨

采用卵黄囊组织切片、涂片的形态学、细胞化学染色、造血干/祖细胞体外培养及CD_(34)单克隆抗体免疫荧光检测等方法研究表明:人卵黄囊中存在造血岛,造血岛内由于造血微环境的特点致使此期造血主要向红系分化。血岛中检测出CD_(34)~ 细胞,比例高于胎肝及成人骨髓,干/祖细胞于体外培养形成红系集落。结论:人胚胎期造血源于卵黄囊。     

天然杀伤细胞在受照射小鼠中的造血调控作用

研究了天然杀伤（ＮＫ）细胞对受致死剂量γ线照射的同系小鼠的造血调控作用。ＡＭＳ／５小鼠经９Ｇｙγ线全身照射后立即经尾静脉注射ＮＫ细胞（５×１０５）,可明显提高受照小鼠３０ｄ活存率,照后８ｄ小鼠骨髓中ＣＦＵ－ＧＭ数量明显高于对照和脾细胞注射组,照射后３０ｄ,ＮＫ细胞注射组活存小鼠的骨髓有核细胞数和ＣＦＵ－ＧＭ数已恢复到正常的７６％─９６％。病理组织学观察显示,输注ＮＫ细胞可使小鼠骨髓、脾脏的组织损伤程度减轻,造血功能增强,表现为造血灶数增多,造血细胞功能活跃,核分裂相增多,且涉及红系、粒系、巨核细胞系造血。ＮＫ细胞可能通过直接与造血干细胞相互作用或改善造血微环境等促进“内源性”造血功能,从而发挥对造血的正调控作用。提示ＮＫ细胞在小鼠造血功能的平衡维持中起重要作用。     

人胎肝基质细胞培养上清液中造血生长因子的分析

采用人胎肝造血基质细胞的体外液体培养技术,结合造血干细胞和祖细胞的体外测试方法,研究了造血基质细胞所释放的造血生长因子与造血干细胞和祖细胞之间的相互作用。结果表明,在适宜的条件下,人胎肝造血基质细胞可在体外传代培养达100d之久。培养过程中,对不同时间收集的培养上清液进行测试的结果表明,这些贴壁细胞可以不断地释放多种造血活性物质。在100d培养过程中,上清液中始终都可以检出CFU-S增殖刺激物活性。培养第24天的上清液中还可检出BPF和GM-CSF活性。这些造血活性物质对CFU-S的生理状态和祖细胞的增殖与分化有着深刻的影响。但是在培养上清液中未检出IL-3样活性物质。     

淋巴细胞对造血干细胞增殖的放大作用

小鼠的胸腺细胞对多向性造血干细胞(CFU-S)的增殖有明显的“放大”。作用,而这个“放大”作用的实现,是胸腺细胞与骨髓细胞之比例达到500∶1时为最好。小鼠胸腺细胞对多向性造血干细胞的分化也有明显的影响;本实验表明首先出现红系分化的增强,然后再出现粒系分化的增强。被激活的胸腺及脾脏的淋巴细胞(T细胞)对CFU-S的增殖具有更强的“放大”作用。在去胸腺小鼠的实验中表明ConA对CFU-S没有直接的作用。ConA作用于胸腺等T淋巴细胞,被激活的T细胞再作用于造血干细胞。本实验初步表明,淋巴细胞对造血干细胞的激活作用,必须在完整的活的淋巴细胞与造血干细胞直接接触或接近下才能实现。     

Smad3基因剔除对小鼠造血功能的影响

研究Smad3基因剔除对小鼠造血功能的影响。实验小鼠分为 5组 ,每组有Smad3基因剔除小鼠(Smad3 - - )和其同窝孪生的野生型小鼠 (Smad3 + + )各 1只。小鼠的造血功能用 14天形成的脾结节 (CFU S1 4 )、多系祖细胞 (CFU GEMM)、粒 单系祖细胞 (CFU GM)、红系祖细胞 (BFU E)测定及外周血象、骨髓象等实验血液学指标来确定。每组小鼠取尾血作白细胞、红细胞和血小板计数 ,涂片作白细胞分类计数。将一侧股骨的骨髓冲出 ,制成单细胞悬液 ,计数其中有核细胞数 ,测定CFU GM、BFU E、CFU GEMM值。将每只小鼠的 4× 10 4个骨髓有核细胞 ,经尾静脉注入 3只 8～ 10周经致死量射线照射的同系雌性小鼠体内 ,测定 14天的CFU S。取一部分胸骨、肝脏、脾脏固定做病理切片 ,其余胸骨冲出骨髓 ,涂片作分类计数。结果Smad3 - - 小鼠外周血白细胞和血小板计数明显高于Smad3 + + 小鼠 ,红细胞数无显著差异。外周血白细胞分类结果也表明粒细胞显著增高。骨髓有核细胞数无显著差异 ,CFU GM显著增高 ,BFU E无显著差异 ,CFU GEMM明显减少 ,CFU S显著减少。病理形态学观察发现骨髓增生极度活跃 ,以粒系为主 ,肝脾无显著差别。骨髓涂片分类表明粒系增多 ,粒系 :红系比例增高。因此得出结论Smad3基因剔除使小鼠造血干祖细胞数目     

人类新型Krueppel类转录因子hBKLF的cDNA克隆、亚细胞定位及表达特征

人胎肝cDNA文库FLD4585克隆可能编码一种造血相关的转录因子,本文旨在从22周孕龄人胎肝中获得其编码基因的全长cDNA序列,分析其编码蛋白的功能域、基因组结构、染色体定位、亚细胞定位及表达谱特征。采用5′RACE方法获得FLD4585克隆全长;生物信息学方法确定hBKLF基因结构、染色体定位及功能域特征;GFP融合蛋白技术确定hBKLF亚细胞定位;Northern杂交、RT-PCR、Western印迹方法分析其表达谱。结果获得了Fld4585克隆编码的hBKLFcDNA全长序列,它含1810bp,编码345个氨基酸,与小鼠BKLF同源,C端含3个特征性C2H2结构的锌指,是KLF转录因子家族的新成员。HBKLF基因跨越33kb,含6个外显子和5个内含子,位于4号染色体4p15.2-p16.1。GFP-hBKLF融合蛋白在COS-7细胞中呈细小点状分布于核内,核仁区无分布。HBKLF含有两个转录本,大小为4.4kb-7.5kb和1.35kb-2.4kb。大转录本在成人及胎儿组织广泛表达,小转录本在外周血白细胞、肝脏和骨髓表达量最高,红系和粒系细胞均表达hBKLF。HBKLF表达量随肝脏发育成熟而下降,随红系、粒系成熟而升高。以上研究提示hBKLF可能是一种在体内广泛发挥作用的转录因子,在造血的调控中可能有重要作用。     

人类新型Krüppel类转录因子hBKLF的cDNA克隆、亚细胞定位及表达特征

人胎肝cDNA文库FLD4585克隆可能编码一种造血相关的转录因子,本文旨在从22周孕龄人胎肝中获得其编码基因的全长cDNA序列,分析其编码蛋白的功能域、基因组结构、染色体定位、亚细胞定位及表达谱特征.采用5′RACE方法获得FLD4585克隆全长;生物信息学方法确定hBKLF基因结构、染色体定位及功能域特征;GFP融合蛋白技术确定hBKLF亚细胞定位;Northern 杂交、RT-PCR、Western印迹方法分析其表达谱.结果获得了FLD4585克隆编码的hBKLF cDNA全长序列,它含1810 bp,编码345个氨基酸,与小鼠BKLF同源,C端含3个特征性C2H2结构的锌指,是KLF转录因子家族的新成员.hBKLF基因跨越33 kb,含6个外显子和5个内含子,位于4号染色体4p15.2～p16.1.GFP-hBKLF融合蛋白在COS-7细胞中呈细小点状分布于核内,核仁区无分布.hBKLF含有两个转录本,大小为4.4 kb～7.5 kb和1.35 kb～2.4 kb.大转录本在成人及胎儿组织广泛表达,小转录本在外周血白细胞、肝脏和骨髓表达量最高,红系和粒系细胞均表达hBKLF.hBKLF表达量随肝脏发育成熟而下降,随红系、粒系成熟而升高.以上研究提示hBKLF可能是一种在体内广泛发挥作用的转录因子,在造血的调控中可能有重要作用.     

单克隆来源的小鼠胎肝HPP-CFC肝上皮分化潜能的研究

为研究胎肝中造血和肝上皮发育的关系,建立了小鼠胎肝高增殖潜能集落形成细胞（HPP-CFC）培养体系,并进行了单克隆培养以及诱导分化实验.在造血和肝诱导因子的共同作用下,对单克隆来源的HPP集落细胞向造血和肝上皮细胞进行诱导分化,采用透射电镜(TEM)、巢式RT-PCR、细胞免疫荧光检测,从细胞形态、超微结构、上皮细胞分化标志等方面对分化后的细胞进行检测.检测结果显示诱导后的部分细胞具有肝细胞特异性的超微结构并不同程度的表达白蛋白（ALB）、甲胎蛋白（AFP）、细胞角蛋白（CK8,CK18）等肝上皮分化标志,同时还表达间质标志α-SMA和血管内皮细胞标志Flk-1.免疫磁珠分选表明：胎肝来源的HPP-CFC主要来自于CD45⁺细胞,CD45^-细胞不具有形成造血克隆的能力.在肝上皮细胞分化潜能上,流式分选获得的CD49f⁺/Sca-1⁺细胞与未分选细胞无明显差异.该模型的克隆源性通过细胞混合实验进行证明.研究结果表明,改进的胎肝来源的HPP-CFC可能代表了一个新的造血向肝上皮细胞分化的单克隆模型,为研究胎肝中造血和非造血细胞的发育关系提供了一个新的切入点.     

氧化苦参碱对骨髓来源细胞生长的双向调节作用

目的:观察氧化苦参碱(oxymatrine,OMT)对骨髓来源细胞增殖的影响.方法:应用MTr比色法、流式细胞仪检测法、集落形成法和免疫细胞活性测定等方法,检测OMT对白血病细胞K562的抑制作用;骨髓造血干细胞的集落形成实验和脾细胞对肿瘤细胞的杀伤的生物活性试验,检测OMT对小鼠免疫和造血的影响.结果:(1)不同浓度的OMT可明显抑制白血病细胞K562细胞的增殖、集落形成,导致细胞凋亡(P＜0.05),且作用呈浓度依赖性.(2)OMT可以促进小鼠骨髓粒系造血,且在0.2475 mg/mL时达到峰值.(3)OMT可抑制小鼠的免疫功能.结论:OMT可抑制白血病K562细胞的增殖并诱导其凋亡,同时抑制小鼠的免疫功能,促进小鼠骨髓CFU-GM的形成,表现出对骨髓来源细胞生长的双向调节作用.     

小鼠骨髓内皮细胞无血清条件培养液及其超滤组分对粒巨噬系祖细胞生长的影响

本研究通过传代培养小鼠骨髓内皮细胞系细胞,收集无血清条件培养液(mBMECCM),将其作多级串联超滤,获得分子量大于10、3～10、1～3、05～1kD和小于05kD超滤组分。进行粒巨噬系造血祖细胞集落形成试验,检测了它们的作用。mBMECCM和3～10kD组分对粒巨噬系祖细胞(CFUGM)生长未见明显影响,而分子量大于10kD和05～1kD组分促进CFUGM的增殖,分子量1～3kD和小于05kD组分则抑制CFUGM的增殖。这4种超滤组分对CFUGM生长的效应均有剂量依赖性。这些结果提示,在体外培养条件下,小鼠骨髓内皮细胞分泌若干种活性成分,分别对CFUGM的生长起促进或抑制作用     

胎肝造血干细胞的移植特性

胚胎发育中,肝脏是一个重要的造血器官。近年来胎肝移植的临床应用重新引起了人们的关注。本文应用染色体的 C-带染色法研究了小鼠骨髓和胎肝造血干细胞在照射受体小鼠中的增殖能力与相互间的竞争作用。实验结果表明胎肝造血干细胞在成年骨髓中的植入率比较同样条件下的成年骨髓造血干细胞低,但胎肝造血干细胞比较成年骨髓造血干细胞具有更强的自我更新或增殖能力。在同种胎肝造血干细胞移植中,为了降低同种移植抗力,提高移植的胎肝造血干细胞在受体中的耐受性,移植前对受体作适当的免疫抑制处理是必要的。因此,克服个体发育屏障和移植免疫屏障是提高同种胎肝造血干细胞移植效果中两个重要的研究课题。     

Tet2调节骨髓间充质干细胞功能

Tet2(Tet家族成员2)在DNA去甲基化修饰、表观遗传调控及骨髓造血中起着重要作用。笔者课题组前期研究发现,随着年龄增长,Tet2敲除小鼠逐步发展为淋系白血病和髓系白血病。但Tet2在骨髓微环境中的作用仍不清楚。进一步研究发现,Tet2敲除的骨髓间充质干细胞(Mesenchymal stem cells,MSC)更多处于G2/M分裂期,其细胞分裂时间缩短,生长速度加快。长周期培养-起始细胞实验表明,Tet2敲除的MSC支持造血干细胞扩增和髓系分化的能力增强。通过点杂交实验发现,Tet2敲除后,骨髓细胞DNA总甲基化水平升高。对Tet2缺失的骨髓细胞进行甲基化测序,结果表明:基因组转录调控区域等多个功能性结构域的甲基化水平明显升高。同时,敲除Tet2的MSC分泌IL-8、IL-18等炎性细胞因子的能力下降;敲除Tet2的MSC更多分泌促进造血干细胞髓系分化的GM-CSF和CCL-3等细胞因子。Tet2可以影响间充质干细胞造血支持作用,进而调节造血。     

人类新型Krppel类转录因子hBKLF的cDNA克垄、亚细胞定位及表达特征

人胎肝cDNA文库FLD45 85克隆可能编码一种造血相关的转录因子 ,本文旨在从 2 2周孕龄人胎肝中获得其编码基因的全长cDNA序列 ,分析其编码蛋白的功能域、基因组结构、染色体定位、亚细胞定位及表达谱特征。采用 5′RACE方法获得FLD45 85克隆全长 ;生物信息学方法确定hBKLF基因结构、染色体定位及功能域特征 ;GFP融合蛋白技术确定hBKLF亚细胞定位 ;Northern杂交、RT PCR、Western印迹方法分析其表达谱。结果获得了FLD45 85克隆编码的hBKLFcDNA全长序列 ,它含 1810bp ,编码 3 45个氨基酸 ,与小鼠BKLF同源 ,C端含 3个特征性C2 H2 结构的锌指 ,是KLF转录因子家族的新成员。hBKLF基因跨越 3 3kb ,含 6个外显子和 5个内含子 ,位于 4号染色体4p15 2～p16 1。GFP hBKLF融合蛋白在COS - 7细胞中呈细小点状分布于核内 ,核仁区无分布。hBKLF含有两个转录本 ,大小为 4 4kb～ 7 5kb和 1 3 5kb～ 2 4kb。大转录本在成人及胎儿组织广泛表达 ,小转录本在外周血白细胞、肝脏和骨髓表达量最高 ,红系和粒系细胞均表达hBKLF。hBKLF表达量随肝脏发育成熟而下降 ,随红系、粒系成熟而升高。以上研究提示hBKLF可能是一种在体内广泛发挥作用的转录因子 ,在造血的调控中可能有重要作用