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1.
本文报导用地高辛标记核酸探针和分子斑点杂交技术检测轮状病毒基因重配株L-3株活疫苗中残余MA-104细胞DNA含量的方法。提取和纯化MA-104细胞DNA,将其AluI酶切片段用随机引物法引导DNA标记为探针。待检样品抽提核酸后点膜进行斑点杂交。此法灵敏度高,可检出0.14pg的DNA,特异性强,与非同源性DNA无杂交。用此法检测轮状病毒基因重配株L-3株制备的疫苗,MA-104细胞残余DNA含量低于14pg低于WHO限量标准,结果表明此重配株用于研制疫苗是安全的。 相似文献
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用聚合酶链反应(PCR)技术,制备了轮状病毒第9基因部分片段的地高辛标记的cDNA探针。DNA-RNA斑点杂交表明该探针具有轮状病毒A组的特异性,可检出10pgHRV-RNA。实验中选择了粪便标本提取核酸后点膜和粪便上清直接点膜进行斑点杂交,两种方法的结果一致;、同时将斑点杂交法与PAGE法的结果进行了比较。实验结果表明用PCR技术直接制备地高辛素标记的cDNA探针具有方便、快速、标记率高、特异性 相似文献
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用地高辛标记探针检测由传代细胞系生产的人用精制狂犬病疫苗,重组(CHO细胞)乙肝疫苗,出血热疫苗及痢疾多糖结合疫苗原液中残余DNA含量。结果表明,该方法特异性强,灵敏度高,可用于上述生物制品中残余DNA含量的检测。 相似文献
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地高辛标记Vero细胞DNA,并制备成DNA探针,以此探针进行点杂交,确定探针的工作浓度,特异性及灵敏度,并用此法监测Vero细胞狂犬病疫苗浓缩原液纯化工艺的Vero细胞DNA去除率,测定精制Vero细胞狂犬病疫苗成品中残余Vero细胞DNA含量,结果明显,该法特异性强,重复性好,快速简便,灵敏度高,检测值可达5pg/剂量,可用于精制ero细胞狂犬病疫苗纯化工艺的质量控制和半成品检定。 相似文献
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用^32P标记cDNA探针进行核酸斑点杂交检测马铃薯卷叶病毒(PLRV) 总被引:2,自引:0,他引:2
利用克隆的马铃薯卷叶病毒(PLRV)外壳蛋白(CP)基因cDNA,用切口平移法制成^32P标记探针,通过核酸斑点杂交,对马铃薯卷叶病毒RNA,提纯的马铃薯卷法病毒和感染PLRV的马铃薯茎、叶、声 相似文献
6.
PCR制备地高辛素标记的探针检测轮状病毒核酸 总被引:2,自引:0,他引:2
用聚合酶链反应(PCR)技术,制备了轮状病毒第9基因部分片段的地高辛标记的cDNA探针。DNA-RNA斑点杂交表明该探针具有轮状病毒A组的特异性,可检出10pgHRV-RNA。实验中选择了粪便标本提取核酸后点膜和粪便上清直接点膜进行斑点杂交,两种方法的结果一致;同时将斑点杂交法与PAGE法的结果进行了比较。实验结果表明用PCR技术直接制备地高辛索标记的cDNA探针具有方便、快速、标记率高、特异性强的特点,具有一定的应用前景。 相似文献
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《微生物学免疫学进展》2016,(2)
目的对地高辛标记DNA探针杂交法检测人用狂犬病疫苗(Vero细胞)DNA残留量进行适用性验证及应用。方法对地高辛标记DNA探针杂交法检测人用狂犬病疫苗(Vero细胞)DNA残留量进行特异性、灵敏度及稳定性验证,并应用该方法检测3批人用狂犬病疫苗(Vero细胞)的DNA残留量。结果地高辛标记探针的标记效率为0.1 pg。验证结果显示探针与非同源DNA无杂交;最低检测限度为1 pg;探针在-20℃放置7个月后,检测灵敏度仍可达到1 pg;3批人用狂犬病疫苗(Vero细胞)中残留DNA含量均符合《中国药典》规定质量控制标准。结论地高辛标记DNA探针杂交法特异性、灵敏度好,结果稳定,适用于人用狂犬病疫苗(Vero细胞)中Vero细胞DNA残留量的检测及疫苗生产过程和其成品的质量控制,对其他以Vero细胞为基质的病毒性疫苗质量控制具有借鉴意义。 相似文献
8.
热启动PCR快速制备地高辛标记探针 总被引:7,自引:0,他引:7
介绍了一种在热启动PCR中,以Dig-11-dUTP部分代替dTTP,从少量基因组DNA中快速制备大量的地高辛标记的探针的方法,此探针灵敏度达0.03pg,并只和相关的DNA特异杂交. 相似文献
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Digoxigenin标记核酸探针分子杂交技术探讨 总被引:1,自引:0,他引:1
Dig标记和检测试剂盒中的封阻试剂配制成0.05%、0.1%、0.3%、0.5%、0.7%、0.9%六种浓度,65~68℃温度时,溶解时间分别为10、15、20、35、40、45分钟;预杂交,在免疫测定中进行封阻,背景反应最小,其次是不预杂交,在免疫测定中进行封阻,再次是预杂交,在免疫测定中不封阻;标记探针保存在-20℃,至少可稳定18个月,同一探针重复使用三次可获得满意效果.以上结果表明,DigDNA标记和检测系统将代替~(32)p标记及其检测系统. 相似文献
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核酸分子杂交是基于核酸链间互补碱基对的特异性结合,测定核酸碱基顺序同源性的一种现代技术,是基因工程、分子遗传及医学诊断中常用的方法。该法较常规诊断法灵敏度高、特异性强,目前,已广泛应用于重组DNA的筛选、基因分祈、染色体基因定位及病毒病诊断等方面。 相似文献
11.
为制备用地高辛精(Digoxigenin,Dig)标记的酶氨酸羟化酶(TyrosineHydroxylase,TH)RNA探针,本研究用分子生物学技术重组质粒PGEMTHI,即分别将携带T7和Sp6启动子的PGEM-3zf质粒和携带TH基因的PKSTH质粒用限制性内切酶消化并行分离纯化,得到带T7和sp6启动子的DNA片段和TH基因片段;经T4DNA连接酶连接后转入大肠杆菌,得到pGEMTH1重组克隆。经小量提取质粒井用酶切分析检测,证实其确有TH基因且方向正确。将此质粒再经限制性内切酶消化则得到线状DNA片段,用T7RNA聚合酶转录合成带有Dig标记的高比活度的单链RNA探针;经斑点杂交试验证实该探针具有较高的可靠性。这将为基因治疗帕金森氏病动物模型的疗效检测提供有效手段。 相似文献
12.
试验旨在探讨利用纳米金标记寡核苷酸探针快速检测小反刍兽疫病毒核酸的方法。针对小反刍兽疫病毒N基因的高度保守区设计两条特异寡核苷酸探针,一条探针5’端修饰生物素,另一条探针3’端修饰巯基。巯基化的探针通过Au-S键连接到纳米金颗粒上。靶核酸两端分别与两条探针结合,形成"生物素化探针-靶核酸-纳米金探针"复合物,该复合物通过生物素-亲和素系统,固定在固相载体上,最后银染放大信号。通过肉眼观察法、光镜观察法、分光光度法分析银染灰度,从而间接测定靶核酸的量。初步检测PPRV核酸最低浓度达10fmol/L,所需时间约为1.5h。该方法灵敏度高、操作简单,为临床检测小反刍兽疫病毒核酸提供实验数据和技术支持。 相似文献
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地高辛标记探针检测重组人干扰素β_(1b)中DNA残留量 总被引:1,自引:0,他引:1
为检测注射用重组人干扰素β1b半成品中外源性DNA残留量,以重组人干扰素β1b工程菌基因组DNA为模板,用地高辛标记探针,并以此探针进行点杂交。结果证明,该方法检测灵敏度较好,特异性较强,操作较安全简便,可用于重组人干扰素β1b制备过程中的质量监控及半成品的检定。 相似文献
14.
基因工程人β干扰素工程菌经发酵培养、纯化后获得纯的制品,采用斑点杂交技术,用非放射性地高辛标记超声裂解的全工程菌DNA作为探针,检测基因工程人β干扰素纯品,结果显示:基因工程人β干扰素纯品中的外源DNA含量小于100pg/剂。 相似文献
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利用尼龙膜作为介质,以0.4mol/L的NaOH为层析液,进行膜上层析,分离经放射性同位素标记的核酸探针和未掺入的放射性游离单核苷酸,再经放射性强度测定即可计算出标记后的核酸探针的放射性比活。方法简单快捷,产生的放射性废物少,完全可以替代经典的三氯乙酸沉淀法及滤膜吸附法。 相似文献
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地高辛标记反意RNA探针检测脑组织切片生长抑素mRNA 总被引:2,自引:0,他引:2
本实验采用含大鼠生长抑素基因的pSP65cDNA质位通过转化至噬菌体内大量扩增,经提取,纯化后,用限制性内切酶进行酶切使质枝线性化,并将其作为模板,用地高辛(DigoxigeninDig)作为标记物,体外转录合成生长抑素反意RNA(cRNA)探针。实验动物选用wistar新生大鼠。冰冻切片,端、间脑切片经杂交前用Dig-UTP标记的cRNA探针杂交,杂交后用抗Dig-碱性磷酸酶复合物进行酶联免疫反应。X-磷酸盐-NBT显色。结果显示新生大鼠脑内生长抑素mRNA神经元着紫蓝色。杂交反应物集中于核周的胞浆及短小的突起内。胞核不着色。胞体轮廓清晰,周围背底浅淡。结果表明Dig标记cRNA探针不仅具备非同位素标记探针的优点而且能快速和准确检测组织细胞内mRNA的表达。 相似文献
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PCR法制备地高辛标记探针改良PCR-Select Differential Screening试剂盒 总被引:1,自引:0,他引:1
目的:探讨采用地高辛(digoxin,DIG)标记探针替代PCR-Select differential screening试剂盒中同位素标记探针的方法.方法:抑制性消减杂交(suppression subtractive hybridization,SSH)所分离的差异表达序列转移至硝酸纤维素膜,以PCR法掺入DIG-11-dUTP制备探针,按DIG标记探针常规操作进行杂交显色,杂交阳性结果采用reverseNorthern blot再度杂交验证.结果:应用DIG标记探针改良PCR-Select Differential Screening试剂盒所得到的阳性结果经reverse Northern blot验证符合率达到90%.结论:DIG标记探针改良PCR-Select differential screening试剂盒在避免了放射污染同时具备很高的特异性,完全可以替代同位素标记探针. 相似文献
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PCR方法制备地高辛标记DNA探针检测中国对虾非包涵体型杆状病毒 总被引:8,自引:0,他引:8
A pair of primers created from information of PmNOBⅢ genome DNA Sal I fragment produced a 355bp band by using Penaeus chinensis non occluded baculovirus (PcNOBV),the WSBV isolate from P.hinensis in mainland China,as the DNA template.The specific PCR product was cloned,sequenced and labeled with digoxigenin (DIG)DNA labeling kit(Boehringer Mannheim).The DIG labeled fragment was tested by dot blot hybridization for sensitivity and specificity with purified PcNOBV nucleocapsid,PcNOBV infected shrimp tissues and healthy shrimp tissues.The detection limit of the DNA probe is 6.8pg of purified PcNOBV DNA.No hybridization signals were observed using DNA from healthy shrimp as template.Healthy P.chinensis,artificially infected P.chinensis and pond reared adult P.chinensis were screened for PcNOBV infection by both PCR and the hybridization assay.The results showed a good relationship between PCR and the hybridization assay.These findings demonstrate that the DIG labeled probe can be used as a sensitive,specific and cost effective reagent for detection of PcNOBV. 相似文献
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生物素标记GFV-cDNA探针的制备及在检测葡萄扇叶病毒上的应用 总被引:1,自引:0,他引:1
以整合到质粒中的GFV-cDNA为模板经PCR合成了生物素标记的GFV单、双链探针。用合成的探针对提纯的cFV-RNA_2、感染CFV的昆诺藜叶及18株而萄进行DNA-RNA杂交检测表明:检测提纯病毒RNA_2的灵敏度为1.5pg/斑点,感染GFV的昆诺藜提取液最高稀释度可达40960倍;11株显示典型扇叶症状的样品杂交结果均为阳性,且汁液稀释400~800倍仍能测出,7株不显示典型扇叶症状的葡萄中3株受到GFV的侵染。单、双链探针最适使用浓度分别为1/200及1/100。 相似文献