用于胚胎干细胞分离培养的滋养层细胞株的建立

具有发育全能性的胚干细胞在分离培养时必须依赖滋养层细胞~［１］,本研究旨在建议一个可供使用的滋养层细胞株。将小鼠胎仔去头、内脏、四肢后用胰酶消化,用作成纤维细胞的初代培养,２～３６后继代培养,并开始进行选择和株化,获得的继代培养的成纤维细胞可用于制备胚干细胞培养所需滋养层,亦可冷冻保存备用。本实验所建立的小鼠成纤维细胞系,已成功地用于胚干细胞的分离培养,证明可作为分离培养胚干细胞时所需的滋养层细胞来源。     

胚胎干细胞的分离与培养

如何分离胚胎干细胞，并在体外进行分化抑制培养，仍是探索性很强的研究课题，本文简述了胚胎干细胞分离培养方法的主要进展与趋势。     

无饲养层培养人胚胎干细胞方法的建立

人胚胎干细胞(human embryonic stem cell,hES细胞)是当前医学研究的热点之一．然而hES细胞培养条件苛刻,通常需要采用鼠胚胎成纤维细胞(mouse embryonic fibroblast,MEFs)饲养层来维持其未分化状态,成为目前hES细胞研究的瓶颈之一、本实验成功地将hES细胞接种在细胞外基质包被的六孔板上培养,传代20次后细胞仍然保持良好的未分化状态,各种hES细胞生物学特性(如表面标志物SSEA-3、SSEA-4、TRA-1-60和TRA-1-8l,OCT-4,碱性磷酸酶及体内外分化潜能等)均无改变;其冻存、复苏效果与生长在饲养层上的hES细胞无明显差异．因此,该无饲养层培养体系可以用于培养hES细胞,并为hES细胞转基因研究及大规模培养打下良好的基础．     

小鼠胚胎神经干细胞的分离培养及其鉴定

且的探索小鼠胚胎神经干细胞的体外培养方法,并获取高纯度的神经干细胞,为神经干细胞的深入研究提供实验材料。方法无菌条件下分离E15天小鼠胚脑皮质,制成单细胞悬液,在bFGF和B27存在的培养基中培养扩增,通过免疫细胞化学染色鉴定神经干细胞及其子代细胞的分化方向。结果培养的部分细胞在B27和bFGF存在的无血清培养基中可以在体外分裂增殖,同时表达神经干细胞特异性抗原nestin,并在撤出B27和bFGF的有血清培养基中向神经细胞和胶质细胞分化。结论小鼠胚脑皮质存在具有多向分化潜能的神经干细胞,这些细胞可以在体外稳定培养、传代并自然分化,为细胞替代治疗提供了理想的细胞来源。     

不同饲养层对鸡胚胎干细胞培养效果的影响

目的:为探索鸡胚胎干细胞培养的优化条件,比较不同饲养层对鸡胚胎干细胞离体培养的效果。方法:用传至第2代的鸡胚成纤维细胞与鸭胚成纤维细胞,经丝裂霉素处理后制作饲养层,比较这2种饲养层以及不用饲养层对鸡胚胎干细胞离体培养效果的影响。结果:在以鸡胚成纤维细胞和鸭胚成纤维细胞作为饲养层的培养体系中,鸡胚胎干细胞均可保持良好的生长状态,而且2种饲养层对鸡胚胎干细胞克隆形成的影响差异不显著(P0.05)。结论:鸡胚成纤维细胞和鸭胚成纤维细胞均可作为较好的饲养层细胞用于鸡胚胎干细胞的离体培养。     

鸡胚胎干细胞的分离、培养和鉴定

SNL cells (permanent line of irradiated mouse fibroblast cells), primary mice embryonic fibroblasts (PMEF) cells and primary chicken embryonic fibroblasts (PCEF) cells were respectively used as the feeder cells for chicken embryonic stem cell culture. The isolated blastoderm cells front the stage X embryos of chicken were cultured in Dulercco‘‘ s Modified Eagle Medium (DMEM) supplemented with leukemia inhibitory factor (LIF, 1 000 IU/ml), basic fibroblast growth factor (bFGF 10 ng/ml) and stem cell factor (SCF, 5 ng/ml). The alkaline phosphatase (AKP) test, differentiation experiment in vitro and chimeric chicken production were carried out. The resuts showed that culture on feeder layer of PMEF yielded high quality CES cell colonies. The shape of typical CES clone showed as follows: nested aggregation (clone) with clear edge and round surface as well as close arrangement within the clone. Strong positive AKP reactive cellswere observed. On the other hand, the fourth passage CES cells could differentiate into various cells in the absence of feeder layer cells and LIF in vitro. The third and fourth passage cells were injected into the subgerminal cavity of recipient embryos at stage X. The manipulated embryos were incubated until hatching. Of 269 Hailan embryos injected with CES cells of Shouguang Chickens, 8.2 % (22/269) survived to hatching, 3 feather chimeras had been produced, which suggests that an effective culture systems were established and it could promote the growth of CES cells and maintain them in an undifferentiated state .     

昆明小鼠胚胎干细胞的体外分离培养

利用昆明小鼠13.5dpc的胚胎制备小鼠胚胎成纤维细胞,并以小鼠胚胎成纤维细胞作为饲养层;收集3.5dICR小鼠的囊胚和桑椹胚进行体外培养,筛选纯化ES细胞集落,使其稳定传代后,对其形态学和生物学性状进行初步鉴定,获得阳性细胞集落。     

小鼠胚胎干细胞的培养

目的:建立小鼠胚胎干细胞(embryonic stem cells,ES)的培养方法。方法:制备G418抗性的原代小鼠胚胎成纤维细胞,经丝裂霉素C处理后成滋养层细胞,将小鼠胚胎干细胞复苏后,应用含白血病抑制因子的ES细胞培养液,培养小鼠ES细胞,观察集落的生长情况,并在光镜下观察细胞形态。结果:小鼠胚胎成纤维细胞生长良好,ES细胞呈克隆状生长,且保持未分化状态。结论:建立了小鼠胚胎干细胞培养的有效方法,为下一步基因打靶奠定基础。     

人胚胎干细胞向滋养层分化的研究进展

哺乳动物胚胎发育产生的第一个细胞系的分离是内细胞团和滋养层的分离,不同哺乳动物之间胚胎干细胞向滋养层细胞分化不同,滋养层细胞对胚胎的植入、促进胚胎在子宫内的生存和生长至关重要.人胚胎干细胞为研究人类胚胎发育及向滋养层分化提供了一个独特的模型.人胚胎干细胞可以在实验室条件下保持无限期稳定的培养,用于最初胚胎和滋养外胚层发生的机制研究.目前人胚胎干细胞分化为滋养层细胞在体外可以通过自发分化、基因敲除、分离EB小体和BMP4诱导等几种途径实现.不同哺乳动物之间胚胎干细胞向滋养层分化机制,主要通过信号通路如BMP4,LIF等以及某些标志基因如OCT4,CDX2,Eomes等的变化调节.人胚胎干细胞向滋养层分化的研究为临床应用提供了一定的基础.     

胚胎大鼠中枢神经系统神经干细胞分离培养方法研究

为了建立经济实用的神经干细胞培养方法 ,以Wistar大鼠胚龄 1 4～ 1 5天的胚胎为实验材料 ,选取中枢神经系统的大脑和小脑神经组织 ,经 0 1 2 5 %胰酶消化处理 ,在生长因子 (aFGF和bFGF)作用下 ,采用无血清培养法进行培养。通过倒置相差显微镜进行观察 ,可观察到明显的干细胞的不对称分裂图像。神经干细胞在培养一段时间后均出现细胞团 ,细胞团贴壁后可进行分化 ,形态上表现为神经元样和神经胶质样细胞。利用激光扫描共聚焦显微镜对其进行鉴定 ,可检测到神经干细胞标志性蛋白-Nestin蛋白。采用此法可以分离得到具有干细胞特征和多分化潜能的神经干细胞 ,建立了一套神经干细胞的分离、培养和鉴定的方法 ,这将对更好地理解神经系统的发育机制 ,及临床治疗神经系统疾病具有重要意义。     

小鼠胚胎干细胞的培养

ＥＳ细胞的培养应满足促进细胞增殖和抑制细胞分化而保持其高度未分化潜能。我们用胚胎成纤维细胞作为饲养层,培养基ＤＭＥＭ中加白血病抑制因子的方法来培养ＥＳ细胞。培养的ＥＳ细胞呈集落状生长,细胞排列紧密,呈未分化状态。胚胎成纤维细胞作为饲养层是分离培养ＥＳ细胞最普遍使用而且有效的方法。本文还围绕ＥＳ细胞培养中的促进增殖和抑制分化这两个方面的影响因素进行了讨论。     

兔胚胎神经干细胞的分离、培养和鉴别

目的：研究兔胎脑神经干细胞体外生长特性,为探讨神经干细胞的临床应用及神经系统的发育奠定基础。方法：采用含碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）和表皮细胞生长因子（EGF）的N2无血清培养技术,取18天龄兔胚胎脑组织,分离神经干细胞,并观察分离的细胞体外培养、增殖、分化潜能,免疫组化鉴定。结果：从18天龄兔胎脑皮质和纹状体中成功分离出具有自我更新和多分化潜能的神经干细胞,在无血清培养时细胞呈半贴壁状态生长,形成神经球,可传代。细胞呈Nestin免疫反应阳性;在含血清培养基中培养时则分化,分化后的细胞表达神经元细胞、星形胶质细胞和少突胶质细胞的特异性抗原。结论：来自兔胎脑神经干细胞能在体外培养、增殖并保持传代能力。无血清N2EGF、bFGF培养基有利于兔胎脑神经干细胞的存活和增殖,含血清培养基能诱导兔胎脑神经干细胞分化。     

一种新的人胚胎干细胞自身来源的滋养层支持其体外培养

摘要: 通过人胚胎干细胞(Human embryonic stem cells, hESCs)经体内分化获取间充质干细胞(Mesenchymal stem cells, MSCs)为人胚胎干细胞提供一种新的滋养层。将约5×106个hESCs注射入重症免疫联合缺陷小鼠形成畸胎瘤, 8周后再从畸胎瘤中分离MSCs并鉴定, 将MSCs作为hESCs的滋养层细胞, 并检测和观察hESCs的生长情况、细胞特性和分化能力。从畸胎瘤中获得了纯度较高的具有类似骨髓来源的MSC特性的细胞群, 其形态相似、表面抗原标志相似(CD34和CD45阴性, CD29、CD49b、CD105、CD73和CD90阳性), 经诱导可以向成骨细胞和成脂细胞分化。将hESCs在MSCs滋养层细胞上传代培养10代以上, hESCs依然具有正常的细胞形态, 反转录PCR证实其特异转录因子Oct4、Nanog的表达, 干细胞表面标记SSEA-1显示为阴性, SSEA-4、TRA-1-60、TRA-1-81显示为阳性, 碱性磷酸酶染色显示为阳性, 并且核型正常。体外EB形成和体内畸胎瘤形成证明了其全能性。因此来源于hESCs本身的MSCs可以被用来作为支持胚胎干细胞生长并维持其未分化状态的滋养层细胞。     

小鼠类胚胎干细胞分离培养及用于制作嵌合体小鼠的实验研究

目的探讨分离小鼠囊胚内细胞群类胚胎干细胞及用于制作嵌合体小鼠的方法及应用价值。方法分离3.5d小鼠囊胚内细胞群的类胚胎干细胞作为供体细胞,通过显微注射方法将分离的类胚胎干细胞注射到供体小鼠的囊胚腔中,再将注射后的囊胚移植到假孕雌鼠的子宫中制作嵌合体小鼠。结果分离36枚囊胚的内细胞群类胚胎干细胞,注射256只昆明小鼠囊胚中,移植32只假孕雌鼠子宫中,获产崽2窝,共12只,其中2只获毛色嵌合体小鼠。结论采用该技术分离所获得的类胚胎干细胞作为供体细胞制作嵌合体小鼠获得成功,该方法为ES细胞介导的转基因动物制作增添了一条新的途径,在同种不同品系的动物改良及遗传病基因治疗中有一定的应用价值,尤其是对未能建立ES细胞系的大动物的遗传工程操作具有一定意义。     

山羊胚胎大脑皮层神经干细胞分离、培养与鉴定

目的 :从山羊胚胎大脑皮层中分离培养并鉴定神经干细胞。方法 :利用NBS培养和单细胞克隆技术在山羊胚胎大脑皮层中分离出具有单细胞克隆能力的细胞 ,并进行培养、传代、分化观察 ,采用免疫组化检测克隆细胞的神经巢蛋白 (Nestin)抗原和分化后特异性成熟神经细胞抗原的表达。结果 :从胚龄 2 4～ 30d的新鲜山羊胚胎大脑皮层中成功分离出神经干细胞 ,该细胞具有连续克隆能力 ,可传代培养 ,表达神经巢蛋白抗原。分化后的细胞表达神经元细胞、胶质细胞和少突胶质细胞的特异性抗原。结论 :山羊胚胎大脑皮层中存在具有自我更新能力和多分化潜能的神经干细胞。     

山羊胚胎干细胞的分离与培养

对关中奶山羊配种后6～7天的桑椹胚和囊胚,分别采用全胚培养法、酶消化法和免疫外科法进行处理.将处理后的胚胎培养于小鼠胎儿成纤维细胞(MEF)饲养层上,分离培养山羊胚胎干细胞(Embryonic stem cell,ESC).对分离传代的山羊ESCs分别进行免疫组化染色,RT-PCR检测和体外诱导分化试验.结果表明.全胚培养法易于胚胎贴壁形成原代集落,采用全胚培养法获得的ESCs有一株目前已传至18代.山羊ESCs Nanong、Oct4、SSEA-3免疫组化染色呈阳性,SSEA-1免疫组化染色呈弱阳性,SSEA-4免疫组化染色呈阴性,RT-PCR检测显示其表达Nanog、Oct4、端粒酶、CD117.山羊ESCs经DMSO体外诱导可以向心肌细胞分化.这些试验均表明该细胞具有ESCs的生物学特性.     

饲养层细胞对绵羊胚胎干细胞体外培养的影响

家畜胚胎干细胞(embryonic stem cell,ES细胞)的研究进展缓慢,绵羊ES细胞的研究虽早有报道,但仍未建立可稳定传代的细胞系。在已建立的绵羊体外受精发育体系的基础上,摸索了饲养层(Feeder)细胞对绵羊ES细胞生长的影响,包括在一定的丝裂霉素浓度下处理Feeder的时间、细胞种类、代数、接种密度及新鲜制备和冷冻复苏后的Feeder细胞,通过试验比较研究,目的在于筛选合适的饲养层细胞,为建立绵羊ES细胞体外培养体系奠定基础。结果表明,10μg/ml丝裂霉素C处理2~2.5h获得的1~5代的SEF和1~3代的MEF及两者的1∶1混合细胞都能较好地支持绵羊ES细胞的生长。     

美国开发出大量培养胚胎干细胞的方法

在日前举行的美国化学学会会议上,美国研究人员报告说,他们开发了一种用生物反应器培养胚胎干细胞的新方法．不仅可以成百倍地提高胚胎干细胞的生产效率．还可以大幅度降低成本。     

潮霉素抗性的小鼠胚胎干细胞滋养层的制备

目的：获得潮霉素抗性的小鼠胚胎干细胞滋养层。方法：利用基因组整合了潮霉素B磷酸转移酶基因的小鼠品系Smad4hygro＋/-,从受精14d的小鼠胚胎中制备原代胚胎成纤维细胞;鉴定基因型后,挑选一株潮霉素B磷酸转移酶基因杂合型胚胎成纤维细胞,用丝裂霉素C处理,以获得潮霉素抗性的滋养层细胞。结果：经潮霉素B加压处理后,杂合型滋养层细胞可存活2周左右,并可维持胚胎干细胞的生长。结论：制备的滋养层细胞可用于潮霉素抗性胚胎干细胞的筛选。