来源于线虫Caenorhabditis briggssae的ω-3脂肪酸去饱和酶基因

ω-3多不饱和脂肪酸（ω-3 PUFAs）是一类被广泛研究和关注的脂肪酸,对人类及其他哺乳动物的正常发育和保持良好的健康状况极其重要,并且对于人类的多种疾病的预防和治疗亦有着明显的作用。在人和哺乳动物体内,ω-3 PUFAs的含量与ω-6 PUFAs（其代谢方式和功能与前者不同,通常其作用也相反）相比很低。而对于人体,无论ω-3 PUFAs的过低还是ω-6 PUFAs的过高都会带来极为不利的影响。所以人们一直在努力寻求提高人体中ω-3 PUFAs含量的途径或者大量生产ω-PUFAs的方法。本研究经过密码子优化后,用化学合成的方法获得了C.briggsae的ω-3脂肪酸去饱和酶基因sFat-1,并构建了哺乳动物细胞表达载体pcDNA31-sFat1-EGFP,通过脂质体转染了CHO细胞系并对其进行抗性筛选获得稳定转染细胞株。对稳定转染sFat-1细胞株的RT-PCR分析及脂肪酸组成的GC-MS分析表明,sFat1基因完全能够在CHO细胞中表达和发挥其ω-3去饱和酶的作用,即促使ω-6系列不饱和脂肪酸转变为相应的ω-3系列不饱和脂肪酸（从十八碳到二十二碳）。Ω-6不饱和脂肪酸总量从48.97%下降到35.29%,而ω-3不饱和脂肪酸总量则相应地从7.86%上升到24.02%。Ω-6多不饱和脂肪酸和ω-3多不饱和脂肪酸的比值从正常细胞中的6.23下降到转染细胞中的1.47。这说明C.briggsae的ω-3脂肪酸去饱和酶基因sFat-1的合成是成功的,试验所获得的结果为今后的进一步的研究或应用其大量生产ω-3PUFAs奠定了基础。     

体细胞核移植生产转ω-3脂肪酸去饱和酶基因sFat-1克隆猪

转ω-3脂肪酸去饱和酶基因猪在优质猪培育及研究ω-3不饱和脂肪酸预防心血管和癌症疾病中的作用方面有着重大的应用．本研究首次通过体细胞核移植制备了转线虫ω-3脂肪酸去饱和酶基因sFat-1猪．将sFat—1基因转染到大白猪胎儿成纤维细胞,获得转基因阳性细胞克隆,然后以转基因细胞为核供体、体外成熟的猪卵母细胞为核受体构建克隆胚胎,胚胎体外培养或进行移植．先后移植了1889枚1-4细胞期克隆胚胎到10头受体母猪的输卵管内,28天B超检测9头受体母猪妊娠（90％）,7头妊娠足月（70％）分娩产下21头仔猪,体细胞克隆猪的效率为1．1％（出生仔猪／移植胚胎）．体细胞克隆猪效率的提高,主要是对克隆胚胎的移植环节进行了改进,比较了受体母猪排卵状况对胚胎移植效率的影响．当受体母猪卵泡发育处于即将排卵或正在排卵阶段,能够获得较高的妊娠率和妊娠足月率（100％）,而排卵后移植妊娠足月率为0％．对健康存活15头克隆猪进行了PCR和Southern检测,证实13头为转基因猪,转基因阳性率为87％．RT—PCR检测13头转基因猪,12头表达sFat—1基因．以上结果表明,利用优化的体细胞转基因结合核移植技术,可以成功地批量生产转sFat-1基因的克隆猪．     

体细胞核移植生产转ω-3脂肪酸去饱和酶基因sFat-1克隆猪

转ω-3脂肪酸去饱和酶基因猪在优质猪培育及研究ω-3不饱和脂肪酸预防心血管和癌症疾病中的作用方面有着重大的应用.本研究首次通过体细胞核移植制备了转线虫ω-3脂肪酸去饱和酶基因sFat-1猪.将sFat-1基因转染到大白猪胎儿成纤维细胞,获得转基因阳性细胞克隆,然后以转基因细胞为核供体、体外成熟的猪卵母细胞为核受体构建克隆胚胎,胚胎体外培养或进行移植.先后移植了1889枚1~4细胞期克隆胚胎到10头受体母猪的输卵管内,28天B超检测9头受体母猪妊娠(90%),7头妊娠足月(70%)分娩产下21头仔猪,体细胞克隆猪的效率为1.1%(出生仔猪/移植胚胎).体细胞克隆猪效率的提高,主要是对克隆胚胎的移植环节进行了改进,比较了受体母猪排卵状况对胚胎移植效率的影响.当受体母猪卵泡发育处于即将排卵或正在排卵阶段,能够获得较高的妊娠率和妊娠足月率(100%),而排卵后移植妊娠足月率为0%.对健康存活15头克隆猪进行了PCR和Southern检测,证实13头为转基因猪,转基因阳性率为87%.RT-PCR检测13头转基因猪,12头表达sFat-1基因.以上结果表明,利用优化的体细胞转基因结合核移植技术,可以成功地批量生产转sFa...     

番茄内质网ω-3脂肪酸去饱和酶基因原核表达载体的构建与鉴定

通过RT-PCR的方法从番茄叶片克隆到内质网ω-3脂肪酸去饱和酶(LeFAD3)基因的部分编码区,该片段cDNA为309 bp,将其克隆到pET-30a(+)载体中,酶切位点分别是BamH I和Sac I,构建了原核表达载体pET-LeFAD3,并在大肠杆菌BL21中表达融合蛋白,经IPTG诱导蛋白表达,提取蛋白并采用SDS-PAGE和蛋白质免疫印迹法检测目的蛋白的表达情况.酶切鉴定结果表明,LeFAD3基因原核表达载体构建成功,目的蛋白成功表达.     

骨骼肌特异表达线虫ω-3脂肪酸去饱和酶基因载体的构建与验证

根据猪α-actin基因已知DNA序列设计合成了两个特异性引物,以猪基因组DNA为模板,通过PCR扩增得到α-actin 5'调控序列,然后与线虫ω-3脂肪酸去饱和酶基因cDNA、去除CMV启动子的表达载体pcDNA3.1连接构成肌肉特异性表达载体pcDNA3.1-AF,小鼠股四头肌注射该重组载体,RT-PCR检测证明...     

植物ω-3脂肪酸去饱和酶的研究进展

众多的ω-3脂肪酸去饱和酶是由来源于同一祖先基因的多基因家族的成员编码的,定位于质体或内质网膜上。它们催化十八碳三烯酸(18：3)和十六碳三烯酸(16：3)的生物合成,使脂肪酸形成第三个双键。它们在改变植物膜脂脂肪酸的组成、提高其不饱和度、叶绿体的发育及叶片成熟过程中三烯脂肪酸含量的增加、抗冷性的增强、低温光抑制后光合能力的恢复等方面具有重要作用。近年来,许多植物的ω-3脂肪酸去饱和酶基因已被克隆,并在这些基因的表达调控、遗传转化及转基因植株生理功能研究等方面取得了较大进展。     

脂肪酸去饱和酶的研究进展

多不饱和脂肪酸由于其在生物体内具有重要的生物活性而越来越受到研究者的关注,特别是n-3系列的脂肪酸EPA（二十碳五烯酸）和DHA（二十二碳六烯酸）。脂肪酸去饱和酶在多不饱和脂肪酸的生物合成过程中起着重要的作用,本文对其目前研究进展进行了阐述。     

应用PCR-酶切连接法合成全长sFat1基因

人工合成基因在生命科学研究中有着重要的意义, 因此基因合成是一项常用技术。长片段基因的合成比较困难, 常常因为合成中碱基序列的错配、突变等原因而导致失败。研究者们所熟知的几种现行的方法仍然难以解决该问题。本研究在作者自身的工作经验中建立了一种新的基因合成方法, 即PCR-酶切连接法。应用该方法成功地将化学合成的27个寡聚核苷酸片段(每个片段长60～68 bp)拼接组装起来, 获得了完整的总长为1 226 bp的基因sFat-1。整个过程仅采用3轮PCR(共7个反应)、2轮的酶切连接(3个反应), 而且未曾出现任何偏离预期基因序列的差错。该方法步骤较少, 技术简单, 出错极少, 是合成长基因序列很好的选择。     

△12-脂肪酸去饱和酶FAD2的基本特性及其在胁迫中的功能

脂肪酸去饱和酶(fatty acid desaturase,FAD)催化与载体结合的饱和脂肪酸或不饱和脂肪酸在脂酰链上形成双键.脂肪酸去饱和酶可以分为脂酰ACP去饱和酶、脂酰CoA去饱和酶和脂酰脂去饱和酶三类.而脂酰脂去饱和酶中的△12-脂肪酸去饱和酶(△12 fatty acid desaturase,FAD2)是催化脂肪酸链第12位碳原子形成双键的去饱和酶类,控制着油酸、亚油酸和其他多种不饱和脂肪酸的合成和含量.主要从△12-脂肪酸去饱和酶FAD2的基本特性和在胁迫中的功能进行了综述,并对相关研究领域的未来研究方向进行了展望.     

蓖麻和线虫的两种不同结构脂肪酸去饱和酶的原核表达

目的:通过在原核表达系统中表达蓖麻的可溶性脂肪酸去饱和酶基因和线虫的fat-1脂肪酸去饱和酶基因,为脂肪酸去饱和酶序列结构与功能的研究奠定基础。方法:将蓖麻RCD△9脂肪酸去饱和酶和线虫fat-1脂肪酸去饱和酶基因亚克隆到大肠杆菌BL21表达载体pET32a+中,获得重组表达载体pET32a+-R9,pET32a+- F1,并通过SDS-PAGE和Western Blotting鉴定蛋白的表达情况。结果:经PCR和测序鉴定,证实两个重组质粒含有目的基因片段;SDS-PAGE和Western Blotting证实两种蛋白在大肠杆菌中获得表达,但表达量具有明显的不同;Anthepro软件对蛋白跨膜结构的分析,验证蓖麻△9脂肪酸去饱和酶和线虫fat-1脂肪酸去饱和酶在结构上的不同。结论:蓖麻的RCD脂肪酸去饱和酶和线虫的fat-1脂肪酸去饱和酶都得到了表达,但线虫fat-1脂肪酸去饱和酶表达量偏低;这可能与fat-1脂肪酸去饱和酶是一类跨膜蛋白的性质直接相关。因此,对于线虫fat-1脂肪酸去饱和酶的基于蛋白纯化的结构分析有待进一步的研究。     

“自我剪切”2A肽介导的Δ-12和ω-3脂肪酸脱氢酶以及过氧化氢酶在转基因小鼠肌肉表达研究

哺乳动物因为缺乏Δ-12和ω-3脂肪酸脱氢酶,不能自身合成必需的多不饱和脂肪酸．目前,通过转基因技术在哺乳动物体内表达ω-3脂肪酸脱氢酶,能将长链的n-6多不饱和脂肪酸转化成n-3多不饱和脂肪酸,造成体内长链的n-6多不饱和脂肪酸含量显著减低．本研究通过自我剪切2A肽介导Δ-12和ω-3脂肪酸脱氢酶(FAT-2和FAT-1)以及人过氧化氢酶(human catalase,hCAT)在小鼠的肌肉同时表达．结果表明,转基因小鼠肌肉中长链n-3多不饱和脂肪酸含量提高2.6倍,长链n-6多不饱和脂肪酸含量没有显著变化,而n-6/n-3比例显著降低(P < 0.01)．同时蛋白质印迹检测到人过氧化氢酶hCAT在小鼠的肌肉组织中表达,且过氧化氢酶活性比野生型小鼠显著提高(P < 0.01)．     

植物脂肪酸去饱和酶及其编码基因研究进展

脂肪酸去饱和酶是催化脂肪酸链特定位置形成双键和产生不饱和脂肪酸的酶类。植物脂肪酸去饱和酶主要有5种（FAD2、FAD3、FAD6、FAD7和FAD8）,可分为ω-3型（FAD2、FAD6）和ω-6型（FAD3、FAD7、FAD8）两大类。其编码基因（FAD2、FAD3、FAD6、FAD7和FADS）在植物中一般有多个拷贝。同种基因在不同植物中拷贝数不同,同一植物中相同基因的不同拷贝间在序列特征、表达调控和功能等方面也存在显著差异。本文根据国内外对脂肪酸去饱和酶基因及编码产物的研究现状,分别从它们的分类、拷贝数、结构、作用机制、表达调控等方面的研究进展进行了详细的分类阐述。     

植物脂肪酸去饱和酶及其编码基因研究进展

脂肪酸去饱和酶是催化脂肪酸链特定位置形成双键和产生不饱和脂肪酸的酶类。植物脂肪酸去饱和酶主要有5种(FAD2、FAD3、FAD6、FAD7和FAD8), 可分为ω-3型 (FAD2、FAD6)和ω-6型(FAD3、FAD7、FAD8)两大类。其编码基因(FAD2、FAD3、FAD6、FAD7和FAD8)在植物中一般有多个拷贝。同种基因在不同植物中拷贝数不同, 同一植物中相同基因的不同拷贝间在序列特征、表达调控和功能等方面也存在显著差异。本文根据国内外对脂肪酸去饱和酶基因及编码产物的研究现状, 分别从它们的分类、拷贝数、结构、作用机制、表达调控等方面的研究进展进行了详细的分类阐述。     

ω-3脂肪酸微胶囊制备方法研究进展

微胶囊技术是近年来食品领域的研究热点之一,研究表明,使用微胶囊技术包埋ω-3多不饱和脂肪酸可以提高其氧化稳定性和生物利用度。本文综述ω-3多不饱和脂肪酸微胶囊制备方法的研究进展,为ω-3脂肪酸在食品工业的进一步应用和开发提供科学依据。     

大豆ω-3脂肪酸脱氢酶基因GmFAD3C在酿酒酵母中的表达

α亚麻酸(ALA)被称为必需脂肪酸,对人体有一系列的保健作用。ω-3脂肪酸脱氢酶(FAD)催化亚油酸(LA)生成ALA。大豆种子油中ALA含量较高,为了研究大豆ω3FAD的功能,用RTPCR方法从大豆未成熟种子中扩增出GmFAD3C的cDNA,克隆到酵母表达载体p416中,并用醋酸锂法转化酿酒酵母营养缺陷型K601,经筛选鉴定,得到阳性克隆。气相色谱分析脂肪酸成分,发现工程菌产生了新的脂肪成分ALA,含量占总脂肪酸的3.1%,LA含量与对照相比相应地下降,证明该基因编码的蛋白具有催化18碳多不饱和脂肪酸(PUFA)底物LA在Δ15位脱氢生成ALA的ω3FAD功能,首次实现大豆ω-3脂肪酸脱氢酶基因在酿酒酵母K601p416系统中的表达,建立了一种新的高效低成本的FAD酵母表达系统。     

红花ω3脂肪酸脱氢酶基因的分离及结构分析

采用RT-PCR和RACE(rapid amplification of cDNA ends)技术,从红花叶片中分离到2个质体类ω3脂肪酸脱氢酶基因(CtFAD7和CtFAD8)的全长cDNA和1个微体类ω3脂肪酸脱氢酶基因(CtFAD3)的部分序列,均已提交至GenBank中。CtFAD7和CtFAD8与其他植物的质体类ω3脂肪酸脱氢酶的相似性分别为61-79 %, 63-78 %。而CtFAD3与其他植物微体类ω3脂肪酸脱氢酶的同源性较高,为60-93 %。氨基酸序列分析表明红花CtFAD3,CtFAD7和CtFAD8均含有3个富含组氨酸的保守结构域,分别为HDCGH,HXXXXXHRTHH 和HVIHH,其中CtFAD7和CtFAD8的 N-端分别含有56 和27 个氨基酸残基的质体信号肽序列。疏水性和跨膜分析表明,红花ω3脂肪酸脱氢酶氨基酸序列均包含4个疏水区域,分别跨膜1-3次。蛋白质二级结构预测结果表明,3个ω3脂肪酸脱氢酶蛋白主要由α螺旋和β折叠组成。通过对CtFAD7和CtFAD8的cDNA和DNA序列比较发现,2个基因的DNA序列中均包含有7个内含子,8个外显子。各内含子在物种间则表现出丰富的多态性,序列和长度大小均各不相同;而从第2# 到7# 外显子的长度和序列相似性在物种间非常保守。比较各内含子的位置可以发现,在内含子出现的位置,均为该基因的保守区。因此,推测ω3脂肪酸脱氢酶基因的内含子对于保证基因在物种进化过程中功能的保守性起着关键作用。     

大豆ω-3和ω-6脂肪酸脱氢酶基因密码子优化

DHA和EPA对心脑血管疾病以及癌症等疾病的防治有着重要的作用,其中ω-3和ω-6脂肪酸脱氢酶是合成多不饱和脂肪酸DHA和EPA过程中的两个关键的去不饱和酶,由于缺乏这两种酶的基因,高等动物无法自发合成多不饱和脂肪酸,为了得到可以生产多不饱和脂肪酸的转基因动物,本研究计划将大豆的这两个去饱和脂肪酸作为目的基因,但由于不同物种之间的密码子使用具有偏爱性,会严重影响到目的基因在宿主体内的表达水平,为了解决这一问题,提高目的基因在宿主体内的表达水平,同时采用Jcat在线软件和手动替换密码子两种方法对大豆的ω-3和ω-6脂肪酸脱氢酶基因进行了优化,然后选出最优的优化方法,为后期进一步的实验提供目的基因。最后本文预测了两种优化结果的RNA二级结构和CAI、CBI、Nc值和GC含量,比较得出手动替换的结果优于在线优化的结果。     

脂肪酸去饱和途径在肿瘤发生发展中的作用

肿瘤的发生发展与肿瘤代谢异常密切相关。近几年,脂肪酸代谢在肿瘤代谢研究中越来越受到关注,脂肪酸的合成代谢在肿瘤细胞的生长、转移和化疗效果提升中发挥关键性的作用。脂肪酸除了作为细胞膜基质结构成分外,还是重要的二级信使,同时可以作为机体能量的来源。不饱和脂肪酸由饱和脂肪酸通过去饱和途径作用转化而来。由硬脂酰辅酶A去饱和酶(SCD)所催化的单不饱和脂肪酸是生物体细胞膜必需的组分之一。肿瘤细胞脂肪酸代谢中的去饱和途径由于新的替代方式的出现近年来备受关注,即由脂肪酸去饱和酶2 (FADS2)介导生成sapienate的去饱和途径。该文综述归纳总结了脂肪酸去饱和途径中关键酶(SCD和FADS2)及甾醇调节元件结合蛋白1 (SREBP1)在肿瘤的发生发展中的作用及最新研究,旨在对基于肿瘤脂肪酸代谢的治疗及调控靶点进行进一步的挖掘和探索。     

ω-3多不饱和脂肪酸治疗急性肺损伤的疗效观察

目的探讨ω-3多不饱和脂肪酸对急性肺损伤(ALI)疗效。方法选择ALI患者39例,随机分为2组。对照组(19例)予以常规治疗,治疗组20例在常规治疗基础上加用ω-3多不饱和脂肪酸。对比2组治疗有效率及治疗后2、4和8 d的血气分析变化观察氧分压、氧合指数等的变化。结果治疗组有效率为70%,与对照组31.6%相比差异有统计学意义(P0.05);治疗组PaO2、氧合指数高于对照组,同时心率、乳酸水平,下降较对照组明显,差异有统计学意义(P0.05),特别是乳酸(P0.01)。结论ω-3多不饱和脂肪酸应用有助于改善ALI患者的呼吸功能及预后。     

建鲤两种Δ6脂肪酸去饱和酶基因克隆与表达

利用逆转录PCR和RACE技术获得建鲤2种Δ6脂肪酸去饱和酶（FADs6-a,FADs6-b）的全长cDNA序列. FADs6-a基因的cDNA总长为1 966 bp,开放阅读框为1 335 bp,编码444个氨基酸;FADs6-b基因的cDNA总长为1 931 bp,开放阅读框为1 335 bp,编码444个氨基酸.FADs6-a和FADs6-b基因都包括N端细胞色素b5结构域、3个富含组氨酸的结构域和2个推测的跨膜区,具有典型的Δ6脂肪酸去饱和酶结构特点.氨基酸同源性分析显示,建鲤FADs6-a和FADs6-b与斑马鱼的相似性较高,而与海水鱼类的相似性较低,与人类FADs6的相似性高于与FADs5的相似性.通过实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测该基因在建鲤幼鱼不同组织中的表达量, 发现2种Δ6 脂肪酸去饱和酶基因在建鲤肝脏的表达量最高,其次是肠、脑、肌肉、心和肾,而前肠高于后肠,FADs6-a的表达量高于FADs6-b.得到的结论是,建鲤具有2种类型的合成高度不饱和脂肪酸(HUFA)的关键酶-Δ6脂肪酸去饱和酶,在肝脏和肠道中的含量较多,且FADs6-a和FADs6-b在结构和组织的表达方面都存在差异,这为进一步研究建鲤HUFA的合成途径及调控机理奠定了基础.