快捷的定点突变效率近100%的大引物PCR方法

报道了一种新的PCR突变方法,它不需要纯化大引物或设计特别的旁侧引物．利用一个诱变引物和两个测序引物(T_m≤58℃)作为旁侧引物．第一轮PCR产物12.5 μl直接加入到50 μl的第二轮PCR反应体系作为模板和大引物,在开始第二轮PCR反应时,增加在68℃退火温度下进行10个循环的不对称PCR,这一步骤大大提高了通过600 bp或800 bp大引物所导致的突变效率．结果表明,该方法的产物能够达到高保真、97%～98%的突变效率和高产率．     

反向重复序列DNA的PCR扩增特性研究

旨在研究反向重复序列形成的发卡结构对模板扩增的影响。研究DNA发卡结构中环部大小、茎部长度、引物相对于茎部位置等对PCR扩增效率的影响,探讨如何通过引物设计及改变退火温度等条件来实现发卡结构DNA的有效扩增的方法。结果显示,如果引物的位置同发卡结构茎部5'序列相同或部分相同,则由于发卡结构的形成阻碍引物与模板结合而对PCR产生抑制作用,并且抑制作用随着茎部长度的增加而增强;当环部的长度达到50 nt以上时,抑制作用明显减弱。较高的退火温度和引物浓度都有助于引物同分子内形成发卡结构的竞争,使PCR扩增更容易进行。     

沙门菌、大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的多重PCR检测*

根据沙门菌invA基因、大肠杆菌phoA基因和金黄色葡萄球菌nuc基因序列,设计3对特异性引物进行多重PCR并对反应条件进行优化。结果表明3对引物能特异地扩增出284bp、622bp、484bp的目的条带;最佳反应条件为沙门菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌的引物浓度分别为40nmol/L、40nmol/L、80nmol/L,Mg²⁺浓度2.4mmol/L,dNTP浓度200μmol/L,TaqDNA聚合酶1.5U,退火温度55.0℃~57.4℃之间;在此条件下多重PCR同时检测DNA的敏     

一种改进后的重叠延伸PCR法对被孢霉重组载体的构建

为了提高DNA大片段的拼接效率,通过引入逐次退火的PCR的方法,改良了传统的重叠延伸PCR方法。逐次退火PCR法,一方面延长了重叠区的PCR引物长度;另一方面把原来在1个循环中1个退火温度改成若干个,逐次降低退火温度,适用于Tm值相差比较大的引物;相邻的退火温度之间相差3-6℃。结果显示,通过此种方法成功拼接了ω3(2)和HCT两个大片段;PCR产物电泳条带单一,克隆测序证实序列完全正确,可以直接应用于后续试验。这种改进后的方法可以有效减少非特异性扩增,提高灵敏度,把这种方法称之为逐次退火重叠延伸PCR。     

DNA模板中发卡结构对定量PCR扩增的影响

[目的]探究模板引物结合区发卡对定量PCR的影响及优化方法。[方法]用分布连接法构建一系列在模板引物结合区含环大小为5~60 nt,茎长9 bp的DNA模板,考察发卡环部大小、茎干区GC含量对q PCR扩增效率的影响,再针对引物浓度、引物长度及退火温度来优化含发卡结构DNA模板的扩增。[结果]环区为5~40 nt时,其Ct值比对照组高1.3~4.2,对q PCR的抑制作用与环大小成负相关;茎长9 bp发卡结构当GC含量达3 bp以上时会对定量扩增产生明显抑制作用;增加引物长度、提高引物浓度和退火温度可提高发卡模板的扩增效率。[结论]模板引物结合区环大小在40 nt以内,茎长达9 bp的发卡结构对q PCR扩增会产生抑制作用,通过增加引物长度、提高引物浓度和退火温度可缓解此类抑制。     

新型α-芋螺毒素基因克隆的引物筛选

目的:优化PCR条件,建立能特异扩增出α-芋螺毒素基因片段的最理想PCR条件.方法:根据α-芋螺毒素基因保守的信号肽或内含子序列和非翻译区保守核苷酸序列设计了多组特异引物,并对引物浓度和退火温度等影响因素进行优化.结果:根据α-芋螺毒素基因保守的内含子序列为引物、引物浓度为0.1 μmol/L、退火温度为50℃时,能特异的扩增出α-芋螺毒素基因片段,分子量大约分别为180bp和300bp.结论:采用优化的PCR条件,能筛选出克隆新型的α--芋螺毒素基因片段的最理想引物,为α-芋螺毒素的化学合成、活性研究和应用提供基础.     

双退火温度PCR扩增DNA

【目的】与设置单一退火温度的常规PCR(S-T_m PCR)不同,本研究探讨双退火温度PCR(D-T_m PCR)由高到低设置2条引物各自退火温度。【方法】以PxF61和VPel为正/反向引物,用Q5 DNA聚合酶扩增4.3 kb的模式DNA pET20b-Xyn(黑曲霉木聚糖酶基因)。PCR程序为:98°C预变性3 min,30次循环{98°C变性30 s,设置双退火[T_(m1) 70°C(Px F61)退火15 s、T_(m2) 62°C(VPel)退火15 s],72°C延伸130 s}。【结果】与S-T_m PCR(61°C)相比,D-T_m PCR扩增4.3 kb的目的条带亮度更高,减少2条杂带;经25次循环目的 DNA产物量最高。D-T_m PCR用于长片段引物扩增5.3 kb重组质粒DNA条带更明显。【结论】D-T_m PCR直接扩增目的条带,避免了探讨T_m的麻烦,不要求2条引物T_m相近,从理论上更加清晰地认识引物与各自模板分步退火过程。     

慢性蜜蜂麻痹病毒半套式PCR检测方法的建立

参考NCBI(National Center of Biotechnology Information)已发表的慢性蜜蜂麻痹病毒(Chronic bee paralysis virus,CBPV)的全基因序列,设计3条检测CBPV的特异性引物,建立CBPV半套式PCR(Polymerase Chain Reaction)检测方法,对其外引物退火温度(52、54、56和58℃)、内引物退火温度(48、50、52和54℃)、引物浓度(0.1、0.2和0.4mmol/L)和ExTaq酶体积(0.25、0.5和1μL)进行优化,并对优化后的方法进行了特异性、敏感性验证,同时,利用该方法对20份临床样品进行检测。结果表明,该半套式PCR最佳外引物退火温度、内引物退火温度、引物浓度和ExTaq酶体积分别为56℃、50℃、0.2mmol/L和0.25μL;感染CBPV与健康蜜蜂、急性蜜蜂麻痹病毒(Acute paralysis virus,ABPV)、中蜂囊状幼虫病病毒(Chinese sacbrood bee virus,CSBV)、黑蜂王台病毒(Black queen cell virus,BQCV)、蜜蜂残翼病毒(Deformed wing virus,DWV)的cDNA均无交叉反应,检出最低下限为10-3pg;从20份临床样品中检出4份阳性。说明建立的CBPV半套式PCR检测方法具有快捷、敏感、特异等优点,可用于CBPV感染的临床诊断和流行病学调查。     

乌塌菜ISSR-PCR反应体系的建立及优化

为获得乌塌菜ISSR-PCR的最佳反应体系,采用单因素浓度梯度试验和正交优化设计相结合的方法,研究了引物浓度、dNTP浓度、Mg²⁺浓度、Taq DNA聚合酶用量对PCR反应的影响。并在此基础上对退火温度和循环数进一步优化,最终确立了适合乌塌菜ISSR PCR反应的最佳体系和程序。即20 μL PCR反应体系含：30 ng模板DNA,0.50 μmol·L^-1引物,0.25 mmol·L^-1 dNTP,1 mmol·L^-1 Mg²⁺,1.0 U Taq DNA聚合酶。PCR扩增程序为：94℃预变性3 min;94℃变性30 s,50℃退火1 min,72℃延伸90 s,35个循环;72℃延伸7 min,4℃保存。这一优化的ISSR-PCR反应体系的建立为今后利用ISSR技术对乌塌菜进行种质资源的分类鉴定奠定了基础。     

无距虾脊兰ISSR-PCR反应体系的建立与优化

利用正交实验设计的方法,对珍稀植物无距虾脊兰ISSR-PCR反应的5个因素（Mg²⁺、dNTPs、引物、模板DNA和Taq DNA聚合酶）4个水平进行试验,并通过梯度PCR实验确定引物的最佳退火温度和循环次数,最终确定无距虾脊兰的最佳反应体系为：25 μL的体系中含3.0 mmol·L^-1 Mg²⁺、0.3 mmol·L^-1dNTP、0.4 μmol·L^-1引物、2.5 ng·μL^-1模板DNA、0.08 U·μL^-1 Taq DNA聚合酶以及1×PCR buffer;扩增程序为94℃预变性5 min;94℃变性1 min,退火1 min（根据不同引物选择不同的退火温度）,72℃延伸1 min,循环40次;72℃延伸10 min;12℃终止反应。该ISSR-PCR体系的建立,为今后利用ISSR技术对无距虾脊兰及其近缘种的分子系统学以及遗传多样性的研究奠定基础。     

六种藓类植物茎的比较解剖学研究

通过对6种藓类植物,即褶叶青藓(Brachythecium salebrosum(Web.et Mohr.)B.S.G.)、湿地匐灯藓(Plagiomnium acutum(Lindb.)Kop.)、侧枝匐灯藓(Plagiomnium maximoviczii(Lindb.)Kop.)、大凤尾藓(Fissidensnobilis Griff.)、大羽藓(Thuidium cymbifolium(Doz.et Molk.)B.S.G.)和大灰藓(Hypnum plumaeforme Wils.)嫩茎和老茎的石蜡切片和显微观察发现,同一藓类植株的嫩茎和老茎,茎结构稳定,不同种藓类植物茎横切面具有不同特征.植物体茎横切面形状、表层细胞的层数、细胞大小和细胞壁厚薄、皮层细胞大小和形状、中轴的有无以及比例等特征可以作为藓类植物的分科分类依据之一.     

真菌类遗传学分析的知识结构教学

本文以认知结构理论为指导,讨论了真菌类遗传分析与高等动植物遗传分析的内在联系,认为利用这种内在联系进行教学可收到好的效果并说明了作者的具体教学过程。 Abstract:In the paper, the relationship between genetic analysis of Fungi and genetic analysis of high animal and plant was discussed.A good results were obtained when we adopted this method in the teaching.     

医疗机构合理用药评价模型的构建研究

目的 针对医疗机构的合理用药水平进行评价研究。方法 根据医疗机构合理用药的具体要求,构建医疗机构合理用药评价指标体系,采用基于模糊群决策的方法和多指标评价分析法构建医疗机构合理用药评价模型。结果 构建了基于模糊群决策的医疗机构合理用药评价模型,并通过实例分析证明了评价模型的可行性。结论 建立的基于模糊群决策的医疗机构合理用药评价模型能够对医疗机构的合理用药水平进行科学评价,为提高医疗机构合理用药水平奠定基础。     

Cause of Senescence of Nine Sorts of Flowers

The levels of endogenous phytohormones and respiratory rate in nine sorts of flowers such as Cymbidium faberi Rolfe, Nopalxochia ackermannii Kunth and others were investigated both at full bloom and senescence and meanwhile the effect of exogenous phytohormones on prolonging the blossoms and promoting ethylene production were tested. There is a high content of endogenous ethylene in all the long-lived flowere, about 3–16 folds higer than the short-lived ones. There is a high level of ABA at full blooming flowers of short-lived flowers, in which there is no or only some cytokinins in it, but the ratio of CTK (6BA+zeatin)/ABA is smaller(l.7). The endogenous ABA reached a much higher level at senescence in all nine sorts of flowers, so it is reasonable to consider that it is ABA which plays an important role of regulation in controlling flower's senescence. There is a much higher level of GA3 and zeatin in the long-lived flowers which is not demonstrated in the shortlived ones. The respiratory rate is one of the factors controtling the longevity of flowers, but it does not play a decided role. Application of 6BA and zeatin prolongs distinctly orchid’s longevity, however exogenous IAA through the promotive action on ethylene production, evidently extends the longevity of the flowers of the Nopalxochia ackermannii Kunth.     

棉铃虫钙粘蛋白N端多肽多克隆抗体制备及对Bt抗性的初步检测

用重组表达的棉铃虫Helicoverpa armigera(Hübner)中肠钙粘蛋白N端多肽片段制备兔多克隆抗体,并利用其对Bt抗性进行鉴定。通过RT-PCR方法对棉铃虫中肠钙粘蛋白N端多肽的基因片段Cad285进行PCR扩增,将其克隆到pET-30a原核表达载体中,在大肠杆菌BL21(DE3)中经IPTG诱导表达,得到35ku的重组融和蛋白,融合表达的包涵体经过变性、Ni-NTA柱亲和纯化、复性等方法处理包涵体,获得可溶性纯化蛋白,用纯化后蛋白免疫新西兰兔制备多克隆抗体,ELISA检测其效价高于1∶16000;利用最终获得的多克隆抗体对室内纯合Bt抗/感品系的棉铃虫中肠钙粘蛋白进行Western blot分析,结果显示敏感和抗性品系之间有明显差异,表明其能够应用对Bt抗性进行初步检测。     

Photoregulation of seed germination of wild-type and of an aurea-mutant of tomato

Seed germination of an aurea mutant of tomato ( Lycopersicon esculentum Mill.) is promoted by continuous irradiation with red, far-red or long-wavelength far-red (758 nm) light as well as by cyclic irradiations (5 min red or 5 min far-red/25 min darkness). Far-red light applied immediately after each red does not change the germination behaviour. Seed germination of the isogenic wild-type, cv. UC-105, is promoted by continuous and cyclic red light while it is inhibited by continuous and cyclic far-red light and by continious 758 nm irradiation. Far-red irradiation reverses almost completely the promoting effect of red light. The promoting effect (in the aurea mutant) and the inhibitory effect (in the wild-type) of continuous far-red light do not show photon fluence rate dependency above 20 nmol m⁻² s⁻¹. It is concluded that phytochrome controls tomato seed germination throgh low energy responses in both the wild type and the au mutant. The promoting effect of continuous and cyclic far-red light in the au mutant can be attributed to a greater sensitivity to P_fr.     

龙胆科药用植物化学成分的研究现状

龙胆科植物在我国的分布范围很广,且多数为药用植物,其多数种属的药用植物,至今其化学成分尚未被系统研究。综述了目前龙胆科药用植物的化学成分的研究现状及一般提取方法,对近年来发现的环烯醚萜及裂环烯醚萜类化合物进行了总结,为本科药用植物的更深入研究提供了参考。