苏云金芽孢杆菌鲇泽变种7-29杀虫蛋白质结构基因的改造和表达

对苏云金芽孢杆菌鲇泽变种(Bacillus thuringiensis var.atezawai)7—29杀虫蛋白质基因调控区(181bp)和第五活性区(217bp)修饰后,在它的5’端和3’端分别插入一个人工合成并带有启动密码子(ATG)的。Dapter I(15bp)和PCR合成并带有终止密码子(TAA)的第五活性区(229bp)。使负责编码N-端肽的DNA片段,改造成既有启动翻译功能又有终止翻译功能的结构基因。经过western blotting检测,改造后的结构基因能在E．Coli JM103中正常表达。生物杀虫定性实验结果表明,3'端和5'端全改造后的杀虫基因比只改造3端的杀虫基因更具有较好的杀虫活性。     

李氏大足蝗线粒体全基因组序列分析

采用长距PCR 扩增及保守引物步移法测定并注释了李氏大足蝗( Aeropus licenti Chang)的线粒体基因组全序列。结果表明,李氏大足蝗的线粒体基因组全长15 597 bp,A+T 含量为74.8%,37个基因位置与飞蝗的一致,基因间隔序列共计17处105 bp,间隔长度从1～21 bp不等;有10对基因间存在58 bp重叠,重叠碱基数在1～17 bp之间。13个蛋白质编码基因中找到4种可能的起始密码子;有12个基因在基因3'端找到完全的TAA或TAG 终止密码子,只有ND5基因终止密码子为不完整的T。除tRNA^Ser（AGN）外,其余21个tRNA基因的二级结构均属典型的三叶草结构。tRNA^Ser（AGN）的DHU臂缺失,在相应的位置上只形成一个环。预测的lrRNA二级结构总共有6个结构域（结构域Ⅲ缺失）,47个茎环结构;预测的srRNA的二级结构包含3个结构域,31个茎环结构。A+T 丰富区长度为712 bp。     

短额负蝗线粒体基因组及其lrRNA和srRNA二级结构分析

采用长距PCR扩增及保守引物步移法测定并注释了短额负蝗的线粒体基因组全序列。结果表明，短额负蝗的线粒体基因组全长15 558 bp，A+T含量为74.3%，37个基因位置与飞蝗的一致，基因间隔序列共计11处64 bp，间隔长度从1～16 bp不等；有15对基因间存在51 bp重叠，重叠碱基数在1～8 bp之间。13个蛋白质编码基因中找到6种可能的起始密码子，有12个基因在基因3＇端能找到完全的TAA或TAG终止密码子，只有ND5基因终止密码子为不完整的TA。除tRNA^Ser（AGN）外，其余21个tRNA基因的二级结构均属典型的三叶草结构。tRNA^Ser（AGN）的DHU臂缺失，在相应的位置上只形成一个环。预测的lrRNA二级结构总共有6个结构域（结构域Ⅲ缺失），49个茎环结构。预测的srRNA的二级结构包含3个结构域，33个茎环结构。A+T丰富区中存在一个被认为与复制及转录起始有关的Ploy（T）（T-stretch）结构。     

L-乳酸脱氢酶基因克隆及功能分析

构建了一株产D ,L_乳酸的乳杆菌 (Lactobacillussp .)MD_1的基因文库。利用乳酸脱氢酶和丙酮酸裂解酶缺陷的EscherichiacoliFMJ14 4作为宿主 ,通过互补筛选分离克隆到乳酸脱氢酶基因 (ldhL)。核酸序列分析表明 ,该基因以ATG为起始密码子编码 316个氨基酸残基组成的蛋白质 ,预测的分子量为 33 84kD ;5′端存在典型的启动子结构 ,3′端的终止子是不依赖于 ρ因子的转录终止子。ldhL编码的蛋白质有 3个保守区域 ,其中Gly13～Asp50保守区域是NADH的结合位点 ,Asp73～Ile10 0和Asn12.3～Arg15.4保守区是酶的活性部位。该ldhL和其他乳杆菌的ldhL基因和编码的氨基酸序列相似性较低 ,核苷酸序列相似性最高仅为 64.1% ,氨基酸序列相似性最高仅为 68.9% ,是新的L_乳酸脱氢酶基因     

黄瓜花叶病毒cDNA载体在烟草细胞中表达外源基因

为了探讨利用黄瓜花叶病毒(CMV)构建表达载体的可行性,分离了山东株(SD) CMV RNA 3的全长cDNA。测定其全序列后,采用定点突变的方法在衣壳蛋白(CP)基因起始密码子处改造出一个NsiⅠ位点,可将外源基因引入NsiⅠ位点和CP基因终止密码子上游附近的XhoⅠ或SalⅠ位点而置换掉CP基因。分别用绿色荧光蛋白(GFP)基因、β-葡糖醛酸酶(GUS)基因以及小鼠二氢叶酸还原酶(DHFR)基因3种报告基因置换CP基因。将Fny株CMV RNA 1、RNA 2和SDCMV嵌合RNA 3的cDNA分别插入pCass载体的35S启动子和终止子之间,将构建的置换型载体直接以质粒的方式转染烟草原生质体,表达了3种报告基因。     

枯草芽孢杆菌168新型转录终止子的构建与表征

转录终止子作为一种位于终止密码子后的调控信号,负责终止DNA的转录和RNA的释放。文中首次改造并分析了来源于噬菌体的λto终止子的发卡结构与富含尿嘧啶的序列对枯草芽孢杆菌168中基因转录终止效率以及mRNA稳定性的影响。结果表明,相对于野生型的λt0终止子,突变体M3、M11和M12表现出了更高的转录终止效率,突变体M3、M4和M11更有利于上游绿色荧光蛋白mRNA的稳定。另外,我们发现插入RNase作用位点同样提高了mRNA的稳定性。研究结果表明终止子中的发卡环对转录终止不是必需的,同时,结果也证明了转录终止子可以作为一种潜在的工具用于提高枯草芽孢杆菌中mRNA的稳定性以及相应酶的 表达。     

枯草芽孢杆菌168新型转录终止子的构建与表征（英文）

转录终止子作为一种位于终止密码子后的调控信号,负责终止DNA的转录和RNA的释放。文中首次改造并分析了来源于噬菌体的λt_o终止子的发卡结构与富含尿嘧啶的序列对枯草芽孢杆菌168中基因转录终止效率以及mRNA稳定性的影响。结果表明,相对于野生型的λt_0终止子,突变体M3、M11和M12表现出了更高的转录终止效率,突变体M3、M4和M11更有利于上游绿色荧光蛋白mRNA的稳定。另外,我们发现插入RNase作用位点同样提高了mRNA的稳定性。研究结果表明终止子中的发卡环对转录终止不是必需的,同时,结果也证明了转录终止子可以作为一种潜在的工具用于提高枯草芽孢杆菌中mRNA的稳定性以及相应酶的表达。     

依赖PrfA转录调控的单核细胞增生李斯特菌毒力基因inlC启动子结构特点的初步研究

为了研究单核细胞增生李斯特菌毒力基因启动子的结构特点与转录调控因子PrfA蛋白之间的关系,应用PCR定点突变和重组PCR技术缺失了该菌毒力基因inlC启动子上可能与PrfA蛋白结合以及诱发转录起始相关的碱基序列,构建了一系列突变启动子与lacZ报告基因融合表达质粒, 使lacZ基因的表达置于inlC突变启动子下,并分别电转化单核细胞增生李斯特菌野生株P14、PrfA蛋白高表达突变株P14a 和prfA基因等位缺失突变株A42中,检测相应的β-半乳糖苷酶活性。结果表明：位于inlC启动子转录起始点下游22bp 处的一段17bp的类似PrfA蛋白结合序列TTAACAGCGTTTGTTAA并没有增强和抑制PrfA转录调控活性的功能;甚至将其改造成“完美的” PrfA蛋白结合序列TTAACATTTGTTAA后,也不影响inlC依赖于PrfA的转录活性地表达;但是,如果缺失inlC启动子上原始的PrfA蛋白结合序列,则使inlC依赖于PrfA的转录活性完全丧失;另外,单核细胞增生李斯特菌毒力基因inlC和plcA 依赖于PrfA的转录活性的表达也与启动子上PrfA蛋白结合区(PrfA-box)距离-10区的碱基个数有关:最适为22或23bp,长于23bp或短于22bp的突变启动子的依赖PrfA的转录活性大大降低,甚至没有活性。说明除PrfA蛋白结合序列外,受PrfA调控的毒力基因启动子上还可能存在其它尚未阐明的结构和序列影响PrfA蛋白的结合以及启动转录表达。     

短额负蝗线粒体基因组及其lrRNA和srRNA二级结构分析

采用长距PCR扩增及保守引物步移法测定并注释了短额负蝗的线粒体基因组全序列。结果表明,短额负蝗的线粒体基因组全长15558bp,A T含量为74.3%,37个基因位置与飞蝗的一致,基因间隔序列共计11处64bp,间隔长度从1～16bp不等;有15对基因间存在51bp重叠,重叠碱基数在1～8bp之间。13个蛋白质编码基因中找到6种可能的起始密码子,有12个基因在基因3'端能找到完全的TAA或TAG终止密码子,只有ND5基因终止密码子为不完整的TA。除tRNASer(AGN)外,其余21个tRNA基因的二级结构均属典型的三叶草结构。tRNASer(AGN)的DHU臂缺失,在相应的位置上只形成一个环。预测的lrRNA二级结构总共有6个结构域(结构域Ⅲ缺失),49个茎环结构。预测的srRNA的二级结构包含3个结构域,33个茎环结构。A T丰富区中存在一个被认为与复制及转录起始有关的Ploy(T)(T-stretch)结构。     

葡萄风信子MaANS基因及启动子的克隆与分析

该研究根据转录组测序结果,在葡萄风信子(Muscari armeniacum) ‘亚美尼亚’中克隆到花青素合酶(ANS)基因的cDNA与DNA序列,该基因命名为MaANS。采用荧光实时定量分析MaANS时空表达模型,同时利用染色体步移法克隆到MaANS上游1 044 bp的一段序列。信息学分析表明：MaANS开放阅读框为1 065 bp,编码355个氨基酸;DNA与cDNA的一致性为89.62%,DNA序列在ATG下游515~594 bp之间插入1个79 bp内含子;启动子序列在-70 bp位置有1个TATA-box,有多个光响应元件及MYB结合位点等。荧光实时定量分析表明,MaANS基因在花中优势表达,并且在完全着色期表达量最高。该研究结果为深入研究MaANS基因功能、分析葡萄风信子着色机理奠定了基础。     

核糖体结合位点序列对大肠杆菌中HBcAg重组质粒表达的影响

用Bal-31外切酶调整乙肝病毒核心抗原(HBcAg)基因非编码区长度并克隆到质粒pKK 223-3中,获得了不同水平地表达HBcAg的重组质粒pKL系统。该系统所表达的HBcAg蛋白分子量为21000D。DNA序列分析发现高、中、低表达水平的3个重组质粒的SD序列到HBcAg基因的ATG之间的距离分别为12bp、13bp和19bp,高、低表达质粒的mRNA核糖体结合位点序列的二级结构分析显示,二者的自由能相差约3倍,且低表达质粒的mRNA的SD序列中的3个碱基及AUG中的3个碱基都参与配对,而高表达质粒只有SD序列中的2个碱基参与配对,表明SD序列到ATG的距离及mRNA的二级结构均在HBcAg的表达调控中起重要作用。     

The expression of human tumor necrosis factor in E. coli

cDNA of human natural TNF (n-TNF) obtained by stimulating human leukemic B cell line (Ball-1) with Sendai virus was cloned. Valine-started-TNF (V-TNF) gene was constructed from the cDNA and expressed in E.coli HB101 under the control of a trp promoter by the induction of 3-indoleacrylic acid. The expression level of V-TNF clone was about 10% of the total E.coli protein. On the other hand, the expression level of glutamine started-TNF (Q-TNF) gene having the same SD-ATG sequence which was constructed from V-TNF gene was as low as about 1/20 of that of V-TNF. The nucleotide sequence around ATG (-4 approximately +12) of Q-TNF gene was randomly changed without modifying the coded amino acid sequence, resulting to obtain high expression clones as similar TNF protein yield as that of V-TNF. These clones possessed A residue rich sequence around the initiation codon ATG. These results show that some correlation might exist between the high expression rate and A residue rich sequence around the initiation codon.     

木霉几丁质酶基因克隆及植物转化载体构建

利用PCR技术从绿色木霉LTR-2(Trichoderma virede)基因组DNA中扩增到一段序列,测序结果表明,该编码基因片段大小为 1 508 bp,其中包括一个 1 459 bp的开放阅读框,起始密码子位于 45 bp,终止密码子位于 1 501 bp,共编码氨基酸 424 个.在Genbank中进行序列比对,发现该序列同已发表的Trichoderma viride 42 ku几丁质酶氨基酸序列具有99%的同源性.将该片段同pCAMBIA1300中的35S启动子和35S-polyA终止子连接后,插入载体pCAMBIA1302多克隆位点中,构建成植物转化载体,最后将构建好的载体pCHI1302-42通过转化导入根癌农杆菌LBA4404中,为进一步构建转基因植物奠定了基础.     

Nucleotide sequence of the Clostridium thermocellum laminarinase gene.

The sequence presented (1022 bp) shows the Clostridium thermocellum laminarinase gene (lam1) and its flanking regions. The gene lam1 comprises an open reading frame of 726 nt, encoding a 242-aa protein with predicted Mr 27661. The ORF startswith the translation initiation codon ATG. This ATG codon is preceded at a spacing of 7 bp by a potential ribosome binding site (GGAGGT). A putative signal peptide was identified (the potential cleavage site is between position 27-28 aa). The comparison of the primary protein sequence with other beta-1, 3-1, 4-glucanases showed extensive homology for Bacillus amyloliqefaciens and Bacillus subtilis glucanases (identity-46.7%; similarity-57.0%).