地衣芽孢杆菌耐高温α-淀粉酶基因的克隆、烟草瞬时表达及转化拟南芥的研究

从地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)中克隆到耐高温α-淀粉酶基因全长, 构建了原核表达载体, 转入大肠杆菌(Escherichia coli)中, 使用IPTG于28°C诱导6小时后, 通过SDS-PAGE检测到目的蛋白, 分子量约为55 kDa, 并通过酶活力检测实验证明该蛋白具有耐高温α-淀粉酶活性。同时构建了该基因融合GFP的植物表达载体, 通过农杆菌(Agro- bacterium tumefaciens)介导瞬时转化烟草(Nicotiana tabacum)下表皮细胞并在荧光显微镜下观察, 发现在烟草下表皮细胞的细胞质和液泡中均有绿色荧光。使用I₂-KI溶液对乙醇脱色后的烟草叶片进行染色, 显色反应表明在烟草中表达的耐高温α-淀粉酶具有酶活性。最后, 采用农杆菌介导的花蕾浸泡法将重组载体转化到拟南芥(Arabidopsis thaliana)中, 筛选到稳定遗传的耐高温α-淀粉酶基因的拟南芥纯合子。研究结果为后期开展表达耐高温α-淀粉酶的转基因植物的相关研究奠定了实验基础。     

细胞色素P450还原酶与CYP17的共表达及其功能分析*

17α-羟基黄体酮(17α-OH-PROG)是甾体激素类药物的关键中间体,其生物合成主要由细胞色素单加氧酶(CYP17)催化生成。在此过程中,细胞色素 P450还原酶(cytochrome P450 reductase,CPR)作为细胞色素P450 酶电子传递链的重要组成部分,直接影响CYP17的催化效率。为研究不同来源CPR与17α-羟化酶的适配性,首先以人源17α-羟化酶作为研究对象,构建了表达质粒pPIC3.5k-hCYP17,获得了重组毕赤酵母菌株。其次筛选获得3种不同来源CPR,构建了表达质粒 pPICZX-CPR,获得17α-羟化酶与CPR共表达菌株,并在毕赤酵母中进行转化实验,对转化产物进行薄层色谱(TLC)和高效液相色谱(HPLC)分析。结果显示,重组菌株具有17α-羟化酶活性,能够催化黄体酮生成目标产物17α-OH-PROG 以及副产物16α-羟基黄体酮(16α-OH-PROG)。不同来源的CPR与17α-羟化酶共表达与仅表达17α-羟化酶的产率相比均有所提高,其中hCPR-CYP17共表达菌株表现出最高的转化水平,17α-OH-PROG产率提高42%。上述结果表明:17α-羟化酶基因与CPR共表达能够提高其黄体酮17α-羟基化水平。为甾体黄体酮17α-羟基化的生物催化研究提供思路,对甾体药物的工业生产具有重要意义。     

副干酪乳杆菌β-葡糖苷酶的表达、纯化及酶学性质研究 *

为了实现糖苷类物质的高效转化,将来源于副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)TK1501 β-葡糖苷酶基因连接于表达载体pET28a(+)上,在E. coli BL21中表达,重组酶经镍离子亲和层析分离得到纯酶,其分子质量和比酶活分别为86.63kDa和675.56U/mg。最适作用温度和pH分别为30℃和6.5。 Mg ²⁺和Ca ²⁺对β-葡糖苷酶酶活抑制作用最小,Cu ²⁺几乎使其丧失催化活性。其底物特异性较宽泛,对大豆异黄酮、栀子苷、水杨苷、七叶苷、虎杖苷、熊果苷均有降解作用。以β-pNPG为底物时,该酶的K_m和V_max分别为1.44mmol/L和58.32mmol/(L·s),催化系数k_cat为3 982/s。结果与分析表明,来源于副干酪乳杆菌TK1501 β-葡糖苷酶对水解大豆异黄酮和合成糖苷将会发挥重要作用。     

人β-半乳糖苷酶R299L突变体的获得与活性研究*

目的: GM1神经节苷脂贮积症是一种由半乳糖苷酶beta 1(galactosidase beta 1, GLB1)基因突变引起的β-半乳糖苷酶(β-galactosidase,β-gal)活性降低导致的严重的溶酶体贮积病。该病以进行性、致命性神经退行性病变为特征,目前尚无有效的治疗手段,AAV载体介导的基因治疗被认为是最有希望的治疗方法。通过基因定点突变获得具有较高β-gal活性的GLB1突变体,以期用于后续AAV介导的基因治疗。方法: 对人类和其他6种脊椎动物GLB1基因进行多序列比对分析,筛选出部分氨基酸位点进行定点突变,采用携带突变位点的重组质粒和AAV9载体转染或感染HEK-293细胞,比较突变体与未突变体的活性差异。对GM1模型鼠注射携带coGLB1-R299L的rAAV9病毒,探究该突变体的体内活性表达。结果: 从15个突变体中筛选出coGLB1-R299L突变体,经质粒转染导入细胞后,其β-gal活性比具有野生型氨基酸序列的coGLB1增加了30%~40%。AAV体外感染实验中,rAAV9-coGLB1-R299L组的β-gal活性较未感染的细胞对照组提升了约2.2倍。体内结果显示,rAAV9-coGLB1-R299L在模型鼠体内广泛表达,心脏、肝脏、脾脏、肺、脑组织中β-gal活性显著提升。结论: 获得了具有更高β-gal活性的突变体coGLB1-R299L,初步探究了rAAV9-coGLB1-R299L的体外表达效果和模型鼠体内β-半乳糖苷酶的表达与分布,为该突变体应用于AAV介导的GM1神经节苷脂病治疗奠定基础。     

烟曲霉TMS-26产紫杉醇补料分批发酵条件初步探索

内生真菌发酵法是解决紫杉醇药源短缺问题的有效途径之一。本研究以摇瓶分批发酵为基础,进行摇瓶补料分批发酵研究,探究了苯丙氨酸、甘氨酸、苯甲酸钠乙酸钠混合液、3,5-二硝基水杨酸、H₂O₂、CuSO₄在发酵周期（13d）中,不同添加时间点对TMS-26菌体量及紫杉醇产量的影响,发现在第8天添加苯丙氨酸、甘氨酸、3,5-二硝基水杨酸时,其产量分别达到了(664.80±40.34)µg/L、(628.72±30.44)µg/L、(641.36±19.62)µg/L;在第9天添加CuSO₄时,其产量达到了(697.46±15.76)µg/L;在第10天添加H₂O₂、苯甲酸钠乙酸钠混合液,其产量分别达到了(615.78±36.28)µg/L、(792.54±10.04)µg/L。在摇瓶补料分批发酵研究结果的基础上,进行了5L罐发酵工艺放大研究,探究了前体和诱导子通过进行一次补加和恒速补加的方式对Aspergillus fumigatus TMS-26菌体量及紫杉醇产量的影响,结果表明恒速补加苯丙氨酸乙酸钠混合液,紫杉醇产量达到了746.17µg/L。通过本次研究,优化了TMS-26产紫杉醇摇瓶补料分批发酵和5L罐发酵工艺,为后续实现紫杉醇工业化生产奠定基础。     

利用基因组改组技术提高短杆菌素产量及其培养条件优化*

短杆菌素是一种广谱抗菌肽,对细菌和真菌均有较好的抑制作用,具有潜在的抗生素替代价值。通过对侧孢短芽孢杆菌fmb70进行紫外诱变、亚硝基胍诱变、常压室温等离子体诱变,获得3株短杆菌素产量提高的诱变菌株。随后以诱变菌株为亲本进行两轮基因组改组,获得融合子F₂-24,其短杆菌素产量为(340.5±16.35) μg/mL,是野生菌株fmb70短杆菌素产量的1.92倍。融合子传代5代后,该菌株短杆菌素产量无明显差异,说明菌株稳定性良好。最后对该菌株产短杆菌素的培养基和发酵条件进行优化,优化后的培养基为:4%蔗糖、2%牛肉膏、0.5%氯化镁,发酵温度30℃、培养24 h、培养基初始pH6.0。优化后的短杆菌素产量可达(442.45±9.58)μg/mL,是初始培养条件的2.50倍。     

苯丙氨酸生物合成途径关键基因的串联表达

目的:改造大肠杆菌苯丙氨酸生物合成的中心代谢途径,优化关键酶基因pheA、aroF、ppsA、tktA的协同表达,进一步提高苯丙氨酸产量。方法:构建重组质粒pZE12-AFPT,鉴定后通过SDS-PAGE观察其蛋白表达量,并转入缺陷菌大肠杆菌MGΔ中构建工程菌,发酵培养后测量苯丙氨酸产量,与本室保存的重组质粒MGΔpZE12-AF做对比;构建重组质粒pZE21-AF和pZA31-PT,将后者转入感受态pZE12-AF和pZE21-AF中,得到双抗性质粒,并比较转化前后苯丙氨酸的产量。结果:工程菌MGΔpZE12-AFPT的苯丙氨酸产量比对照菌株MGΔpZE12-AF提高了近1.6倍,并且实现了4个串联基因的协同表达;质粒pZA31-PT转入pZE12-AF和pZE21-AF后,苯丙氨酸产量比原质粒pZE12-AF和pZE21-AF分别提高了近0.6倍和2.8倍。结论:实现了4个关键酶基因的串联表达,改造了苯丙氨酸的生物合成途径,使得苯丙氨酸产量有所提高,为进一步得到其高产菌株奠定了基础。     

过表达Bapt基因提高中国红豆杉细胞的紫杉醇产量

过表达紫杉醇合成关键酶基因是提高红豆杉细胞紫杉醇产量的有效方法.本文通过构建C-l3苯丙素侧链CoA-乙酰转移酶 (C-13 phenylpropanoid side chain CoA acetyltransferase,BAPT) 基因Bapt的表达载体p1303-SbaptN, 采用根癌农杆菌介导法转化中国红豆杉细胞,经潮霉素抗性筛选获得转基因细胞系.转基因细胞的PCR和Southern印迹分析结果表明,T-DNA及其包含的基因与宿主细胞染色体成功整合;Western印迹结果表明,转基因细胞中报告基因GusA-mgfp5正常表达;QRT PCR结果显示,转基因细胞的Bapt mRNA表达量是未转化细胞的1.26 倍;HPLC检测结果显示,转基因细胞的紫杉醇产量为37.4 μg/g,是未转化细胞的1.87倍. 本研究结果表明,过表达Bapt基因提高了中国红豆杉细胞的紫杉醇产量     

过表达pps基因和aroG~(fbr)基因对北京棒杆菌L-色氨酸合成的影响

【目的】通过增加北京棒杆菌(Corynebacterium pekinense)PD-67芳香族氨基酸合成的前体物质磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)的供应,解除终产物对芳香族氨基酸合成途径中第一个酶同时也是关键酶3-脱氧-D-阿拉伯庚酮糖-7-磷酸合酶(DS)的反馈抑制并提高抗反馈抑制的DS的活力,使碳流更多地流向芳香族氨基酸合成途径,从而积累更多L-色氨酸。【方法】运用PCR技术扩增北京棒杆菌PD-67磷酸烯醇式丙酮酸合酶基因pps,与表达载体连接构建重组质粒pXPS;运用重叠PCR技术定点突变大肠杆菌(Escherichia coli)受苯丙氨酸调控的DS基因aroG,使相应的编码氨基酸序列发生突变:Leu175Asp,新的基因命名为aroGfbr,与表达载体连接构建重组质粒pXA;构建pps和aroGfbr的共表达重组质粒pXAPS。将3个重组质粒分别转入菌株PD-67,构建工程菌株PD-67/pXPS、PD-67/pXA和PD-67/pXAPS。通过摇瓶发酵研究工程菌株的发酵特性。【结果】酶活分析结果表明,pps基因和aroGfbr基因在北京棒杆菌PD-67中均实现了表达。工程菌株PD-67/pXA粗酶液DS抗反馈抑制分析表明,AroGfbr已解除酪氨酸和苯丙氨酸的反馈抑制。过表达pps基因和aroGfbr基因分别使工程菌L-色氨酸产量提高12.1%和26.8%,双基因共表达可使工程菌的产酸量提高35.9%。【结论】北京棒杆菌PD-67pps基因的过表达以及大肠杆菌来源的解除反馈抑制的aroGfbr的过表达均有助于增加PD-67 L-色氨酸的合成,而双基因的共表达可以进一步提高L-色氨酸的积累量。     

草菇不同菌株RT-qPCR参考基因筛选

适合的参考基因是应用实时荧光定量PCR (RT-qPCR)技术进行基因表达分析的前提。本研究以7个食用菌常用参考基因(β-TUB 1、GPD、ACTB、Ras、α-TUB、β-TUB 2和SPRYp)为候选基因,利用RT-qPCR检测其在草菇常用生产菌株(CPS)V844、V5、V971和V844继代退化菌株(SDS) T8、T12、T16、T20中的表达;用Genorm、NormFinder和BestKeeper 3种软件分析候选基因的表达稳定性,并结合几何平均数法筛选出最佳参考基因。结果表明,SPRYp、α-TUB和β-TUB 2基因适用于草菇常用生产菌株检测,SPRYp、GPD和α-TUB基因适用于草菇继代退化检测,SPRYp基因适用于两种条件的检测。两两差异分析表明,草菇常用生产菌株的最佳参考基因组合为SPRYp、α-TUB和β-TUB 2,继代退化菌株的最佳参考基因组合为SPRYp和GPD,两种条件混合菌株的最佳参考基因组合为SPRYp和α-TUB。     

RNAi法分析广东虫草热激蛋白40 CgDnaJ05基因功能

DnaJ蛋白(热激蛋白40)在机体生长发育和适应逆境环境过程中起着重要作用。以广东虫草GDGM30035为材料,克隆获得CgDnaJ05基因,CDS为2 361 bp,编码786个氨基酸,生物信息学分析结果表明CgDnaJ05蛋白含有DnaJ蛋白结构域,属于碱性、不稳定和亲水性蛋白质。以CgDnaJ05蛋白DnaJ保守结构域240 bp的反向互补片段为干扰片段,构建CgDnaJ05基因的双向启动子沉默载体;通过根癌农杆菌Agrobacterium tumefaciens介导转化法侵染广东虫草菌丝,筛选获得9个相对稳定的CgDnaJ05沉默转化子。qRT-PCR分析表明,转化子CgDnaJ05相对表达量下调至野生型菌株的20%-82%;与野生菌丝相比,转化子菌丝生长速度显著下降,且CgDnaJ05下调越明显,菌丝减缓速度越显著,同时,转化子原基的形成受到显著抑制。研究表明：广东虫草CgDnaJ05基因明显影响广东虫草菌丝生长和原基形成,对广东虫草生长发育具有重要的调控作用。     

灰盖拟鬼伞核定位蛋白重组表达系统的构建

为构建灰盖拟鬼伞Coprinopsis cinerea的核定位蛋白重组表达系统,本研究通过蛋白序列比对和信息学分析,预测了灰盖拟鬼伞组蛋白H2B的核定位序列,构建了融合组蛋白H2B核定位序列的绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)重组表达载体,将该载体转入灰盖拟鬼伞AmutBmut菌...     

烟曲霉FADB基因参与菌株耐药的潜在机理

FAD结合的氧化还原酶编码基因FADB(GenBank ID:Afu4g14630)的编码产物在烟曲霉中为一种与E4D结合的氧化还原酶,可能参与真菌的呼吸.为了探究其具体功能,本研究通过克隆烟曲霉E4DB基因,构建烟曲霉FADB基因的敲除株,了解该基因对烟曲霉药物敏感性、渗透压、氧化压力物质敏感性的作用机理.采用高通量...     

根癌农杆菌介导的巨大口蘑遗传转化体系的构建

以巨大口蘑菌丝为受体材料,利用含有双元质粒plasmid4的根癌农杆菌EHA105介导,首次成功建立了巨大口蘑的遗传转化体系。通过潮霉素抗性筛选、PCR鉴定和绿色荧光蛋白的检测,表明潮霉素抗性基因（Hyg）已经整合到巨大口蘑基因组中,增强型绿色荧光蛋白基因（eGFP）在巨大口蘑菌丝中获得表达,并能够稳定遗传。本研究建立了农杆菌介导的巨大口蘑遗传转化体系,为今后巨大口蘑的基因功能研究奠定了基础。     

RNAi法分析香菇邻氨基苯甲酸合酶基因功能

邻氨基苯甲酸合酶（TrpE）是生物体内一种重要的逆境诱导蛋白,其在逆境条件下的响应保证了生物体生存相关产物的正常代谢。本文以香菇Lentinula edodes栽培菌株S606为试验材料,以LeTrpE功能结构保守区域395bp的反向互补片段为干扰片段,构建LetrpE基因双向启动子RNAi载体;采用根癌农杆菌介导转化法侵染香菇菌丝,通过PCR方法检测DNA插入片段,获得11个阳性转化子;实时荧光定量PCR分析结果表明,2个转化子LetrpE基因表达量较野生型菌株下调了2-3倍,确认其为LetrpE基因RNAi转化子;菌丝体在40℃高温处理24h后,检查到吲哚-3-乙酸合成途径中基因LeTam-1在野生菌株S606表达量上调,而在2个RNAi转化子中表达量下调;RNAi转化子菌丝体在25℃下不能恢复生长,而野生型菌丝体可以恢复生长。研究表明,香菇LetrpE基因的功能与耐热性有关。     

Heterologous expression of the Kluyveromyces marxianus endopolygalacturonase gene (EPG1) using versatile autonomously replicating vector for a wide range of host

A versatile plasmid shuttle vector system pKDU7 was constructed, which is useful for the heterologous gene expression in a wide range of Kluyveromyces and Saccharomyces strains. This cloning vector was constructed using the 1.6-μm circular plasmid pKD1 of Kluyveromyces drosophilarum, the URA3 gene of K. marxianus as well as the pUC19 sequences. The stability of vector in transformants strongly depends on the integrity of the functionally important elements of pKD1. It was shown by comparison of three recombinant vectors, which possessed the pKD1 sequence inserted in different ways. The efficient transformation and stability maintenance of the vector constructed in various strains of Kluyveromyces and Saccharomyces was shown by the expression of the EPG1 gene of the Kluyveromyces marxianus encoding pectin-degrading endopolygalacturonase.     

猕猴桃间座壳菌Diaporthe actinidiae的绿色荧光蛋白基因标记及侵染过程

果实软腐病是猕猴桃贮藏期间最严重的真菌病害,猕猴桃间座壳Diaporthe actinidiae是该病检出率最高且致病力最强的病原菌.该病菌从花前期开始侵染,至果实贮藏期才表现症状,侵染至发病周期较长,可借助荧光标记对其侵染过程进行研究.本研究采用PEG介导原生质体转化的技术,运用携带GFP及潮霉素抗性基因的双元载体p...     

双孢蘑菇萎锈灵抗性基因定点突变的载体构建与遗传转化

为建立更为安全、有效的双孢蘑菇遗传转化体系,构建了双孢蘑菇琥珀酸脱氢酶的铁硫蛋白亚基Agsdi1突变（His突变为Leu）表达载体pAgsdi1,并通过农杆菌介导方法转化双孢蘑菇W192,经萎锈灵筛选以及PCR扩增和MnlⅠ酶切验证后获得了转化菌株。验证结果表明,点突变的铁硫蛋白亚基Agsdi1可以作为双孢蘑菇有效的抗性标记基因。因其并未引入新的外源基因,是一种比潮霉素抗性基因更为安全的筛选标记,将可用于双孢蘑菇等食用菌的遗传转化。