流行性乙型脑炎病毒E蛋白主要抗原域的原核表达与间接ELISA检测方法的初步建立

重组质粒pET-E转化宿主菌BL21,经1.0mmol/LIPTG诱导,外源基因以包含体的形式获得高效表达。通过Westernblotting检测证明表达产物具有良好的抗原性。以纯化后表达产物作为诊断抗原包被酶标板建立了检测JEV抗体的间接ELISA方法。结果表明,抗原的最佳稀释度为1:2000,血清的最佳稀释度为1:200,待检血清阳性标准初步定为:OD490nm>1.2,且待检血清与阴性血清的OD490nm比值大于2。     

流行性乙型脑炎病毒E蛋白主要抗原域的原核表达与间接ELISA检测方法的初步建立

重组质粒pET-E转化宿主菌BL21,经1.0mmol/LIPTG诱导,外源基因以包含体的形式获得高效表达.通过Western blotting检测证明表达产物具有良好的抗原性.以纯化后表达产物作为诊断抗原包被酶标板建立了检测JEV抗体的间接ELISA方法.结果表明,抗原的最佳稀释度为12000,血清的最佳稀释度为1200,待检血清阳性标准初步定为OD490nm＞1.2,且待检血清与阴性血清的OD490m比值大于2.     

马动脉炎病毒GL蛋白主要抗原域的表达及间接ELISA的初步建立

在分析马动脉炎病毒GL蛋白抗原性的基础上,设计一对引物克隆GL蛋白一段抗原性较好的抗原域编码基因。将克隆的基因插入pET-32a的BamHⅠ和XhoⅠ之间构建了GL蛋白主要抗原域原核表达载体pET-GL1。将pET-GL1质粒转化BL(21)宿主菌后,对培养和表达条件进行了优化,实现了EAV GL蛋白主要抗原域的高效表达。免疫印迹试验表明获得的表达产物具有良好的反应原性。应用His.Bind亲和层析柱纯化重组EAV-GL1蛋白,以纯化的重组GL1蛋白作为检测抗原,初步建立了检测马动脉炎病毒抗体的iGL1-ELISA。结果表明,抗原的最佳包被浓度为9.65μg/mL,血清的最佳稀释度为1∶80,阳性标准初步定为:待检血清OD490>0.4,且待检血清OD490/阴性血清OD490>2。应用iGL1-ELISA对马血清样品进行检测,结果表明iGL1-ELISA与病毒中和试验的符合率达到94.1%,与国外同类试剂盒的符合率达到95.6%。     

猪瘟病毒E0蛋白的原核表达及其间接ELISA方法的建立

表达猪瘟病毒保护性抗原E0蛋白用以建立猪瘟抗体诊断方法,在标记疫苗(Marker vaccine)的研制和应用上具有重要的血清学鉴别功能,对于监测猪瘟病毒的流行情况和疫苗免疫情况及制定免疫程序具有重要作用.将猪瘟兔化弱毒株(HCLV)E0基因分别插入原核表达质粒pGEX4T,pET30,pMAL-p2X中,并分别以BL21和BL21-codonplus(DE3)-RP, BL21(DE3)和BL21-codonplus(DE3)-RP,TB1和BL21-codonplus(DE3)-RP为表达菌株.通过摸索IPTG诱导浓度,诱导温度,菌体收获时间,确定E0基因能在pGEX4T/ BL21-codonplus(DE3)-RP和pMAL-p2X/ BL21-codonplus(DE3)-RP中获得高效表达,表达产量分别占菌体总蛋白的15%和30%,表达的重组蛋白主要为包涵体形式.分别采用B-per试剂和超声波裂解配以曲通尿素对包涵体进行洗涤两种方法在pGEX表达系中取得了较好的效果.使用分步透析法对变性的包涵体进行复性,将复性蛋白过GST亲和层析柱得到纯化的GST-E0融合蛋白.以GST-E0融合蛋白为诊断抗原,通过摸索抗原包被浓度,抗体血清稀释倍数初步建立了用间接ELISA检测猪瘟血清E0抗体的方法,为进一步开发猪瘟抗体检测试剂盒奠定基础.     

猪细小病毒VP2蛋白主要抗原域间接ELISA方法的建立及初步应用

将已获得的含猪细小病毒VP2蛋白主要抗原域编码基因VP2I重组酵母菌株在优化的条件下进行诱导表达,表达产物蛋白含量达227.6μg/mL,在此基础上以重组蛋白作为包被抗原初步建立了检测猪细小病毒抗体水平的间接ELISA方法,并对该方法进行了优化,结果表明抗原最佳包被浓度5.69μg/mL,而血清最佳稀释倍数为1:80。阳性标准初步定为：OD待测样品＞0.5,且OD待测样品/OD阴性血清＞2.0。采用iVP2I-ELISA对猪血清样品进行检测,结果显示iVP2I-ELISA与HI试验的符合率为97.2%,与国外同类试剂盒的符合率达到91.2%。     

猪细小病毒VP2蛋白主要抗原域间接ELISA方法的建立

将已获得的含猪细小病毒VP2蛋白主要抗原域编码基因VP2I重组酵母菌株在优化的条件下进行诱导表达,表达产物蛋白含量达227.6μg/ml,在此基础上以重组蛋白作为包被抗原初步建立了检测猪细小病毒抗体水平的间接ELISA方法,并对该方法进行了优化,结果表明抗原最佳包被浓度5.69μg/ml,而血清最佳稀释倍数为1∶80.阳性标准初步定为:OD待测样品＞0.5,且OD待测样品/OD阴性血清＞2.0.采用iVP2I-ELISA对猪血清样品进行检测,结果显示iVP2I-ELISA与HI试验的符合率为97.2%,与国外同类试剂盒的符合率达到91.2%.     

猪瘟病毒E0蛋白的原核表达及其间接ELISA方法的建立

表达猪瘟病毒保护性抗原E0蛋白用以建立猪瘟抗体诊断方法,在标记疫苗(Marker vaccine)的研制和应用上具有重要的血清学鉴别功能,对于监测猪瘟病毒的流行情况和疫苗免疫情况及制定免疫程序具有重要作用.将猪瘟兔化弱毒株(HCLV)E0基因分别插入原核表达质粒pGEX4T,pET30,pMAL-p2X中,并分别以BL21和BL21-codonplus(DE3)-RP, BL21(DE3)和BL21-codonplus(DE3)-RP,TB1和BL21-codonplus(DE3)-RP为表达菌株.通过摸索IPTG诱导浓度,诱导温度,菌体收获时间,确定E0基因能在pGEX4T/ BL21-codonplus(DE3)-RP和pMAL-p2X/ BL21-codonplus(DE3)-RP中获得高效表达,表达产量分别占菌体总蛋白的15%和30%,表达的重组蛋白主要为包涵体形式.分别采用B-per试剂和超声波裂解配以曲通尿素对包涵体进行洗涤两种方法在pGEX表达系中取得了较好的效果.使用分步透析法对变性的包涵体进行复性,将复性蛋白过GST亲和层析柱得到纯化的GST-E0融合蛋白.以GST-E0融合蛋白为诊断抗原,通过摸索抗原包被浓度,抗体血清稀释倍数初步建立了用间接ELISA检测猪瘟血清E0抗体的方法,为进一步开发猪瘟抗体检测试剂盒奠定基础.     

非洲猪瘟病毒间接ELISA抗体检测方法的建立

非洲猪瘟(African swine fever,ASF)是一种急性、热性、高度接触性动物传染病,其病原为非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV),临床上以高热、网状内皮系统出血和高死亡率为特征,易感猪群病死率高达100%。为了建立一种基于合成肽技术的非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)抗体血清学检测方法。本研究根据ASFV p30、p54和p72三种重要抗原设计3条合成肽,以此为包被抗原建立了ASFV间接ELISA抗体检测方法,并验证其敏感性、特异性、稳定性以及与进口试剂盒的符合率。结果显示,建立的间接ELISA方法的敏感性为91.4%,特异性为98.1%,批内和批间变异系数分别为3.7%～10.1%和4.7%～14.9%。与进口试剂盒比较,符合率为92.9%。结果表明该方法检测结果准确性高、且稳定性好,可检测ASFV特异性抗体。     

猪瘟兔化弱毒株E2基因的原核表达及间接ELISA的初步建立

猪瘟病毒E2蛋白C端含有一段30多个疏水性氨基酸组成的跨膜区域(Transmembraneregion,TMR),用RTPCR和巢式PCR分别扩增了含不同长度TMR的猪瘟兔化弱毒E2基因,并克隆入pGEX4T1的MCS中,构建了原核表达载体pGEXTE2339(无TMR)、pGEXTE2355(1TMR)、pGEXTE2375(3TMR)。因E2基因含有大量大肠杆菌稀有密码子,选择了BL21CodonPlus(DE3)RP作为表达受体菌,结果表明pGEXTE2339、pGEXTE2355以包涵体的形式正确表达了目的蛋白,而pGEXTE2375没有明显表达。并利用pGEXTE2339、pGEXTE2355表达的融合蛋白初步建立了间接ELISA方法。     

猪瘟兔化弱毒株E2基因的原核表达及间接ELISA的初步建立

猪瘟病毒E2蛋白C端含有一段30多个疏水性氨基酸组成的跨膜区域(Transmembrane region,TMR),用RT-PCR和巢式PCR分别扩增了含不同长度TMR的猪瘟兔化弱毒E2基因,并克隆入pGEX-4T-1的MCS中,构建了原核表达载体pGEXTE2-339(无TMR)、pGEXTE2-355(1TMR)、pGEXTE2-375(3TMR).因E2基因含有大量大肠杆菌稀有密码子,选择了BL21-CodonPlus(DE3)-RP作为表达受体菌,结果表明pGEXTE2-339、pGEXTE2-355以包涵体的形式正确表达了目的蛋白,而pGEXTE2-375没有明显表达.并利用pGEXTE2-339、pGEXTE2-355表达的融合蛋白初步建立了间接ELISA方法.     

猪瘟病毒保护抗原E2和猪IgG重链基因的合成及其表达蛋白

根据已发表文献及DNAstar软件分析 ,选取双拷贝Shimen株猪瘟病毒E2基因A ,D区和猪IgG重链中可与SPA非特异性结合的区域作为目的基因进行串联表达。根据GenBank发表的序列 ,Primer5 0软件的辅助下分别设计三对引物 ,并在扩增第二条和第三条片段的上游引物 5′端分别设计一个长 5个氨基酸的Linker,将扩增的三片段串联克隆入原核表达载体pET 32a中 ,构建成重组质粒pET 2eh ,对重组质粒诱导表达 ,表达蛋白经纯化后标记于CowanⅠ株金黄色葡萄球菌SPA上 ,与收集的 80份待检血清进行平板凝集试验 ,结果与现有诊断试剂盒检测结果具有较好的符合性。该方法具有简单 ,快速 ,敏感 ,易于操作的特点。     

含CSFV E2基因A/D区原核表达载体的构建、表达及其抗原性研究

应用RT PCR方法扩增了编码猪瘟病毒石门株 (CSFVshimenstrain)囊膜糖蛋白E2全基因 ,然后将其克隆到pMD 1 8T质粒中 ,获得重组质粒pMD E2。再以pMD E2为模板 ,另行设计两对引物 ,同时扩增其中一段适于在E .coli中表达且抗原反应性较好的基因片段 (E2蛋白A D抗原区基因序列 ) ,将扩增的两片段串联插入原核表达载体pET 32a中构建成重组质粒pET 2e。用酶切和序列分析鉴定插入目的基因的正确性。SDS PAGE和Western blot分析表明 ,经pET 2e转化、IPTG诱导的受体菌可表达目的蛋白 ,克隆在硫氧还蛋白 (thioredoxinprotein ,TrxA)基因下游的E2蛋白基因与TrxA基因获得了高效融合表达 ,并且具有免疫学反应活性 ,这为猪瘟的血清学诊断方法的建立打下了基础 。     

Expression of major antigen domains of E2 gene of CSFV and analysis of its immunological activity

E2 is an envelope glycoprotein of Classical swine fever virus (CSFV) and contains sequential neutralizing epitopes to induce virus-neutralizing antibodies and mount protective immunity in the natural host. In this study, four antigen domains (ABCD) of the E2 gene was cloned from CSFV Shimen strain into the retroviral vector pBABE puro and expressed in eukaryotic cell (PK15) by an retroviral gene expression system, and the activity of recombinant E2 protein to induce immune responses was evaluated in rabbits. The results indicated that recombinant E2 protein can be recognized by fluorescence antibodies of CSFV and CSFV positive serum (Lanzhou Veterinary Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Lanzhou, China) using Western blot, indirect immunofluorescence antibody test (IFAT) and ELISA, Furthermore, anti-CSFV specific antibodies and lymphocyte proliferation were elicited and increased by recombinant protein after vaccination. In the challenge test, all of rabbits vaccinated with recombinant protein and Chinese vaccine strain (C-strain) were fully protected from a rabbit spleen virus challenge. These results indicated that a retroviral-based epitope-vaccine carrying the major antigen domains of E2 is able to induce high level of epitope-specific antibodies and exhibits similar protective capability with that induced by the C-strain, and encourages further work towards the development of a vaccine against CSFV infection. Foundation items: The National “973” (2005CB523201); Key Technology R&D Programme (2006BAD06A03).     

含双拷贝CSFV E2基因A和D片段原核表达载体的构建及表达

猪瘟是严重危害养猪业的传染病,该病具有高度接触传染性,其流行性广,发病率高,死亡率高,危害极大,被世界动物卫生组织(OIE)列为A类传染病之一。本病的主要临床特征是高热、实质器官出血、淋巴细胞和血小板减少,而怀孕母猪多发生繁殖防碍。每年,猪瘟的发生都为国家造成巨大的经济损失。猪瘟的病原是猪瘟病毒,属于黄病毒科瘟病毒属成员,是单股正链RNA病毒[1]。囊膜糖蛋白E2是猪瘟病毒的主要保护性抗原[2,3]。E2蛋白可诱导机体产生坚强的中和性免疫保护,具有良好的免疫原性和反应原性[4~6] ,这为本病的诊断提供了重要的分子生物学及免疫学…     

含双拷贝CSFV E2基因A和D片段原核表达载体的构建及表达

猪瘟是严重危害养猪业的传染病,该病具有高度接触传染性,其流行性广,发病率高,死亡率高,危害极大,被世界动物卫生组织(OIE)列为A类传染病之一.本病的主要临床特征是高热、实质器官出血、淋巴细胞和血小板减少,而怀孕母猪多发生繁殖防碍.每年,猪瘟的发生都为国家造成巨大的经济损失.     

An Indirect ELISA of Classical Swine Fever Virus Based on Quadruple Antigenic Epitope Peptide Expressed in E.coli

In this study,a synthesized quadruple antigenic epitope gene region of the classical swine fever virus (CSFV)E2 glycoprotein was expressed in E.coli to a obtain target protein.This target protein was used as a coating antigen to establish an indirect ELISA for specifically detecting anti-CSFV antibodies in serum samples from pigs.The P/N cut-off value of this assay was 1.92 by receiver operating characteristic curve(ROC)analysis based on 30 negative sera and 80 positive samples.The test gave 97.5%sensitivit...     

Expression of Major Antigen Domains of Gene of E2 CSFV and Analysis of its Immunological Activity

E2 is an envelope glycoprotein of Classical swine fever virus (CSFV) and contains sequential neutralizing epitopes to induce virus-neutralizing antibodies and mount protective immunity in the natural host. In this study, four antigen domains (ABCD) of the E2 gene was cloned from CSFV Shimen strain into the retroviral vector pBABE puro and expressed in eukaryotic cell (PK15) by an retroviral gene expression system, and the activity of recombinant E2 protein to induce immune responses was evaluated in rabbits. The results indicated that recombinant E2 protein can be recognized by fluorescence antibodies of CSFV and CSFV positive serum (Lanzhou Veterinary Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Lanzhou, China) using Western blot, indirect immunofluorescence antibody test (IFAT) and ELISA, Furthermore, anti-CSFV specific antibodies and lymphocyte proliferation were elicited and increased by recombinant protein after vaccination. In the challenge test, all of rabbits vaccinated with recombinant protein and Chinese vaccine strain (C-strain) were fully protected from a rabbit spleen virus challenge. These results indicated that a retroviral-based epitope-vaccine carrying the major antigen domains of E2 is able to induce high level of epitope-specific antibodies and exhibits similar protective capability with that induced by the C-strain, and encourages further work towards the development of a vaccine against CSFV infection.     

猪瘟病毒p80基因NTPase/RNA解旋酶功能区在E.coli中的表达

采用PCR技术扩增出猪瘟病毒GXYL株和C株p80基因的NTPase／RNA解旋酶功能区(sGXNS3和sCNS3),将其克隆到表达载体pET-30a( )中,获得重组质粒pET—sGXNS3和pET～sCNS3。PCR、酶切和序列分析鉴定目的基因插入位置、方向和读码框完全正确。1．0mmol／L IPTG诱导得到分子量为26kD的目的蛋白。Western blot检测表明,表达的目的蛋白能被CSFV阳性血清识别。     

猪瘟病毒野毒株持续感染细胞模型的建立

采用猪瘟病毒野毒珠（ＣＳＦＶ３９）感染猪肾传代细胞系ＰＫ－１５,经连续传７９代,建立了稳定的病毒持续感染细胞模型,获得ＣＳＦＶ３９－ＰＫ１５细胞株。用免疫荧光、ＲＴ－ＰＣＲ检测、透射电镜跟踪观察了ＣＳＦＶ３９－ＰＫ１５细胞株连续传代中病毒在细胞内的存在情况。结果表明第９,２９,７９代细胞仍有猪瘟病毒存在,表现出病毒持续感染的基本特征。这为深入研究猪瘟病毒持续感染机理奠定了基础。