全自动直接定量法与定量比值法检测红细胞葡糖-6-磷酸脱氢酶活性的比较

目的:与定量比值法比较,探讨全自动直接定量法检测红细胞葡糖-6-磷酸脱氢酶(G-6-PD)活性的可行性。方法:同时采用定量比值法(即硝基四氮唑蓝定量法)和全自动直接定量法,检测219例肝素抗凝静脉血标本的红细胞G-6-PD活性。结果:定量比值法检测G-6-PD缺乏的阳性率为9.13%,全自动直接定量法检测的G-6-PD缺乏阳性率为9.58%,两种方法检测结果无显著性差异(P>0.05)。结论:定量比值法简单易行,适用于卫生条件有限的基层医疗单位;全自动直接定量法快速准确,是一种可批量检测的理想筛选方法。     

基于金属-生物分子骨架(Bio-MOF-11)材料催化性能的牛奶中大肠杆菌O157∶H7快速定量检测

本研究的目的是建立一种基于金属-生物分子骨架催化性能的快速定量检测牛奶中大肠杆菌O157:H7的新方法。以腺嘌呤和醋酸钴为原料,N,N-二甲基甲酰胺(DMF)为溶剂合成一种钴金属-生物分子骨架(Bio-MOF-11)。对Bio-MOF-11的催化性能进行研究,发现Bio-MOF-11具有和辣根过氧化物酶(HRP)类似的催化活性,并能在无过氧化氢(H_2O_2)存在的情况下催化3,3′,5,5′-四甲基联苯胺(TMB)显色。基于此建立一种通过磁性微球进行特异性富集,通过检测与靶标结合的Bio-MOF-11的量间接检测牛奶中大肠杆菌O157:H7的方法,该方法的线性范围为3×10~(3-6 )CFU/mL,检测限为8 CFU/mL,检测时间为25 min。该方法能快速,简单,高灵敏度、高选择性定量地检测出牛奶中的大肠杆菌O157:H7,在食源性致病菌的快速筛查中具有重要的应用价值。     

适用于分离人肠道中双歧杆菌的选择性培养基

【目的】比较并评价5种双歧杆菌选择性培养基对人源双歧杆菌的分离效果,试图筛选出一种适用于人肠道中双歧杆菌分离培养的选择性培养基。【方法】采集6份健康人粪便样品稀释涂布于5种选择性培养基上,厌氧培养后计数菌落并挑选单菌落进行鉴定。同时提取样品中细菌宏基因组DNA,应用变性梯度凝胶电泳技术(Denaturing Gel Gradient Electrophoresis,DGGE)和荧光定量PCR技术(Quantitative Polymerase Chain Reaction,q-PCR)揭示样品中双歧杆菌种类和数量,并以此为依据,客观评价上述5种选择性培养基的分离效果。【结果】BSM培养基和BLM培养基上双歧杆菌的计数结果与q-PCR的定量结果最为接近,并显著高于其它3种培养基。BLM培养基上分离到双歧杆菌的种类与DGGE图谱多样性分析的结果最为接近。【结论】BLM培养基是一种适用于人肠道中双歧杆菌分离培养的选择性培养基。     

2种检测人偏肺病毒感染的荧光定量PCR方法的应用比较

目的:比较基于人偏肺病毒(hMPV)N或L基因的2种检测hMPV感染的荧光定量PCR方法在207例临床呼吸道样本检测中的应用效果。方法:建立基于hMPV N或L基因片段的荧光定量PCR方法,检测2008年5月至2009年3月在北京儿童医院因急性呼吸道感染的住院患儿鼻咽拭子207份,比较2种方法检出率的敏感性和特异性。结果:在207份样本中,2种方法共检出38(18.36%)份阳性样本,基于N或L基因一种方法均检出32(15.46%)份阳性样本,总检出符合率为94.2%(195/207)。另外发现,基于L基因检测为阴性而基于N基因检测为阳性的样本在L基因与引物和探针结合的部分序列有核苷酸的突变。对19例阳性样本的F基因进行进化树分析发现,大多数hMPV属于A2和B2型,只有1例属于B1型。结论:2种荧光定量PCR方法的联合应用,对于临床样本中hMPV的检测更为敏感。     

不同年龄组健康人群肠道肠球菌含量及菌型分布调查

本文用选择性培养基(EC)对三个年龄组共91例健康人群大便进行了肠道肠球菌定量分析和菌型分布调查.结果表明,幼儿组、成年组和老年组的肠球菌活菌数分量分别为6.38±0.65、6.91±1.04、7.13±1.21(log(?)±s/克便),经统计学处理,幼儿组与成年组、老年组之间差异有显著性,而成年组与老年组之间差异无显著性.本次肠球菌的检出率为78.0%;菌型分布以屎肠球菌、肠肠球菌为主,粪肠球菌和坚忍肠球菌为次.本文就检测肠球菌含量来预测和评价宿主体健康状况的可能性进行了探讨。     

人4型腺病毒拷贝数SYBR Green Ⅰ实时定量PCR检测方法的建立

目的:建立检测人4型腺病毒拷贝数的荧光定量PCR方法。方法:提取本实验室构建的4型腺病毒全基因组质粒,以梯度稀释质粒为标准模板,选取人4型腺病毒六邻体区域基因设计一对特异性引物,进行SYBR GreenⅠ荧光定量PCR扩增并制作标准曲线。结果:标准曲线为y=-4.284x+53.468,由全基因组质粒所构建的标准曲线线性关系良好,扩增反应Ct值与拷贝数的对数呈线性关系(R2=0.999 609),检出敏感度可达1×102拷贝/μL,且与其他几种腺病毒无交叉反应。用该方法检测4型腺病毒感染细胞2、12和24 h后的病毒拷贝数,其病毒拷贝数随时间增加,与细胞病变(CPE)变化保持一致,且荧光定量PCR的测量结果稳定(变异系数6%)。结论:建立了检测人4型腺病毒基因拷贝数的荧光定量RT-PCR方法,该方法灵敏度高、特异性强。     

生物安全三级实验室2种防护型口罩的定量适合性测试比较

目的:对2种防护型口罩(3M1860杯状、3M9332折叠型)进行定量适合性检测,为实验人员合理选择防护型口罩提供依据。方法:使用Model8038型口罩定量适合性检测仪,检测68名实验人员对这2种防护型口罩的适合性,并对每种防护型口罩在检测时规定动作的适合性因子数进行统计学分析。结果:68名测试人员中,有49人通过3M1860适合性检验,41人通过3M9332适合性检验。在不同及相同动作下,规定动作对2种防护型口罩适合性通过率均无差异(P0.05)。对2种防护型口罩的68次适合性检测的规定动作进行适合性因子分析,发现3M1860杯状口罩除深呼吸(P=0.567)对其初次佩戴口罩适合性的影响无差异外,其他动作(左右转头、低头抬头、说话、弯腰)均对其适合性影响有差异(P0.050);3M9332折叠型口罩,说话(P=0.000)及弯腰(P=0.000)对初次佩戴口罩适合性的影响有差异,其他动作(深呼吸、左右转头、低头抬头)对其适合性影响无差异。结论:在口罩定量适合性检测通过的情况下,根据每一项动作的适合性因子数,选择适合自己实验活动的防护型口罩,提高口罩的防护效果,保障实验人员的安全。     

2种微小RNA实时定量PCR检测方法的比较

目的:对目前最常用的检测微小RNA(miRNA)的茎环实时定量PCR法和PAP实时定量PCR法进行比较。方法:分别用茎环实时定量PCR法和PAP实时定量PCR法检测人乳腺癌细胞MCF-7中U6和23种miRNA的表达,利用定量PCR分析软件和琼脂糖凝胶电泳方法,将2种方法在引物设计难度、特异性与灵敏度,以及检测通量方面进行比较。结果:茎环法的特异性和灵敏度比PAP法高,但引物设计难度大,检测通量低;PAP法引物设计难度较低,检测通量较高,但特异性和灵敏度较差。结论:茎环法实时定量PCR适于有针对性地检测小规模miRNA,而PAP法则适于大规模miRNA筛选实验。     

实时荧光定量PCR 检测人肿瘤细胞NKG2D 配体基因表达

目的:建立人肿瘤细胞NKG2D配体基因(MICA、MICB、ULBP1、ULBP2、ULBP3)表达的实时荧光定量PCR(real-timefluorescence quantitative PCR)检测方法。方法:根据NCBI基因库中NKG2D配体基因序列,设计合成引物。用Trizol法从培养的肿瘤细胞(BEC-7402、HeLa、MDA-MB-435、XWLC-05)中提取总RNA,逆转录成cDNA,建立实时荧光定量PCR检测NKG2D配体基因表达的方法,并检测NKG2D配体在肿瘤细胞株中的表达。结果:经过琼脂糖凝胶电泳、熔解曲线和标准曲线分析,用所设计的引物和SYBR Green I能够特异扩增和定量检测NKG2D配体基因的表达。该方法成功检测4种肿瘤细胞NKG2D配体基因的表达。结论:建立了人NKG2D配体基因表达的实时荧光定量PCR检测方法,为进一步研究人NKG2D配体在肿瘤免疫中的作用提供了有效手段。     

哈慈多V士谷精润肠通便功能的人体观察

本文选择30例成年便秘患者,服用哈慈多V士谷精30天,观察受试者服用前后两次排便间隔时间、大便中水分含量、大便的pH值、大便的性状、排便量和血常规的变化,进行比较。结果表明:服用哈慈多V士谷精后比未服前的两次排便间隔时间明显缩短,大便中水分含量明显增多,大便pH值明显降低,大便性状明显变软,排便量增多,经统计学处理(P<0.05)结果显著,血常规无明显改变(P>0.05)。     

聚乙二醇重组人促红细胞生成素在食蟹猴体内的药代动力学检测方法

目的:建立2种灵敏度高、特异性好且快速的ELISA方法,用以检测食蟹猴血浆中的聚乙二醇重组人促细胞生成素(EPO)含量。方法:建立了2套双抗夹心的ELISA方法对聚乙二醇重组人EPO进行定量,包括PEG特异性ELISA(检测完整药物)及EPO特异性ELISA(检测总EPO)。完整药物检测:包被小鼠抗重组人EPO单抗,加入稀释的血浆样品,之后加入稀释的生物素标记的兔抗PEG单抗(检测抗体)及链亲和素-HRP(酶标抗体),再加入TMB底物显色,2 mol/L硫酸终止,在酶标仪上用双波长读取D_(450/600nm)值。总EPO检测:包被小鼠抗重组人EPO单抗,加入稀释的血浆样品,之后加入稀释的兔抗重组人EPO多抗-HRP(酶标抗体),再加入TMB底物显色,2 mol/L硫酸终止,在酶标仪上用双波长读取D_(450/600nm)值。结果:建立并验证了2套ELISA方法,定量范围均为4~54 ng/mL,定量下限均为4 ng/mL,准确度和精密度(板内和板间)均在±15%之内(总EPO检测时以聚乙二醇重组人EPO为标准品),同时室温稳定性、冻融稳定性、长期稳定性及稀释线性(空白猴血浆稀释)均良好。结论:方法学确证表明,2套ELISA方法具有良好的灵敏度、准确度、特异性和可重复性,可用于定量测定食蟹猴血浆中聚乙二醇重组人EPO的浓度。     

基于固态基底的SERS免疫检测新方法研究

目的:通过引入新型表面增强拉曼散射(SERS)检测探针(Au-DTNB-Tyr NPs)和金标银染技术,建立基于固态硅片基底的SERS免疫检测新技术。方法:羊抗人IgM-HRP作为检测抗体,在硅片基底上检测不同浓度的人IgM,HRP催化SERS检测探针沉积,利用金标银染技术增强SERS信号。结果:所建立的SERS免疫检测新方法检测人IgM的检测限为10 pg/mL,且SERS信号强度与人IgM浓度具有良好的线性关系(R2=0.993)。结论:基于硅片基底的SERS免疫检测新技术可高灵敏地定量检测人IgM,为实现固态硅片基底对多种抗原的高通量集成化检测奠定了基础。     

土壤中立枯丝核菌AG3菌核的荧光定量PCR快速检测

立枯丝核菌Rhizoctonia solani融合群3(anastomosis group 3,AG3)是引发马铃薯黑痣病的主要病原菌,严重威胁着马铃薯产业的发展。菌核是马铃薯黑痣病菌在土壤中的主要存活结构,是马铃薯黑痣病的初侵染源,其密度直接影响马铃薯黑痣病的发病率和严重程度。为快速准确地检测出土壤中菌核的密度,本研究以立枯丝核菌AG3转录间区(ITS)特异性引物RsTqF1/RsTqR1扩增产物的重组质粒为标准品,构建SYBR Green I实时定量PCR(q PCR)检测体系,结合水筛法与Fast DNA?Spin Kit for Soil土壤DNA提取试剂盒对土壤样品进行DNA提取,建立了循环域值(Ct)与土壤中立枯丝核菌AG3菌核密度的关系,并与传统选择性培养基筛选法进行比较。结果表明,实时定量PCR检测灵敏度比常规PCR高10倍,土壤中菌核密度n(g/g土)和Ct值之间的关系为:n=10(9.6917‐Ct)/3.4558。相比较于选择性培养基筛选法,水筛q PCR法能够更加快速准确地检测出土壤中立枯丝核菌的菌核密度。     

SYBR Green Ⅰ荧光定量RT-PCR检测埃博拉病毒方法的建立

为了建立一种快速准确的检测埃博拉病毒(EBOV)亚型的方法。本研究根据GenBank中公布的EBOV NP基因序列,通过设计引物和优化反应条件,建立了一种SYBR GreenⅠ荧光定量RT-PCR检测方法检测EBOV。以体外转录的EBOV RNA为模板进行试验,该方法检测的灵敏度可以达到1.0×102个拷贝/μL,检测范围达到9个数量级为102～1010,可检测5种亚型EBOV。建立的方法对马尔堡病毒(MARV)、登革病毒(DENV)、新疆出血热病毒(XHFV)、乙型脑炎病毒(JEV)、流感病毒(H1N1和H3N2)和猪繁殖和呼吸综合征病毒(PRRSV)E基因组RNA无非特异性扩增。本文将荧光定量RT-PCR技术用于埃博拉病毒的定量检测中,并且建立了EBOV SYBRGreenⅠ荧光定量RT-PCR检测方法。     

实时荧光定量PCR方法检测小RNA

<正>Real-time QuantitativePCR Detecting System,即实时定量核酸扩增检测系统,也称为实时定量基因扩增检测系统,简称定量PCR(qPCR)。荧光定量PCR一般分为非特异性荧光定量PCR和特异性荧光定量PCR。本文主要介绍一种应用非特异性荧光定量PCR(以SYBR Green I为例)方法对小RNA进行定量分析。SYBRGreen I qPCR分析小RNA的优点为:实验设计简单,一般需要一条特异性反转录引物,一条特异性正向PCR引物,反向PCR引物可通用于所有小RNA分析,无需象TaqMan方法那样专门设计探针;实验成本相对较低;可通过溶解曲线分析来检测扩增反应的特异性。这些特点有利于初学者掌握该技术,而对于一般的分析也可以完全达到实验目的。操作方法如下:     

实时定量聚合酶螺旋反应定量检测变形链球菌方法的建立

目的:建立实时定量检测口腔内变形链球菌的实时定量聚合酶螺旋反应(PSR)方法。方法:针对变形链球菌的gtf B基因设计4套引物,通过实时浊度法和显色法两种方法判断结果。结果:从4套引物中筛选出最佳引物,并确定最佳温度为65℃;进一步实验表明采用最佳引物能特异性地检测变形链球菌,与13种其他病原核酸无交叉反应,敏感性达10拷贝/μL。结论:建立了实时定量检测变形链球菌的PSR方法,该方法具有简单快速、特异性强、敏感性高的特点,为实时定量检测变形链球菌提供了新技术。     

双歧杆菌活菌制剂(回春生)治疗因菌群失调所致霉菌感染的疗效观察

11例患各种心脏病合并重症细菌性感染的病人,用头孢噻肟钠每日128—16g静滴治疗的1—3周时,对有鹅口疮者做口腔粘膜涂片及有腹痛,腹泻者作大便涂片直接镜检均见霉菌菌丝及孢子,再用常规定量滴注法测大便双歧杆菌数(其对数平均值为1±1.28)明显低于健康人。此时,不停用抗生素并口服回春生(大连医学院微生态研究室研制)每日2～4g,早、晚各一次口服,连服2周后.复查11例病人口腔粘膜涂片及大便涂片镜检均未见霉菌菌丝及孢子.测大便双歧杆菌数量接近正常(7±1.68)。     

人博卡病毒TaqMan探针实时定量PCR检测方法的建立及初步应用

目的:建立人博卡病毒(HBoV)核酸特异、快速、敏感的TaqMan探针实时定量PCR检测方法,并对临床样本进行检测。方法:比对编码HBoV非结构蛋白NP-1的基因序列,选取其保守片段设计引物和探针,建立实时荧光定量PCR检测方法,并与传统PCR方法进行比较,然后分别对两者的灵敏性、特异性、稳定性及临床样本检验的适用性等进行评价。结果:所建立的实时定量PCR检测方法可用于HBoV的特异性检测;相对于传统PCR所达到的250拷贝/反应的检测灵敏度,实时定量PCR的检测灵敏度可高达10拷贝/反应,检测范围为109～101拷贝/反应,且具有良好的特异性和重复性;初步用于76份临床呼吸道标本检测,检出阳性5例,高于普通PCR方法(3/76)。结论:建立了HBoV TaqMan探针实时定量PCR检测方法,并可用于临床鼻咽拭子样本的检测,为开展HBoV流行病学监测及早期临床诊断提供了技术手段。     

人偏肺病毒TaqMan-MGB探针实时定量RT-PCR检测方法的建立及初步应用

目的:建立人偏肺病毒(hMPV)核酸特异的快速、敏感的TaqMan-MGB探针实时定量RT-PCR检测方法.方法:分别设计hMPV特异的引物与荧光标记探针,合成hMPV绝对定量RNA模板,建立实时荧光定量PCR方法,并与常规RT-PCR平行比较,对其灵敏性、特异性和可重复性,以及用于临床样本的适用性等进行评价.结果:本方法可对hMPV进行特异性诊断,检测灵敏度可达10拷贝/25 μL,检测线性范围至少可达10 1～10 6拷贝/反应,且实验重复性好,初步应用于北京地区采集的158份临床鼻咽拭子标本,定量RT-PCR检出31份标本阳性,明显高于常规RT-PCR方法(22/158).结论:建立了人偏肺病毒TaqMan-MGB探针定量RT-PCR检测方法,并初步证实可用于临床鼻咽拭子标本的检测,为开展hMPV的流行监测及临床早期诊断提供了技术手段.     

用微计算机定量检测人股四头肌反射性肌电图和收缩波形

人股四头肌腱反射的定量检测,由于种种原因,至今仍未能在临床广泛应用。本文介绍一种方法,可将人股四头肌反射性肌电图(Q-EMG)、收缩反应和髌腱的叩击力直接显示于微型机屏幕,同时,对若干参数迅速作出定性和定量分析,为客观判定提供依据。