用YADE法克隆球孢白僵菌类枯草杆菌蛋白酶基因CDEP-1的启动子及启动子序列分析*

扩增与已知序列相连的未知序列是一项常用的分子生物学技术。与其它方法相比,目前在棉花上应用的YADE法具有效率高,成本低和假阳性低等特点。因此,作者尝试将该法引入到昆虫病原真菌的分子生物学研究,并取得了成功,建立了适合于球孢白僵菌和金龟子绿僵菌的YADE的技术体系。类枯草杆菌蛋白酶在昆虫病原真菌穿透寄主体壁时起重要作用,作者在已克隆的球孢白僵菌类蛋白酶基因CDEP-1的基础上,利用YADE法,克隆类球孢白僵菌类枯草杆菌蛋白酶基因CDEP-1的启动子CDEPP。序列分析发现:CDEPP中没有明显的TATA和CAAT框,含有8个可能的碳调控因子的结合位点5'>(g/c)YggRg<3'和2个氮调控因子的结合位点——相隔很近的GATA。这与CDEP-1的表达受碳/氮抑制的结果一致。本文的结果将会为研究CDEP-1的表达规律奠定基础。     

球孢白僵菌降解昆虫体壁蛋白酶基因 CDEP-1的克隆与序列分析

构建了球孢白僵菌不同诱导时间的混合cDNA文库。根据丝氨酸类蛋白酶的保守区域设计引物,以构建cDNA文库同样的mRNA为模板,采用RT-PCR法得到长度为594bp的片段BbP。序列测定表明BbP是球孢白僵菌类枯草杆菌蛋白酶Prl的一部分,以BbP为探针,从上述cDNA文库筛选得到长度为1557bp的克隆CDEP-1。CDEP-1含有一个1134bp的开放阅读框（ORF）,编码377个氨基酸,分子量为38616、PI=8.302的蛋白酶前体。CEDP-1的核苷酸序列与蛋白酶K、金龟子绿僵菌Prl、球孢白僵菌Prl的同源性分别为：57.9%、54.7%、83.3%。根据cDNA序列扩增到CDEP-1的基因组序列,分析表明其中含有3个内含子。Southern杂交表明CDEP-1在球孢白僵菌是单拷贝。     

球孢白僵菌FUS3/KSS1类MAPK同源基因(BbMPK1)的克隆及特征分析

根据几种丝状真菌FUS3/KSS1类MAPK的保守序列设计简并引物,从昆虫病原真菌球孢白僵菌中扩增出MAPK基因的部分片段,进而利用YADE法延伸该片段的上、下游邻接序列,获得MAPK基因的全长序列,命名为BbMPK1。用3′RACE扩增出BbMPK1的全长cDNA序列,该序列含有一个1071bp的ORF,编码356个氨基酸的多肽,推测分子量为41.2kDa,等电点为6.61。BbMPK1含有11个MAPK共有的蛋白激酶区域和1个MAPK激酶作用的磷酸化位点区域(TEY),其氨基酸序列与丝状真菌的TMKA、PMK1、CMK1、FMK1和BMP1等MAPK高度同源。系统聚类结果表明,BbMPK1属于酵母FUS3/KSS1类MAPK。Southern杂交表明,BbMPK1在球孢白僵菌基因组中以单拷贝形式存在。RT-PCR分析表明BbMPK1在分生孢子休眠阶段、萌发阶段和菌丝生长时期均表达。研究结果为阐明酵母FUS3/KSS1类MAPK同源基因在球孢白僵菌中的作用奠定了基础。     

球孢白僵菌FUS3／KSS1类MAPK同源基（BbMPK1）的克隆及特征分析

根据几种丝状真菌FUS3／KSS1类MAPK的保守序列设计简并引物,从昆虫病原真菌球孢白僵菌中扩增出MAPK基因的部分片段,进而利用YADE法延伸该片段的上、下游邻接序列,获得MAPK基因的全长序列,命名为BbMPK1。用3’RACE扩增出BbMPK1的全长cDNA序列,该序列含有一个1071bp的ORF,编码356个氨基酸的多肽,推测分子量为41．2kDa,等电点为6．61。BbMPK1含有11个MAPK共有的蛋白激酶区域和1个MAPK激酶作用的磷酸化位点区域(TEY),其氨基酸序列与丝状真菌的TMKA、PMK1、CMK1、FMK1和BMP1等MAPK高度同源。系统聚类结果表明,BbMPK1属于酵母FUS3／KSS1类MAPK。Southern杂交表明,BbMPK1在球孢白僵菌基因组中以单拷贝形式存在。RT-PCR分析表明BbMPK1在分生孢子休眠阶段、萌发阶段和菌丝生长时期均表达。研究结果为阐明酵母FUS3／KSS1类MAPK同源基因在球孢白僵菌中的作用奠定了基础。     

球孢白僵菌Hog1 MAPK同源基因BbHog1的克隆及特征分析

根据几种丝状真菌Hog1 MAPK的保守氨基酸序列设计简并引物,从昆虫病原真菌球孢白僵菌中扩增出MAPK同源基因的部分片段,然后利用YADE法延伸该片段的上、下游邻接序列,获得MAPK编码基因的全长序列,命名为BbHog1。序列分析表明,该基因编码358个氨基酸的多肽,推测分子量为40.99kDa,等电点为5.49。BbHog1含有MAPK保守的蛋白激酶激活域(TGY),序列与粗糙脉孢霉os-2(AF297032)、烟曲霉OSM1(XM_747571)、隐球酵母HOG1(AF243531)和酿酒酵母Hog1(Z73285)等Hog1 MAPK高度同源,相似性分别为94%、89%、83%和80%。系统聚类结果表明,BbHog1与酵母Hog1 MAPK同源。Southern杂交表明,BbHog1在球孢白僵菌基因组中以单拷贝形式存在。Northern分析表明,BbHog1在高渗、亚高温和营养胁迫等条件下的表达明显升高。由此推测,BbHog1基因可能与球孢白僵菌对逆境胁迫的适应性调节密切相关。     

粉拟青霉类枯草杆菌蛋白酶基因的cDNA克隆及其序列和蛋白质分析

粉拟青霉是一种常见的昆虫病原真菌,被广泛用于生物防治。根据GenBank中已登录的淡紫拟青霉,球孢白僵菌和金龟子绿僵菌的类枯草杆菌蛋白酶基因序列的同源性比较,以它们高度保守的核苷酸序列设计一对引物,采用RT-PCR和3’/5’-RACE相结合的方法,首次从粉拟青霉中克隆出完整的类枯草杆菌蛋白酶cDNA基因。其全序列为2060bp,该序列5’-端和3’-端的非编码序列长度分别为209bp和252bp,开放阅读框为1599bp,编码532个氨基酸,信号肽长度为16个氨基酸。成熟蛋白的氨基酸序列和金龟子绿僵菌小孢变种(CAB63913),玉米赤霉菌(EAA68914),金龟子绿僵菌蚱蜢变种(CAC95047)及柄孢壳(AAC03564)的同源性分别为69%、71%、68%和68%。成熟蛋白具有典型的丝氨酸蛋白酶活性位点,同时有5个半胱氨酸,3个潜在的N-糖基化位点和2个可能的O-糖基化位点。该基因在的密码子第三位碱基的使用上,显示出明显的对C的偏爱。     

球孢白僵菌高渗适应性相关基因Bbmpd的克隆与表达分析

【目的】克隆与球孢白僵菌(Beauveria bassiana)的高渗适应性相关基因,并对其功能进行分析,以揭示球孢白僵菌对高渗等逆境适应的分子机理。【方法】利用YADE法克隆T-DNA的侧翼序列并进行基因组步行,获得突变基因的全长及上游序列;利用RT-PCR技术分析突变基因的表达特性以及与Bbhog1的关系;采用同源重组技术敲除Bbmpd基因。【结果】克隆得到插入突变基因及其上、下游序列全长3037bp。该基因与编码球孢白僵菌的1-磷酸甘露醇脱氢酶基因相似性为98%。Bbmpd的表达受高渗环境(0.8mol/L NaCl)的诱导,受Bbhog1信号途径的激活调节,Bbhog1缺失导致Bbmpd表达下调。Bbmpd缺失突变体在高渗胁迫下的生长受到明显抑制。Bbmpd缺失不影响球孢白僵菌在查氏培养基上的生长和产孢。【结论】由T-DNA突变体克隆了编码球孢白僵菌1-磷酸甘露醇脱氢酶基因Bbmpd,该基因的表达受高渗环境的诱导和Bbhog1的调控,与球孢白僵菌高渗适应性相关。     

球孢白僵菌羧基转运蛋白基因BbJEN1及其上游序列的克隆与分析

在分析一株球孢白僵菌TDNA插入突变体T12的Tagging序列的基础上,根据与其具有高度同源性的一条金龟子绿僵菌EST序列（编号为AJ273226）设计简并引物,用YADE法从球孢白僵菌中扩增出该EST的同源序列及其延伸序列。序列分析表明,该片段与粗糙脉孢霉的羧基转运蛋白JEN1具有高度同源性,由此确定该序列为球孢白僵菌羧基转运蛋白JEN1基因的部分序列。然后利用YADE法延伸扩增该序列的上、下游序列,获得球孢白僵菌羧基转运蛋白JEN1的全长DNA序列,命名为GBbJEN1。利用3′RACE扩增出球孢白僵菌羧基转运蛋白JEN1的cDNA序列,命名为BbJEN1。BbJEN1全长1656bp,编码514个氨基酸的蛋白。推测蛋白分子量为55975.37Da,等电点9.32。氨基酸序列与金龟子绿僵菌、粗糙脉孢霉和酿酒酵母羧基转运蛋白JEN1的同源性分别为77%、66%和30%。序列分析表明,GBbJEN1含有2个内含子。Southern杂交表明,GBbJEN1基因在球孢白僵菌基因组中为单拷贝。利用RTPCR法对BbJEN1的表达特性进行了分析,结果发现BbJEN1基因的转录受蟑螂壳、蝉蜕等昆虫体壁的诱导,受葡萄糖的抑制。进一步利用YADE法获得了长为977bp的GBbJEN1上游序列,其中含有可能的葡萄糖抑制调控序列和压力反应元件。     

球孢白僵菌Hog1 MAPK同源基因BbHog1的克隆及特征分析

根据几种丝状真菌Hog1 MAPK的保守氨基酸序列设计简并引物,从昆虫病原真菌球孢白僵菌中扩增出MAPK同源基因的部分片段,然后利用YADE法延伸该片段的上、下游邻接序列,获得MAPK编码基因的全长序列,命名为BbHog1。序列分析表明,该基因编码358个氨基酸的多肽,推测分子量为40.99kDa,等电点为5.49。BbHog1含有MAPK保守的蛋白激酶激活域(TGY),序列与粗糙脉孢霉os-2(AF297032)、烟曲霉OSM1(XM_747571)、隐球酵母HOG1(AF243531)和酿酒酵母Hog1(Z73285)等Hog1 MAPK高度同源,相似性分别为94%、89%、83%和80%。系统聚类结果表明,BbHog1与酵母Hog1 MAPK同源。Southern杂交表明,BbHog1在球孢白僵菌基因组中以单拷贝形式存在。Northern分析表明,BbHog1在高渗、亚高温和营养胁迫等条件下的表达明显升高。由此推测,BbHog1基因可能与球孢白僵菌对逆境胁迫的适应性调节密切相关。     

球孢白僵菌Hog1 MAPK同源基因BbHog1的克隆及特征分析

根据几种丝状真菌Hog1 MAPK的保守氨基酸序列设计简并引物,从昆虫病原真菌球孢白僵菌中扩增出MAPK同源基因的部分片段,然后利用YADE法延伸该片段的上、下游邻接序列,获得MAPK编码基因的全长序列,命名为BbHog1。序列分析表明,该基因编码358个氨基酸的多肽,推测分子量为40.99kDa,等电点为5.49。BbHog1含有MAPK保守的蛋白激酶激活域(TGY),序列与粗糙脉孢霉os-2(AF297032)、烟曲霉OSM1(XM_747571)、隐球酵母HOG1(AF243531)和酿酒酵母Hog1(Z73285)等Hog1 MAPK高度同源,相似性分别为94%、89%、83%和80%。系统聚类结果表明,BbHog1与酵母Hog1 MAPK同源。Southern杂交表明,BbHog1在球孢白僵菌基因组中以单拷贝形式存在。Northern分析表明,BbHog1在高渗、亚高温和营养胁迫等条件下的表达明显升高。由此推测,BbHog1基因可能与球孢白僵菌对逆境胁迫的适应性调节密切相关。     

利用YADE法进行棉花基因组PCR步行

设计了一种依靠“Y”形接头延伸未知序列的方法（YADE,Y-shaped Adaptor Dependant Extension）,成功地抑制了在未知序列圹增中的单引物扩增。用这种方法从棉花基因组中扩增了一个棉花胚珠cDNA片段F027的相邻序列--FP27S和FP27A。重叠分析表明,F027S与F027有104bp的重叠,FP27A与F027有175bp的重叠。两个延伸片段分别含有1和3个可能的内含子,内含子均具有保守的边界序列GT-AG和与哺乳动物类似的分枝点序列。还对YADE法扩增未知序列的优缺点和可能的改进作了进一步讨论。     

金龟子绿僵菌羧基转运蛋白基因MaJEN1及其启动子的克隆与分析

用YADE法扩增了球孢白僵菌T—DNA插入突变体T12中与T—DNA左边界相连的基因组序列。在此基础上得到了金龟子绿僵菌的羧基转运蛋白的全长cDNA,MaJEN1。MaJEN1全长1695bp,其中含有长为1524bp的开放阅读框(0RF),编码508个氨基酸的蛋白。氨基酸序列与粗糙脉孢霉和啤酒酵母菌的羧基转运蛋白JEN1相似性分别为69％和31％。采用PCR扩增得到了MaJEN1的基因组序列GMaJEN1,序列分析发现,GMaJEN1含有两个内含子。Southern杂交发现GMaJEN1在金龟子绿僵菌基因组上为单拷贝。利用RT—PCR法对MaJEN1的表达特性进行了分析,结果表明MaJEN1在蟑螂壳诱导培养基中表达,在该培养基中的表达受葡糖糖抑制。进一步采用YADE法得到了长为1626bp的GMaJEN1上游序列,其中含有可能的葡萄糖抑制调控序列。     

Nucleotide sequence and DNA recognition elements of alc, the structural gene which encodes allantoicase, a purine catabolic enzyme of Neurospora crassa

The nitrogen regulatory circuit of Neurospora crassa contains structural genes that encode nitrogen catabolic enzymes which are subject to complex genetic and metabolic regulation. This set of genes is controlled by nitrogen limitation, by specific induction, and by the action of nit-2, a major positive-acting regulatory gene, and nmr, a negative-acting control gene. The complete nucleotide sequence of alc, the gene that encodes allantoicase, a purine catabolic enzyme, is presented. The alc gene contains a single intron, is transcribed from two initiation sites situated approximately 50 nb upstream of the translation start site, and encodes a protein comprised of 354 amino acids. Mobility shift and DNA footprint experiments identified a single binding site for the NIT2 regulatory protein in the alc promoter region. The binding site contains a 10 nucleotide base pair symmetrical sequence which is flanked by two possible core binding sequences, TATCT and TATCG. Mutant NIT2/beta-gal fusion proteins with amino acid substitutions in a putative zinc-finger motif were shown to be completely deficient in the ability to bind to the alc promoter DNA fragment.     

Regulation of competence development in Haemophilus influenzae

Development of competence for DNA uptake by the bacterium Haemophilus influenzae is tightly regulated, and expression of the cell's complement of competence genes is absolutely dependent on the cAMP-CRP complex. A second regulator of competence may maximize competence under starvation conditions. Several investigators have recently identified a consensus sequence (competence regulatory element, CRE) in the promoter regions of some competence genes and have proposed that this may be a binding site for Sxy (TfoX), a putative positive regulator of competence. However, a scoring method that reliably ranks candidate binding sites according to affinity for the cognate binding protein predicts that the cAMP-CRP complex will bind CRE sequences with high affinity. Moreover, the predicted Sxy protein lacks recognizable DNA-binding motifs and has not been shown to bind DNA. No other consensus sequences (putative binding sites) were identified in the promoter regions of competence genes. These observations suggest that the proposed competence-specific regulatory elements are in fact CRP-binding sites, and highlight the central role of cAMP-an established bacterial mediator of the response to nutritional stress-in competence regulation. Minor sequence elements uniquely conserved in the set of CRE sequences are predicted to reduce CRP affinity, and a model is suggested in which a secondary regulator of competence genes may interact with CRP under certain conditions to stabilize the initiation complex.