L-脯氨酸羟基化酶的提纯及活性研究

目的,以猪肺为原料,提取能把游离的L-脯氨酸羟化脯氨酸的羟基化酶。方法：把新鲜猪肺在提取液中低温高速匀浆,然后用4000r/min离心分离20min,取上清液进一步用8000r/min高速离心后,分别用盐析和有机溶剂的方法提取羟基化酶;结果;不同的方法都得到棕色的固体。经电泳测定该固体纯度高,溶于水中后能把游离的L-脯氨酸羟化为L-羟脯氨酸。测定其分子量约为66.000;等电点约为4。结论：所采用的提取工艺流程具有简单,效率高和实用的特点,且猪肺便宜,易得,适合较大规模的制备。     

从鸡毛中分离 L—脯氨酸

羽毛中含有较多的L-脯氨酸。干鸡毛水解后用离子交换树脂层析分离可得到纯L—脯氨酸,产率5.6%左右。同时可以分离得到L—丙氨酸、L—丝氨酸和L—精氨酸。     

脯氨酸-4-羟化酶在大肠杆菌中的密码子优化表达及对反式-4-羟脯氨酸生物合成的作用

为了使脯氨酸-4-羟化酶基因在重组大肠杆菌中得到高表达,通过调整大肠杆菌密码子偏好性以及mRNA二级结构,使得脯氨酸-4-羟化酶基因得到优化。将优化后的脯氨酸-4-羟化酶基因插入含有色氨酸串联启动子的p UC19质粒,构建重组质粒p UC19-ptrp2-Hyp,并导入大肠杆菌BL21(DE3)中。在摇瓶水平,重组菌以L-脯氨酸为底物发酵8 h,可积累(0.492±0.034)g/L的反式-4-羟脯氨酸。在发酵罐水平,通过补料分批发酵来提高反式-4-羟脯氨酸的产量,当补糖速率为18 g/h时,反式-4-羟脯氨酸的产量高达42.5 g/L,反式-4-羟脯氨酸产率为0.966 g/(L·h)。     

L-脯氨酸的制备研究

<正> 一前言 L-脯氨酸(L-proline)是蛋白质组成成分之一。它是一种有一亚胺基的氨基酸,是骨胶原、麸朊、玉米朊的一种较重要的成分。 L-脯氨酸,随着医药科学的发展,在复合结晶氨酸基输液的制备和医药合成工业中用途日趋广泛。在我国,目前由L-脯氨酸配伍其它氨基酸组成的用于抢救病人的十四种、十八种氨基酸大输液,已开始用于临床试验;由L-脯氨酸配伍其它氨基酸组成的用于治疗肝病的十五种氨基酸大输液正在准备进行试验;由L-脯氨酸与其它氨基酸等合成的“催产     

L-脯氨酸的制备研究

<正> 一前言 L-脯氨酸(L-proline)是蛋白质组成成分之一。它是一种有一亚胺基的氨基酸,是骨胶原、麸朊、玉米朊的一种较重要的成分。 L-脯氨酸,随着医药科学的发展,在复合结晶氨酸基输液的制备和医药合成工业中用途日趋广泛。在我国,目前由L-脯氨酸配伍其它氨基酸组成的用于抢救病人的十四种、十八种氨基酸大输液,已开始用于临床试验;由L-脯氨酸配伍其它氨基酸组成的用于治疗肝病的十五种氨基酸大输液正在准备进行试验;由L-脯氨酸与其它氨基酸等合成的“催产     

化学-酶法制备L-高苯丙氨酸

以苯丙酸乙酯为原料,通过正交设计优化2-氧4-苯基丁酸盐的制备条件：苯丙酸乙酯与草酸二乙酯摩尔比为1：3,缩合反应时间为2．5h,H2SO4质量分数为20％,水解反应时间为15h,优化条件下2-氧-4-苯基丁酸盐的产率为68．24％。随后,利用E．coli A5所产的天冬氨酸转氨酶为生物催化剂制备L-高笨丙氨酸。酶转化反应的最适条件为：游离细胞体系pH、温度、底物质量浓度和细胞质量浓度分别为8．5、37℃、20g/L和30g／L;而固定化细胞体系则分别为7．0—9．0、40℃、10g／L和30g/L。采用廉价的L-谷氨酸（L—Glu）作为氨基供体,添加表面活性剂有利于提高L-HPA产率。通过研究固定化细胞转化反应进程,结果发现8h内90％的底物可转化为L—HPA。     

一株高产脯氨酸的嗜醋酸棒杆菌的选育及发酵条件优化

以嗜醋酸棒杆菌为出发菌株,经过片段化全基因组体外诱变、重组和连续的磺胺胍抗性筛选,获得一株L-脯氨酸的高产菌株。摇瓶发酵优化结果表明,葡萄糖、生物素和硫胺素的最适用量分别为16%、300μg/L、400μg/L,最适pH为6.8~7.0,装液量为25ml/500ml摇瓶,发酵培养72h后L-脯氨酸产率高达到75.6g/L,与对照相比提高了5%。考察了50L发酵罐中细胞生长对L-脯氨酸产量的影响,补料分批发酵结果表明(比生长速率分别为0.06/h、0.08/h和0.1/h),比生长速率在0.08/h左右时L-脯氨酸的产率最高,L-脯氨酸的比生产速率Q_P达到0.091 g/(g.h),产率高达82.1 g/L,比优化前提高了14%。     

L-羟脯氨酸-Zn(Ⅱ)的配合机制及其抗氧化性研究

以L-羟脯氨酸(Hyp)和ZnSO₄制备Hyp-Zn(Ⅱ)配合物,研究其配合机制及抗氧化能力。与L-羟脯氨酸相比,配合物在1100cm^－1处出现了一新的红外吸收峰,说明L-羟脯氨酸与Zn(Ⅱ)发生了配位作用;配合物的差热-热重图与L-羟脯氨酸相比,在290℃和375℃的吸热峰消失了,确证L-羟脯氨酸与Zn(Ⅱ)发生了配位作用;配合物核磁核磁共振图中3.5～3.9ppm的羧基氢和羟基氢的信号峰的消失,表明L-羟脯氨酸与Zn(Ⅱ)发生配合的位置是L-羟脯氨酸的α碳的羧基或γ碳的羟基氧;从配合物的原子力显微形貌相图可见数个L-羟脯氨酸围绕Zn(Ⅱ)形成的配合结构。透析实验结果证实L-羟脯氨酸与Zn(Ⅱ)配合的比例为4∶1（mol/mol）。上述测定和表征表明所形成配合物的分子式为Zn(Hyp)₄·H₂O。（Hyp）₄-Zn(Ⅱ)配合物抑制Zn(Ⅱ)产生的羟基自由基,抑制百分比为75.5%,其总抗氧化能力为80.167u/mL,抗超氧阴离子活力为53.19u/mL。     

L-羟脯氨酸-Zn(Ⅱ)的配合机制及其抗氧化性研究

以L-羟脯氨酸(Hyp)和ZnSO4制备Hyp-Zn(Ⅱ)配合物,研究其配合机制及抗氧化能力。与L-羟脯氨酸相比,配合物在1100cm-1处出现了一新的红外吸收峰,说明L-羟脯氨酸与Zn(Ⅱ)发生了配位作用;配合物的差热-热重图与L-羟脯氨酸相比,在290℃和375℃的吸热峰消失了,确证L-羟脯氨酸与Zn(Ⅱ)发生了配位作用;配合物核磁核磁共振图中3.5~3.9ppm的羧基氢和羟基氢的信号峰的消失,表明L-羟脯氨酸与Zn(Ⅱ)发生配合的位置是L-羟脯氨酸的α碳的羧基或γ碳的羟基氧;从配合物的原子力显微形貌相图可见数个L-羟脯氨酸围绕Zn(Ⅱ)形成的配合结构。透析实验结果证实L-羟脯氨酸与Zn(Ⅱ)配合的比例为4∶1(mol/mol)。上述测定和表征表明所形成配合物的分子式为Zn(Hyp)4.H2O。(Hyp)4-Zn(Ⅱ)配合物抑制Zn(Ⅱ)产生的羟基自由基,抑制百分比为75.5%,其总抗氧化能力为80.167u/mL,抗超氧阴离子活力为53.19u/mL。     

偶联基于酮还原酶的NADH再生系统一锅法酶催化合成L-2-氨基丁酸

以廉价易得的L-苏氨酸为原料,利用在大肠杆菌中重组表达的苏氨酸脱氨酶和亮氨酸脱氢酶,并偶联基于酮还原酶的NADH再生系统一锅法制备L-2-氨基丁酸。以L-2-氨基丁酸的产率为指标,考察了一锅法酶催化制备L-2-氨基丁酸的最适p H、L-苏氨酸浓度及异丙醇浓度。在最适p H 7.5~8.0,L-苏氨酸浓度50g/L,添加5%的异丙醇及0.5g/L NAD+,分别加入0.6g/L苏氨酸脱氨酶、2g/L亮氨酸脱氢酶及2g/L酮还原酶,反应20h,可实现L-2-氨基丁酸的摩尔产率为99%,产量为43g/L。该结果为L-2-氨基丁酸的制备提供了一种新的思路。     

L-脯氨酸发酵研究

本文报道北京棒状杆菌(Corynebacterium pekinense) AS 1.299鸟氨酸缺陷型突变株 AS1.727发酵产生L-脯氨酸的研究结果。培养基中需亚适量的精氢酸、80-100μg／l的生物素和高浓度的铵离子。氮源以氯化铵最优,硫酸铵次之．实验表明氯离子有利于产生L-脯氨酸,镁离子也有促进作用。在本实验所 使用的培养基中,30℃培养5天,产L-脯氨要达25mg／ml以上。用生成特殊的、难溶于水的五氯酚脯氨酸复合物,结合离子交换法和溶媒抽提法等分离技术,提取产品。经熔点、元素分析、比旋光度、红外光谱分析及纸上色谱分析,证明产物确是L-脯氨酸。     

产生L-异亮氨酸的黄色短杆菌的代谢途径分析

目的:代谢工程要解决的主要问题是改变某些途径中的碳架物质流量或改变碳架物质流在不同途径中的流量分布,其目标就是修饰初级代谢,将碳架物质流导入目的产物的载流途径,以获得产物的最大转化率。方法:利用途径分析方法对黄色短杆菌生产L-异亮氨酸的途径进行了分析。结果:建立了9种基础模型,确定L-异亮氨酸理论最高摩尔产率是1;确定了黄色短杆菌生产L-异亮氨酸的最佳途径的通量分布,并以此为依据进行发酵溶氧控制优化,溶氧分阶段控制发酵生产L-异亮氨酸比溶氧恒定控制方式发酵的产率提高了8.2%。结论:根据途径分析结果,通过改变发酵过程有关参数,可使目的产物产率得到提高。     

L-谷氨酸的综合利用 Ⅰ报:从 L-谷氨酸制取 L-谷氨酰胺

<正> 前言L-谷氨酰胺(L-Glutamine)是自然界中存在的一种氨基酸,它已广泛用于生化和医药,对神经障碍及癫痫病人的脑机能有改善作用。特别对消化器官溃疡的治疗有卓越的效果。由于它的价格高,应用受到极大限制。其主要原因是不能采用一般制备酰胺的方法来制取。如以L-谷氨酸-r-甲酯为原料。直接在氨溶液中进行酰胺化时。产物     

重组大肠杆菌BL21(pUC19-Hyp)产羟脯氨酸的补料分批培养

利用自主构建的组成型重组大肠杆菌BL21(pUC19-Hyp)为出发菌株,运用间歇流加、指数流加和恒速流加3种流加C源的方式进行补料分批培养。结果表明:在装液量为4 L的7 L发酵罐中,以0.30 g/min恒速流加为最优,在发酵44 h时,羟脯氨酸的质量浓度达到最高,为42.50 g/L,脯氨酸转化率为81%,此时细胞干质量为21.33g/L,残糖质量浓度为0.17 g/L。L-羟脯氨酸含量与摇瓶发酵时的1.39 g/L相比,提高了大约30倍,比日本株式会社的发酵产量提高了1.50 g/L,发酵过程中糖酸转化率约为4.0∶1。发酵液中的氨基酸分析结果表明,除脯氨酸、羟脯氨酸外的其他氨基酸质量浓度均低于0.1 g/L,发酵液中主要氨基酸为脯氨酸和羟脯氨酸。     

生物转化法制备L-天冬酰胺

探索生物转化法制备L-天冬酰胺的技术与工艺。通过分子生物学方法,克隆来源于大肠杆菌(Escherichia coli, E.coli)JM109的天冬酰胺合成酶A基因asnA,并于E. coli BL21(DE3)中表达,利用构建的E.coli基因工程菌E.coli BL21(DE3)/pET28a(+)-asnA全细胞高密度催化L-天冬氨酸生产L-天冬酰胺,以PITC柱前衍生-高效液相检测底物和产物。表达的蛋白质分子质量约为37kDa,与预期大小相符,比酶活力为1786.6U/g。L-天冬氨酸转化率为95.8%,L-天冬酰胺产量可达126.5g/L,生产速率为15.81g/(L·h)。结果表明,已成功构建高效表达天冬酰胺合成酶A基因工程菌株,并用于催化L-天冬氨酸转化生产L-天冬酰胺,解决了L-天冬酰胺生物转化生产工艺中ATP成本过高的难题,为L-天冬酰胺制备提供新的绿色途径。     

卡伍尔氏链霉菌NA4突变株ΔbafAI的次级代谢产物研究

链霉菌产生的次级代谢产物是农用和医药抗生素的重要来源。为了更深入挖掘卡伍尔氏链霉菌NA4潜在多样的次级代谢产物,对阻断NA4主产物bafilomycins的突变株ΔbafAI随机激活的代谢产物进行分离和鉴定。采用HP20固相萃取、硅胶柱色谱、凝胶柱色谱以及半制备HPLC等方法对ΔbafAI代谢产物进行分离纯化;使用NMR和MS确定化合物结构,并对单体化合物进行了生物活性测定。共分离鉴定6个化合物:环(L-异亮氨酸-L-脯氨酸)(1)、环(L-缬氨酸-L-脯氨酸)(2)、环(L-脯氨酸-L-亮氨酸)(3)、环(L-脯氨酸-L-苯丙氨酸)(4)、(2E, 4E)-5-(3-羟苯基)-戊-2, 4-二烯酰胺(5)和5′-脱氧-5′-甲硫肌苷(6)。6个化合物均是阻断NA4主产物后非特异激活的或产量显著提高的化合物,均为该菌中首次分离;化合物5和6是第二次从天然提取物中分离得到;化合物1和2显示出抗白色念珠菌活性,并首次报道了化合物5的抗氧化活性。进一步丰富了卡伍尔氏链霉菌NA4次级代谢产物研究,为激活沉默或低表达次级代谢产物合成基因簇提供了有益借鉴。     

pH对游离L-脯氨酸羟化为L-羟脯氨酸的影响

通过用从动物组织中抽提出的原胶原脯氨酸羟基化酶,在Fe^2 、α-酮戊二酸和还原剂如抗坏血酸盐等物质存在的条件下,根据试验结果,不能排除其可把水溶液中游离的脯氨酸羟化为羟脯氨酸的可能性。并且反应体系的pH对反应有很大的影响,试验找出最适的反应pH,反应液的为3.52;抽提液的为6.95,与文献中原胶原脯氨酸羟基化酶羟化原胶原中脯氨酸的有很大差别。     

用离子交换树脂分离、提纯L-脯氨酸的研究

本文就应用732型阳离子交换树脂分离、提纯L-脯氨酸水溶液这一课题进行了研究。最后通过正交试验确定分离、提纯的最佳条件是,上柱时L脯氨酸水溶液的pH值为3～4;洗脱剂氨水的浓度为1.6N;洗脱速度为55毫升/分。并分别作出了洗脱剂氨水浓度为1.6N和0.4N时的洗脱曲线。     

L-苹果酸产生菌筛选及高产突变株诱变选育

通过广泛收集和分离,获得根霉属(Rhizopus)、曲霉属(Aspergillus)及裂褶菌属(Schizophyllum)等属菌株897株。产酸指示平板上的变色圈测定结果表明,它们中间628株为产酸菌。通过纸层析对产酸菌发酵液酸谱的分析,获得129株L-苹果酸产生菌,经进一步测定发酵液中L-苹果酸的含量,筛选出以葡萄糖为原料,摇瓶发酵140小时,L-苹果酸产率48．37g／L,对糖转化率48．37×10^-2 的菌株LMO2。经初步鉴定,这一菌株为曲霉(Asper-gillus sp.)以LM02作为出发株,采用亚硝基胍、自然污染细菌、甲基磺酸乙酯及紫外线进行诱变处理,选育出葡萄糖为原料,L-苹果酸产率较高的突变抹N1-14、N1-14、NE1412、NU1416及NU1419。其中N1-14 的L-苹果酸产量最高,比出发株提高46．2×10^-2。N1-14 的菌丝生长速度快,产孢能力强,摇瓶发酵葡萄糖140小时,平均L-苹果酸产率为72．53g／L,对糖转化率53．74×10^-2。全发酵液经薄层层析测定,不含黄曲霉毒素。发酵产物分离提纯后,得到白色粉末状结晶,经纸层析、质谱及红外光谱测定,证明为L-苹果酸。     

不同碳源生物转化合成L-亮氨酸的代谢计量分析

目的:建立黄色短杆菌利用不同碳源生物合成L-亮氨酸的代谢网络模型,并进行代谢网络计量分析.方法:通过对所构建的L-亮氨酸代谢网络模型进行途径分析,确定以果糖、葡萄糖、蔗糖或木糖为碳源时L-亮氨酸生物合成的基元模型、最大理论产率和不同模型的呼吸熵.结果:通过途径分析得到了L-亮氨酸生物合成的基元模型.以果糖、葡萄糖、蔗糖和木糖为碳源时L-亮氨酸的最大理论产率均为66.7%,其对应的最大呼吸熵分别为18、16、19、18.结论:L-亮氨酸理论得率与碳源种类无关;呼吸熵增加,能够有效提高L-亮氨酸合成代谢流,限制菌体量的过量生成.与其他碳源相比,蔗糖能够避免碳架溢流出现,合成L-亮氨酸能量代谢需求低;而葡萄糖能够较好地满足菌体生长和产酸的需求.