用荧光染色技术标记生活花粉管的研究

在金鱼草和(或)烟草上试验了三种荧光染料对花粉管进行荧光活体染色与标记的效果。花粉管在异硫氰酸荧光素(FITC,12.5μg/ml)中染色5—6小时,原生质呈绿黄色荧光;换入无染料的培养基后可继续生长并保持荧光标记,但后期生长受抑。罗丹明B(RB,10μg/nl)染色的效果与上相近,花粉管呈红色荧光;换入无染料培养基后生长正常,唯后期荧光减弱。荧光素二醋酸酯(FDA,10μg/ml)染花粉粒40分钟,换入无染料培养基后正常萌发与生长,花粉管原生质呈明亮的绿色荧光。FDA方法具有染色时间短,荧光明亮,兼有活染与生活力鉴定双重功效等优点。     

FDA-PI荧光双色法快速评价小鼠桑椹胚活力

胚胎移植成功与否关键取决于胚胎的存活力和发育能力,但是胚胎的存活力很难预知.本实验以小鼠桑椹胚为材料,研究荧光物质二乙酰荧光素(Fluorescein diacetate,FDA)-碘化丙啶(Propidium iodide,PI)在胚胎活力检测上的应用,同时检测两种荧光物质FDA和PI对小鼠桑椹胚的毒负作用,再通过胚胎移植来最终证明荧光标记的可靠性.实验结果表明,荧光物质FDA和PI能分别标记强活力胚胎、弱活力胚胎和死胚胎,且FDA对胚胎无毒负作用,PI对透明带完整的胚胎也无毒负作用,所以FDA-PI荧光双色法是一种简捷、安全而有效的的小鼠胚胎活力评价方法.     

用FDA-PI双色荧光法鉴定大麦原生质体活性

为鉴定大麦糊粉层原生质体的活性,应用了荧光染料荧光素双醋酸酯(FDA)和普罗皮啶碘(PI)。在FITC滤片组合条件下用荧光显微镜观察,有生活力的原生质体发出绿色荧光,而没有生活力的原生质体细胞核呈桔黄色。FDA-PI双色荧光法具有色彩对比鲜明的效果,从而为细胞计数和活力测定提供了方便。本文还介绍了一种在同一张底片上进行两次曝光的彩色摄影记录新技术。     

保卫细胞液泡活体标记方法的比较

液泡的活体标记是研究保卫细胞液泡动态的前提.结合作者的研究,介绍了利用丫啶橙 (acridine orange, AO)、Lysotracker Red DND-99、二乙酸荧光素(fluorescein diacetate, FDA)、2', 7'-二(羧乙基)-5(6)-羧基荧光黄(BCECF-AM)以及绿色荧光蛋白( green fluorescent protein, GFP)转基因等活体标记保卫细胞液泡的方法.研究结果表明, AO可以方便和快捷的标记保卫细胞液泡; FDA标记可以显示液泡的边界, 也可以用于保卫细胞液泡的标记.利用转染GFP融合基因的方法也是标记保卫细胞液泡的最好选择.     

大气PM2.5中微生物活性的探测

【背景】细颗粒物(PM_(2.5))具有多种毒性效应,长期暴露对机体可造成严重危害。微生物作为PM_(2.5)的重要生物组成成分,目前尚无简单易行地测定PM_(2.5)中微生物活性的方法。【目的】利用小流量采样仪采集细颗粒物PM_(2.5),通过大量的模拟和测试实验,初步建立了一套测定PM_(2.5)中微生物活性水平的荧光素二乙酸酯(FDA)水解法。【方法】使用5L/min的小流量采样仪采集样品40 min,FDA的浓度为200μg/mL,经过1.5 h的暗反应,使用丙酮终止15 min后测定其荧光强度,并计算微生物活性。【结果】利用该方法测得2017年7月大气PM_(2.5)中微生物活性平均水平为0.873ng/m~3荧光素钠;室内空气细颗粒物PM_(2.5)中微生物活性水平为1.110 ng/m~3荧光素钠。【结论】建立了一种有效准确地测定大气颗粒物PM_(2.5)中微生物活性的方法。     

T细胞亚群CD4测定方法的研究

为比较外周血T淋巴细胞亚群CD4不同测定方法的差别,以流式细胞术为定量手段,测定了猴外周血中三种不同方法处理后CD4的表达.结果表明：先标后溶法——先用异硫氰荧光素标记的单克隆抗体（FITC-CD4 McAb）标记后,再加入红细胞溶解液溶掉红细胞的处理方法,结果基本等同于传统的淋巴细胞分离法,但样本用量仅为传统方法的1/5,且操作简单.激光共焦显微术的形态学研究也证实：先标后溶法与淋巴细胞分离法相似,其细胞膜表面荧光标记清晰,优于先溶后标法.     

病毒免疫荧光结合物性能的研究

统一测定荧光血清中各种成分的方法,观察荧光素(F)、蛋白质(P)及免疫活性抗体(ab)间的比例关系,使之规格化,对荧光血清的制备检定有重要意义,也是免疫荧光技术在推广应用中极待解决的问题。E.H.Beutner报告了抗人IgG的检定及其对抗梅毒螺旋体抗体及抗核抗体的染色效果。E.H.Hébert,等报告了细菌的直接荧光抗体制剂的最适F/P。为了     

荧光发光测定AGPase活力方法初步建立及应用

腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶(AGPase)活力传统上采用32P同位素标记反应底物来测定,但因测定条件的限制而极大地影响了其应用.该研究依据荧光素酶催化荧光素生成发光氧化荧光素的原理,在优化基本反应体系、确立反应体系ATP浓度和荧光强度线性关系等基础上,初步建立了以荧光发光反应测定AGPase活力的新方法,并运用新方法测定了含有不同glgC基因拷贝数菌株的AGPase活力.测定结果显示,不同菌株AGPase活力随glgC拷贝数不同存在显著差异,且其变化趋势与理论预期一致,即新方法可用于AGPase活力的体外测定,且具有更加安全、灵敏、简便和成本低的特点.     

荧光素标记检测乙型肝炎病毒表面抗原特异性杀伤性T淋巴细胞方法的探讨

用绿色荧光前体化合物Calcein AM标记靶细胞,经过与杀伤性T淋巴细胞(CTL)效应细胞数小时的孵育,通过分析培养上清中的荧光强度检测CTL效应。通过对一系列标记条件的研究：不同浓度Calcein AM标记靶细胞、不同洗涤缓冲液、不同标记细胞浓度、不同洗涤次数、不同裂解液配方,确定Calcein AM荧光素标记法的最佳条件。用该方法检测乙型肝炎病毒表面抗原的DNA疫苗免疫Balb／c小鼠对P815S细胞的CTL效应,E／T比为10时,杀伤效率接近饱和,达到65％。通过荧光显微镜直接观察杀伤后的P815S细胞,细胞破裂程度与计算出的杀伤效率有一定相关性。     

荧光素标记检测乙型肝炎病毒表面抗原特异性T淋巴细胞方法的探讨

用绿色荧光前体化合物Calcein AM标记靶细胞,经过与杀伤性T淋巴细胞(CTL)效应细胞数小时的孵育,通过分析培养上清中的荧光强度检测CTL效应.通过对一系列标记条件的研究:不同浓度Calcein AM标记靶细胞、不同洗涤缓冲液、不同标记细胞浓度、不同洗涤次数、不同裂解液配方,确定CalceinAM荧光素标记法的最佳条件.用该方法检测乙型肝炎病毒表面抗原的DNA疫苗免疫Balb/c小鼠对P815S细胞的CTL效应,E/T比为10时,杀伤效率接近饱和,达到65%.通过荧光显微镜直接观察杀伤后的P815S细胞,细胞破裂程度与计算出的杀伤效率有一定相关性.     

利用荧光激活方法进行细胞分类

利用每个细胞能吸收多少荧光染料来进行细胞分类,这种装置简称荧光激活细胞分类器——FACS。最近的型号为FACS-Ⅱ,检测的灵敏度大到每个细胞吸收3000个荧光素分子。这种分类器同时有相应的光散射附件,因此也同时自动地测定所有细胞的大小,也就是说同时利用细胞大小及荧光多少来分类。FACS-Ⅱ每秒钟鉴别5000     

人外周血T淋巴细胞凋亡与胀亡研究及地塞米松的诱导作用

目的:观察分离培养的人外周血T淋巴细胞的调亡与胀亡.方法:密度梯度离心法及尼龙棉柱法分离健康成年人外周血T淋巴细胞,分空白组及地塞米松(DXM)组,培养后观察细胞光镜及电镜形态学、FDA/P1荧光染色,并用流式细胞仪检测凋亡和胀亡细胞比例变化.结果:①人外周血T淋巴细胞经体外培养,可自然出现典型的细胞凋亡与胀亡形态学改变.②人外周血T淋巴细胞在地塞米松诱导作用下,凋亡率与胀亡率皆有显著增高.③随着培养时间的增加人T淋巴细胞凋亡与胀亡率亦有升高.结论:人外周血T淋巴细胞存在凋亡与胀亡现象,DXM可诱导人外周血T淋巴细胞凋亡与胀亡.     

利用荧光探针直接测定线粒体活性氧的形成

目的与方法：根据荧光探针－还原型二氯荧光素（2‘,7‘-dichlorodihydrofluorescin,DCFH)可与活性氧（reactive oxygen species,ROS)反应生成荧光物一氧化型二氯荧光素（2‘,7‘-dichlorofluorecin,DCF)的原理,设计了利用荧光分光光度计直接定量检测线粒体活性氧生成并可观察在各种实验条件下线粒体活性氧产生动态变化的方法。结果与结论：线粒体在态4呼吸状态下,DCF的荧光强度随时间呈线性增加,表明活性氧以恒定速率产生。将荧光强度随时间变化的数据点拟合,线性回归直线斜率与活性氧产生的速率呈正比,测定中加入叠氮钠和丙二酸可分别使线粒体活性氧产生增加和减少。DCF荧光强度增加速率与线粒体浓度在一定范围内呈线性关系。复管实验表明重复性良好。     

基于微流控芯片多波长荧光检测体系

利用四个LED分别匹配相应的激发滤光片,带通发射滤光片和PMT,自行搭建微芯片多波长荧光检测系统。用于复杂生物混合样品:四类试样(荧光胺标记的牛磺酸(FT Ex/Em 390/446nm)、荧光素(Fl Ex/Em 480/520nm)、5(6)-羧基-X-罗丹明(ROX Ex/Em 563/600nm)和花菁染料(Cy 5 Ex/Em 635/677nm)的同时分离和测定并得到充分的验证。     

一种用FRAP测定细胞间隙连接介导通讯的方法

本文探讨了利用荧光漂白恢复技术(FRAP)测定体外培养小鼠大脑皮层神经胶质细胞间隙连接通讯的方法。经细胞培养、荧光染色、荧光激发、荧光漂白、激光扫描及计算 机分析等处理,结果各所选神经胶质细胞内荧光均得到不同程度的恢复,即经扫描15.3分钟后,1—5号细胞内荧光相对强度分别上升了14％、28％、43％、17.5%、12.5％,三次平均上升了18.57±10.06％,荧光恢复速率平均为1.223±0.785％/min(n=14)。表明该方法可用来测定细胞间隙连接通讯。     

一种利用荧光标记检测氨肽酶N抑制剂与肿瘤细胞结合的方法

目的:建立利用荧光标记法检测氨肽酶抑制剂和肿瘤细胞结合的方法。方法:以异硫氰酸荧光素(FITC)标记氨肽酶N抑制剂LYRM03和Bestatin,制备荧光探针FITC-LYRM03、FITC-Bestatin,应用荧光显微成像观察和流式细胞仪检测标记化合物FITC-LYRM03、FITC-Bestatin对肿瘤细胞的结合与氨肽酶N抑制活性的相关性。结果:化合物LYRM03和Bestatin具有肿瘤细胞的氨肽酶N抑制活性,荧光标记化合物FITC-LYRM03、FITC-Bestatin能与肿瘤细胞有不同程度的结合。结论:标记化合物FITC-LYRM03、FITC-Bestatin和肿瘤细胞的结合与对肿瘤细胞的氨肽酶N抑制活性相一致。     

萤火虫荧光素酶和荧光素酶基因

自然界有一些能自身发光的昆虫。其中,以北美萤火虫(Photinus Pyralis)研究得较为广泛和透彻。早在1956年,Green和McElroy就得到了荧火虫荧光素酶(Luciferase)的结晶。次年,Bilter和McElroyS~得到了荧光素(Luciferin)的结晶。1961年,White等测定了荧光素的结构,并化学合成了荧光素。随后,生物学家们一直致力于研究荧光素酶的催化反应机制。     

基于双荧光和单荧光探针的溶酶体pH值测定方法比较

目的:通过比较基于双荧光探针和单荧光探针的2种溶酶体pH值测定方法,探究一种不依赖四甲基若丹明(TMR)的、基于异硫氰酸荧光素(FITC)单荧光的检测溶酶体pH值方法的可行性。方法:利用人肺癌肺泡基底上皮来源的A549细胞,分别采用FITC/TMR双荧光探针法和FITC单荧光双激发法测定溶酶体pH值;通过计算相对荧光强度的比值FI_(FITC488)/FI_(TMR561)或FI_(FITC488)/FI_(FITC405),绘制pH值标准曲线,用于pH值测定。结果:相对于FITC在Ex488 nm/Em520 nm波长下的荧光强度对pH值极为敏感,其在Ex405 nm/Em422 nm波长下对pH值不敏感,可用于荧光矫正;不同pH值条件下,FI_(FITC488)/FI_(FITC405)比值基本呈线性关系。结论:FITC单荧光双激发法只须使用一种荧光探针即可实现pH值检测,较FITC/TMR双荧光探针法更不易产生系统误差,更适用于溶酶体pH值检测。     

简便、快速测定细胞裂解液中DNA含量的荧光分析

生物组织中DNA的定量测定方法,均需进行样品的处理,步骤烦琐,费时,又影响灵敏度和重现性。Ananda等利用荧光探针——菲啶溴红检测生物样品中核酸的含量,虽然简化了样品的处理过程但仍不能直接测定细胞匀浆中DNA的含量。Rassel和Williamson等报道了4,6-二脒基-2苯吲哚(DAPI)荧光试剂能与DNA特异性结合成荧光复合物。Labarca等利用反苯并咪唑荧光试剂直接检测生物组织粗匀浆液中DNA含量,我们实验室在此基础上建立了直接测定细胞粗裂解液中DNA含量的方法、可检测10ng DNA。     

应用流式细胞术检测毕赤酵母的细胞活性

选取两种细胞活性染色试剂二乙酸荧光素(fluoresceindiacetate,FDA)和碘化丙锭(propidiumiodide,PI),应用流式细胞术(flowcytometry,FCM)检测毕赤酵母细胞活性。比较FDA/PI双染色与PI单染色的FCM图谱,后者能够很好地将死活细胞区分开来并得到正确的比例。利用PI单染色检测发酵过程细胞活性的变化,甘油补料阶段几乎没有细胞死亡,进入甲醇补料阶段后,随着细胞密度的增加,细胞的活性不断降低,发酵88h时细胞活性仅为73.8%。