巨噬细胞装载纳米颗粒用于药物递送

目的:活细胞药物递送系统具有主动靶向至肿瘤部位,防止被免疫系统清除等诸多优势。本文提供了一种巨噬细胞负载纳米颗粒的递送方法,并探讨不同载药量对巨噬细胞的活性以及运动性的影响。方法:通过超声乳化法制备包载阿霉素的DOX@PLGA纳米颗粒。纳米粒度分析仪测量粒径和表面电位,透射电镜观察纳米颗粒形态。将DOX@PLGA纳米颗粒与巨噬细胞共同孵育,即得到负载DOX@PLGA纳米颗粒的巨噬细胞用以药物递送。然后通过CCK-8法、LDH法以及细胞迁移实验检测不同载药量情况下细胞活力水平、细胞损伤程度以及细胞运动性。结果:制备的DOX@PLGA纳米颗粒呈圆形或椭圆形,粒径为109.2±2.3 nm;表面电位为-45.0±2.0 m V;载药量为4.61%。当单个巨噬细胞负载0.15 pg DOX时细胞存活率为:71.5±4.4(%);细胞损伤率为:26.3±1.8(%);迁移率为:61.6±5.7(%)。结论:成功制备巨噬细胞负载DOX@PLGA纳米颗粒的递药系统,载药量适当的情况下载体细胞依然具有良好的活性和运动性。     

分泌蛋白YKL-40增强肿瘤细胞的上皮间质样转化

目的:分泌糖蛋白YKL-40在多种晚期肿瘤病人的血液中显著升高,提示YKL-40蛋白的血浓度是肿瘤恶变的生物标志物。本课题研究YKL-40重组蛋白和过表达YKL-40肿瘤细胞对肿瘤细胞的上皮间质样转化的作用。方法:构建YKL-40过表达的纤维状乳腺癌细胞系MDA-MB-231和非纤维状结肠癌细胞系HCT-116,观察细胞形态学变化,收集细胞和细胞培养液用于Western Blot(WB)检测YKL-40和上皮间质转化标记蛋白Vimentin和N-cadherin。观察重组蛋白YKL-40对原代MDA-MB-231细胞在无血清条件下的细胞存活影响;另外,用细胞存活试剂盒检测YKL-40过表达HCT-116细胞在无血清的培养液中细胞存活情况。最后,用细胞侵袭试验检测YKL-40过表达MDA-MB-231细胞的侵袭力,并用WB和Zymography来测定细胞分泌MMP9蛋白的表达和酶活性。结果:YKL-40过表达增强MDA-MB-231细胞的形态向上皮间质样转化,并显著提高Vimentin、N-cadherin蛋白的表达,但对HCT-116细胞无法诱导上皮间质样转化。在无血清培养基培养条件下,YKL-40可以增强两种细胞的存活能力,并且YKL-40过表达的MDA-MB-231细胞增强了细胞的侵袭能力,促进了MMP9蛋白表达和蛋白活性。结论:YKL-40可以增加肿瘤细胞的存活力,增强纤维状细胞向上皮间质样转化;并且,YKL-40增加MMP9蛋白表达和活性,增强细胞侵袭力。YKL-40是间质样肿瘤细胞EMT的增强子,此发现为抑制肿瘤恶变提供新靶点。     

基于巨噬细胞的诊疗一体化系统

目的:建立一种可以同时实现显像诊断与主动靶向到肿瘤部位进行治疗的纳米药物模型。方法:包载了1,1'-二十八烷基-3,3,3',3'-四甲基吲哚三碳花青碘(1,1'-dioctadecyl-3,3,3',3'-tetramethylindotricarbocyanine iodide, Di R)荧光染料的聚乳酸-羟基乙酸共聚物(Polylactic-co-glycolic acid, PLGA)纳米粒表面被金属离子与酚羟基络合形成的网状结构涂布后可稳定连接在巨噬细胞表面,Di R可以在近红外激光下实现荧光成像,并经波长为808 nm的近红外激光器以2 W/cm2功率照射,产生光热作用。结果:构建了粒径在100 nm左右的包载了Di R的PLGA纳米粒,表面涂布金属多酚网状结构后,纳米粒连接到巨噬细胞表面,Di R发挥既可荧光成像,经808 nm激光照射后又可高效升温至46℃以上,使用CCK8试剂检测证明此种连接了纳米粒的功能化细胞(Functional Cell)发挥光热作用后可杀死近70%的小鼠乳腺癌细胞4T1。结论:成功建立了一种基于巨噬细胞递送的诊疗一体化系统,将荧光成像与光热治疗有机结合到一起,达到有效杀伤肿瘤细胞的功效。     

APP/PS1小鼠中PEG-PLA纳米粒的表面蛋白冠组成及其脑内递送的实验研究

摘要 目的：研究阿尔茨海默病（Alzhemer''s disease,AD）模型鼠中聚乙二醇聚乳酸（poly(ethylene glycol)-poly(l-lactide),PEG-PLA）纳米粒表面蛋白冠组成及其对脑内递送特性的影响。方法：制备PEG-PLA纳米粒,测定纳米粒的zeta电位及粒径,采用透射电子显微镜观察纳米粒形态。通过双光子显微镜观察APP/PS1小鼠与野生型（Wild Type,WT）小鼠脑内PEG-PLA纳米粒分布特性。采用液相色谱-质谱联用（LC-MS）技术对PEG-PLA纳米粒分别与APP/PS1小鼠和WT小鼠血浆孵育形成的两种不同蛋白冠进行蛋白组学分析。结果：制备的PEG-PLA纳米粒粒径均一,分散性较好。静脉注射PEG-PLA后,APP/PS1小鼠脑内纳米粒量明显高于WT小鼠。蛋白质组学结果显示,APP/PS1小鼠血浆孵育组PEG-PLA纳米粒表面蛋白冠中凝聚素（Clusterin）明显高于WT小鼠血浆孵育组,该蛋白与纳米粒逃避机体清除有关。此外,纳米粒蛋白冠中血管性血友病因子（Von Willebrand factor）、玻连蛋白（Vitronectin）、肌球蛋白重链-9（Myosin-9）等参与细胞粘附作用相关蛋白在APP/PS1小鼠血浆孵育组也明显多于WT小鼠血浆孵育组。结论：PEG-PLA纳米粒在AD模型小鼠中表现出的高入脑量,可能与AD疾病影响纳米粒蛋白冠组成有关。     

综述与专论: 核酸适配体在肾癌中的应用

肾癌是泌尿系统最常见的肿瘤之一,发病率呈上升趋势。肾细胞癌作为肾脏肿瘤的主要类型,具有较高的局部浸润和远处转移的频率,约33%~50%的肾细胞癌患者在发现时已发生转移。由于肾细胞癌早期无特异性体征和症状,主要治疗手段是手术切除,对放化疗不敏感,治疗手段有限,因此肾细胞癌的早期诊断能够大大提高肾细胞癌有效治疗的机会,对于肾癌的有效治疗具有十分重要的意义。核酸适配体是通过指数富集的配体系统进化技术（systematic evolution of ligands by exponential enrichment,SELEX）,从核酸分子文库中得到的寡核苷酸片段,能够选择性地与小分子配体或高亲和力的蛋白质靶标结合,对靶分子或细胞具有较高的亲和力和特异性,目前已广泛应用于肿瘤影像学诊断及靶向治疗中。本文主要综述了与肾癌相关的核酸适配体,并对于适配体在肾癌诊疗中的应用进行了总结和讨论。     

羧基化介孔二氧化硅纳米颗粒递送PD-L1抑制剂治疗膀胱癌的作用研究

摘要 目的：构建羧基化介孔二氧化硅纳米颗粒（COOH-MSN）递送PD-L1抑制剂治疗膀胱癌。方法：构建负载PD-L1抑制剂的COOH-MSNs,透射电镜检测纳米颗粒的特征,zeta电位分析仪检测纳米颗粒的电位变化;流式细胞术检测血液中T细胞和CD8⁺T细胞的比例;MTT实验检测细胞增殖;构建小鼠荷瘤模型,HE染色检测基本的病理学变化,免疫组化检测ki-67的表达。结果：透射电镜结果显示纳米颗粒呈圆形,直径约为100 nm;COOH-MSNs表面带负电荷,BSA呈强负电性,BSA包封后纳米材料整体负电荷增强;纳米材料可显著提高T细胞和CD8⁺T细胞的比例,并进一步抑制膀胱癌细胞的增殖;动物实验结果显示纳米材料可抑制移植瘤的生长,且移植瘤内淋巴细胞的数量显著升高;免疫组化结果显示相对于PD-L1抑制剂组,纳米材料组ki-67增殖指数显著减低;HE染色结果显示PD-L1抑制剂组肾组织内可观察到血管充血、扩张和较多炎细胞浸润,而纳米材料组肾组织损伤程度显著降低。结论：我们构建了一种负载有PD-L1抑制剂的COOH-MSNs,可有效激活抗肿瘤免疫反应,并降低对正常器官的损伤。     

pH敏感纳米粒的制备和功能表征

目的:制备具有pH响应的甲氧基聚乙二醇甲基丙烯酸-2-六亚甲基亚胺乙酯聚合物,测试材料pH功能响应,以及建立聚合物纳米粒载药方法。方法:通过核磁共振氢谱鉴定ATRP(Atom Transfer Radical Polymerization)聚合反应所获得的化合物结构。滴加-搅拌挥发法制备聚乙二醇甲基丙烯酸-2-六亚甲基亚胺乙酯纳米粒,酶标仪测定其载药量和包封率。透射电镜下观察其形态,激光粒度仪分析测定其粒径,包载DiR红外荧光探针检测纳米粒pH响应功能。结果:分别成功合成得到2-溴代异丁酸聚乙二醇单甲醚和甲基丙烯酸-2-六亚甲基亚胺乙酯单体。通过ATRP聚合反应成功合成聚乙二醇甲基丙烯酸-2-六亚甲基亚胺乙酯聚合物材料,并通过核磁氢谱对聚合材料进行鉴定。通过滴加搅拌法制备包载有模型药物香豆素-6的纳米粒,并对纳米粒的形态表征及载药量进行测定。结论:试验结果表明制备得到的聚合物纳米粒尺寸均匀,具有预期的pH响应效果,可以装载模型药物。     

综述与专论: 基于核酸适配体的细胞外囊泡分离分析方法

细胞外囊泡通过参与细胞间通讯，在诸多生理病理过程中发挥着重要作用。因此，细胞外囊泡的分离分析对理解其生物学功能以及发展基于囊泡的疾病诊疗方法具有重要价值。细胞外囊泡的高效分离以及高灵敏可靠检测很大程度上取决于识别配体。核酸适配体是一类高效、特异结合其靶标分子的单链寡核苷酸。核酸适配体的易修饰和可程序化设计等特征，使其成为细胞外囊泡分离和分析的理想识别配体。为提高细胞外囊泡的分离效率，研究者们提出多种策略用于提升核酸适配体的亲和力，以及界面与细胞外囊泡的接触几率。此外，分离不同亚型的细胞外囊泡有助于理解细胞外囊泡的生物学意义。在细胞外囊泡分析方面，根据核酸适配体与细胞外囊泡识别信号的转导方式不同，分为电化学、可视化、表面增强拉曼光谱、荧光法等方法。本文综述了核酸适配体的筛选以及其在细胞外囊泡分离和分析中的最新进展、挑战及未来方向。     

基于核酸适配体的生物分析新方法研究进展

核酸适配体是从随机文库中采用SELEX技术筛选所得的单链短链寡核苷酸片段(通常为15-80个ss DNA或ss RNA)。其能够折叠形成独特稳定的三维结构,通过静电相互作用,氢键,范德华力,碱堆叠或多种作用力组合特异性地与多种靶标结合。适配体因具有构象变化能力而被用作生物分析中的理想识别配体。目前,基于适配体的生物分析新方法得到广泛研究,并用于蛋白多肽类药物分析、疾病标志物诊断、外泌体检测、循环肿瘤细胞检测和病毒检测等方面。本文综述了核酸适配体用于生物分析方法开发的最新进展,比较和讨论不同分析方法,并对基于适配体的生物分析新方法提出了设想和展望,为开发新的生物分析方法和检测技术提供了思路和借鉴。     

用于可视化光治疗的Mn3O4@CuS纳米粒的制备研究

摘要 目的：本研究旨在制备用于肿瘤可视化光治疗的多功能Mn₃O₄@CuS核壳型纳米粒,在磁共振成像的引导下,使用近红外光定点辐照,实现局部光热消融治疗。方法：（1）采用高温热解法制备油胺稳定的Mn₃O₄纳米粒,在其表面构建CuS壳层,并进行聚乙二醇修饰,得到分散于水相中的Mn₃O₄@CuS核壳型纳米粒。（2）通过透射电镜、紫外可见近红外吸收光谱等方法对该纳米粒进行理化性质表征,并研究其体外磁共振成像、光热升温等性能。结果：制备的水相分散的Mn₃O₄@CuS纳米粒,粒径均一且分散性较好,形态为近圆形,粒径为9.30±2.29 nm;紫外可见近红外吸收光谱图表明Mn₃O₄@CuS纳米粒在近红外区有较强吸收,最大吸收峰位于1100~1200 nm范围;磁共振成像分析结果可计算出Mn₃O₄@CuS纳米粒的纵向弛豫率r1为1.662 mM^-1s^-1,表明其具有较好的磁共振增强造影效果;光热升温曲线显示Mn₃O₄@CuS纳米粒可在785 nm近红外激光下升温至73.5 ℃,具备较好的光热治疗潜力。结论：本文成功制备出水相分散的Mn₃O₄@CuS核壳型纳米粒,具有良好的磁共振造影成像性能和光热升温效应,有望应用于磁共振成像引导下的肿瘤可视化光治疗。     

Efficient Search on Energy Minima for Structure Prediction of Nucleic Acid Motifs

Abstract

Structure prediction of non-canonical motifs such as mismatches, extra unmatched nucleotides or internal and hairpin loop structures in nucleic acids is of great importance for understanding the function and design of nucleic acid structures. Systematic conformational analysis of such motifs typically involves the generation of many possible combinations of backbone dihedral torsion angles for a given motif and subsequent energy minimization (EM) and evaluation. Such approach is limited due to the number of dihedral angle combinations that grows very rapidly with the size of the motif. Two conformational search approaches have been developed that allow both an effective crossing of barriers during con-formational searches and the computational demand grows much less with system size then search methods that explore all combinations of backbone dihedral torsion angles. In the first search protocol single torsion angles are flipped into favorable states using constraint EM and subsequent relaxation without constraints. The approach is repeated in an iterative manner along the backbone of the structural motif until no further energy improvement is obtained. In case of two test systems, a DNA-trinucleotide loop (sequence: GCA) and a RNA tetraloop (sequence: UUCG), the approach successfully identified low energy states close to experiment for two out of five start structures. In the second method randomly selected combinations of up to six backbone torsion angles are simultaneously flipped into preset ranges by a short constraint EM followed by unconstraint EM and acceptance according to a Metropolis acceptance criterion. This combined stochastic/EM search was even more effective than the single torsion flip approach and selected low energy states for the two test cases in between two and four cases out of five start structures.     

核酸试纸条检测方法研究进展*

凝胶电泳、实时荧光PCR等常规核酸检测方法存在操作繁琐、设备昂贵、反应时间长等局限性。随着核酸检测市场规模的大幅提升,常规检测方法已无法满足临床诊断、检验检疫的需求。核酸试纸条(nucleic acid detection strip,NADS)是一种新兴的核酸检测方法,具有灵敏度高、操作便捷、结果可视化、成本低且耗时短等优势,在基础研究与临床诊断等领域受到广泛关注。综述近年来NADS的检测方法及研究进展,系统总结该技术的原理、应用及临床潜在转化价值,以期为NADS的进一步开发、利用提供借鉴。     

艾滋病毒核酸探针的制备

 采用PXY104(含化学合成的HIV-env26肽基因4重串联体结构)为材料。温和裂解法提取质粒DNA,制备电泳纯化,Hind Ⅲ和EcoR Ⅰ酶解,低融点琼脂糖凝胶电泳回收HIV-DNA片段作为核酸探针;用[α-~(32)P]dATP通过缺口移位法标记,比放射性为4.05—6.69×10~7cpm/μgDNA通过分子杂交能测出lPg的靶DNA,初步试验结果表明,在本文试验条件下,可用该探针检测与之互补的核酸分子。     

简化核酸提取过程在病原体核酸检测中的应用现状和发展趋势

简化核酸提取过程相较于经典的试剂盒法和全自动核酸提取技术,凭借其简便的操作步骤、便携易用的仪器设备和简单的人员培训等优势在病原体核酸检测中得到广泛应用,为实现病原体核酸的快速检测和现场检测(Point-of-care testing,POCT)奠定了良好的基础。本文比较了不同的核酸提取方法,对简化核酸提取过程的方法学进行综述,讨论其在病原体核酸检测领域中的应用现状,并展望其发展趋势。     

核酸提取方法进展

核酸提取是分子生物学的基本方法,也是核酸诊断中最关键的方法,它是下游诊断、分析和制备的前提。过去的核酸提取方法繁琐费时且有限。目前,核酸提取方法已经取得了较大进步。本文综述了核酸提取方法的进展情况,包括传统的基于溶液的抽提方法、现在常用的柱提取法、正兴起的多效生物分子抽提法和自动化抽提系统等。多效生物分子抽提法、自动抽提系统的微型化和完全自动化或者它们的组合是核酸提取技术未来发展的方向。     

核酸提取方法进展

核酸提取是分子生物学的基本方法,也是核酸诊断中最关键的方法,它是下游诊断、分析和制备的前提。过去的核酸提取方法繁琐费时且有限。目前,核酸提取方法已经取得了较大进步。本文综述了核酸提取方法的进展情况,包括传统的基于溶液的抽提方法、现在常用的柱提取法、正兴起的多效生物分子抽提法和自动化抽提系统等。多效生物分子抽提法、自动抽提系统的微型化和完全自动化或者它们的组合是核酸提取技术未来发展的方向。     

吸毒人群中HIV/HCV核酸和抗体关系的分析

研究了高危人群中HIV/HCV核酸和抗体的关系。从新疆地区采集吸毒人群的血样,并对其进行HIV/ HCV核酸和抗体的检测。320例吸毒人员血浆样品中HCV抗体阳性为80．3％,HIV抗体阳性率为41．9％,HIV 和HCV共感染者为38．3％。HIV RNA与抗体的总符合率为98．8%,在186例HIV抗体阴性样品中可能有2例 为HIV感染的窗口期。HCV抗体和HCV RNA的阳性符合率为92．6％,HCV RNA与HCV抗体的总符合率为 90．0％,以上结果说明在HIV／HCV的高流行区进行HIV／HCV核酸检测可以发现病毒感染的窗口期,而约8% 的HCV抗体阳性样品为病毒核酸阴性,也值得进一步研究。     

水稻条纹病毒蛋白与核酸的特性

提纯的水稻条纹病毒(云南宜良分离物)在电镜下的形态为多型性,但主要是宽8-10 nm,长80-250的分枝丝状体,有些为直径3 nm或8 nm的开环环状体,有些为13 nm宽,130-190 nm长的丝状体,但其基本结构应是直径3 nm、长度不等的丝状体.经聚丙烯酰胺凝胶电泳分析,vRNA4编码的病害特异蛋白(SP)分子量为19.9 kDa,而vcRNA3编码的外壳蛋白(CP)约为33.6 kDa.在非变性条件下,RSV的4条ssRNAs大小分别为3.0×106(ssRNA1)、1.2×106(ssRNA2)、0.9×106(ssRNA3)和0.8×106 Da(ssRNA4),有时出现一条大小为0.58×106 Da的单链RNA(ssRNA5);而4条dsRNAs的分子量分别为4.9×106(dsRNA1)、2.8×106(dsRNA2)、2.0×106(dsRNA3)和1.7×106 Da(dsRNA4).利用制备电泳分离提纯的外壳蛋白免疫家兔,得到了高特异性的抗血清.A蛋白夹心ELISA检测结果表明,RSV-CP与水稻草状矮化病毒(RGSV)CP抗血清有微弱的反应,但与RSV、RGSV的SP抗血清没有反应,而RSV-CP抗血清与RSV-SP及RGSV的SP、CP都无血清学关系,这个结果表明RGSV与RSV之间在进化上具有一定的亲缘关系.