鸭β-防御素5基因的分离、鉴定及其生物学作用

为克隆与表达鸭β-防御素5 (AvBD5)基因及测定其生物学特性,采用RT-PCR方法从鸭肺脏组织中扩增到鸭AvBD5,将测得的序列与已发现的禽β-防御素和部分哺乳类动物β-防御素的氨 基酸序列构建进化树进行同源性分析.结果显示鸭AvBD5 cDNA大小为201 bp,编码66个氨基酸残基,内含6个位置保守的半胱...     

鹅β-防御素3基因的分离、鉴定及其表达产物的生物学特性

为了克隆鹅β-防御素(AvBD)3基因,并在原核表达重组鹅AvBD3蛋白,进一步研究鹅AvBD3蛋白的生物学特性,利用RT-PCR方法从鹅脾脏和法氏囊组织中扩增到鹅AvBD3基因片段,其cDNA片段大小为182 bp,编码60个氨基酸残基.经同源性分析发现鹅AvBD3氨基酸序列与鸡AvBD3氨基酸序列同源性最高,为100％.将该基因亚克隆到原核表达载体pGEX-6p-1的BamH Ⅰ和SalⅠ双酶切位点上,构建重组表达质粒pGEX-goose AvBD3.将重组质粒转化大肠杆菌BL21,于37℃用IPTG诱导表达,SDS-PAGE电泳表明,重组鹅AvBD3蛋白在原核高效表达(分子量约31 kDa).该重组蛋白经纯化后测定其体外抗菌活性与理化特性,结果显示,重组鹅AvBD3蛋白具有广谱的抗菌活性,对12种细菌,包括革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌均具有抑菌作用.高盐离子浓度显著降低重组鹅AvBD3蛋白的抗菌活性.此外,该重组蛋白的溶血活性极低,并对酸碱度具有较高的稳定性.     

鸽β-防御素5基因克隆及其抗菌活性

从鸽的骨髓和肝组织中扩增到2个禽β-防御素(AvBD)基因,在大肠杆菌中高效表达,检测其重组蛋白的抗菌活性。应用RT-PCR方法从鸽的骨髓和肝脏组织中扩增AvBD5基因,根据已发现的禽β-防御素和部分哺乳类动物β-防御素-5的氨基酸序列构建系统进化树,将该基因克隆到大肠杆菌原核表达载体pGEX-6p-1上进行原核表达,对该重组蛋白进行纯化,测定体外抗菌活性与理化特性。测序得到这2个基因的cDNA大小均为201 bp,编码66个氨基酸残基,内含6个位置保守的半胱氨酸残基。经遗传进化分析发现,该基因推导的两组氨基酸序列与鸭AvBD5的同源性最高,分别为87.9%和78.8%,这两组氨基酸序列的同源性为83.3%。因此,将其分别命名为鸽AvBD5α(骨髓)和鸽AvBD5β(肝脏)。进一步将这两个基因分别亚克隆到大肠杆菌pGEX-6p-1载体中进行原核表达。两个重组融合蛋白经纯化后,通过菌落计数法测定其体外抗菌活性,盐离子浓度对其抗菌活性的影响,及其融合蛋白的溶血活性。结果表明,重组鸽AvBD 5α、AvBD 5β融合蛋白的分子量约为32 kDa。具有明显的抗菌活性,对12种细菌均有不同程度的抑制作用,高盐浓度对其抗菌活性显著影响。此外,这两个重组蛋白对红细胞无显著溶血活性。     

重组鹅β-防御素12蛋白的原核表达及生物学特性

【目的】研究重组鹅β-防御素12蛋白的原核表达并探究其生物学特性。【方法】采用His标签蛋白原核表达系统,将鹅防御素12(Av BD12)基因亚克隆到表达载体p Pro EX-HTa上,构建重组表达质粒。将重组表达质粒转化到大肠杆菌Rosseta感受态中,用IPTG进行诱导表达,并对该重组蛋白进行纯化。进一步采用菌落计数法测定其体外抗菌活性和盐离子稳定性。【结果】经Tricine-SDS-PAGE电泳分析,诱导表达的鹅Av BD12重组蛋白分子量约为12 k D,大部分以包涵体形式存在。该重组蛋白对大肠杆菌、鸡白痢沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、四联球菌、枯草芽孢杆菌均具有抗菌活性,高浓度盐离子显著抑制重组蛋白的抗菌活性。此外,该重组蛋白对鸡红细胞没有溶血活性。【结论】该重组蛋白具有广谱抗菌活性,高浓度盐离子显著降低其抗菌活性,且该重组蛋白不具有溶解鸡红细胞的活性。     

草鱼β-防御素1的趋化活性及免疫佐剂效应研究

为了探究草鱼防御素的免疫调节作用, 研究通过Clustal Omega多序列比对和I-TASSER二级结构预测, 发现草鱼β-防御素1(Ctenopharyngodon idella β-defensin 1, CiBD1)是一类具有两亲性的富含半胱氨酸的小分子阳离子肽, 其结构在硬骨鱼类中高度保守; 通过构建pET-32a-CiBD1原核表达载体, IPTG诱导表达后经过Ni2+亲和层析法纯化和肠激酶酶切获得CiBD1重组蛋白, 通过CFU平板法验证了CiBD1的抑菌活性, 当蛋白浓度达到200 μg/mL时, 对革兰氏阴性菌(G+)及革兰氏阳性菌(G–)都具有显著的抑制活性; 趋化实验表明CiBD1在50 ng/mL时对草鱼原代白细胞趋化活性最佳; 通过个体实验探究了CiBD1重组蛋白对嗜水气单胞菌灭活疫苗的免疫佐剂效应, 发现添加 CiBD1佐剂组死亡率显著低于单独疫苗组, 且该组IgM和MHC Ⅱ转录水平及血清中补体3(C3)和溶菌酶含量都显著高于对照组。研究表明CiBD1重组蛋白在细菌抗感染免疫中发挥着重要作用, 在水产养殖中具有一定的应用前景。     

β-防御素2的生物学作用

防御素是一类阳离子抗菌肽,具有天然的抗茵活性.β-防御素2是第一个在人体中被发现的可诱导性防御素,它不仅可通过直接杀菌作用抵御入侵机体的病原微生物,还在介导获得性免疫反应、调节机体的免疫炎症反应和创伤修复过程中起着重要作用.另外,β-防御素2在肺损伤、白血病等疾病的预防和治疗中也有着重要的作用,表现出其广阔的应用前景.     

稳定表达禽β防御素6的DF-1细胞系的建立及其抑菌活性

[背景]禽β防御素6是禽体内分泌的一类抗菌肽,在抵抗病原入侵和免疫调节中发挥着重要作用,但其常规表达方式效率较低,难以在产业化生产中加以应用.[目的]建立稳定表达AvBD6的细胞系,并检测其表达产物对耐药大肠杆菌的抗菌活性,为其他防御素表达提供参考.[方法]利用显微镜观察构建真核重组表达载体pLOV-eGFP-AvBD...     

β-防御素130在大肠杆菌中的串联表达、纯化及生物活性分析

为了研究抗菌肽β-防御素130的生物学活性和实现大规模制备,通过改良其分子结构,构建表达载体pET28a-3×β-defensin130,利用大肠杆菌BL21 (DE3)作为宿主细胞诱导表达后为水溶性蛋白。对纯化后抗菌肽进行抑菌实验、稳定性实验、MTT实验和溶血性实验确定其生物活性。最终成功制备出25 kDa的重组蛋白,对金黄色葡萄球菌(ATCC25923)(45μg/mL)和单增李斯特菌(ATCC221633)(80μg/mL)等革兰氏阴性和阳性菌都表现出极强的抗菌活性,且其抗菌活性不受温度、pH值和蛋白酶消化等影响,MTT细胞毒性实验显示其对HEK293细胞无毒性且对兔源红细胞具有极低的溶血性。这将为新型抗菌肽的开发提供理论基础并推动抗生素替代产业快速发展。     

大肠杆菌中融合表达人β防御素-3基因的研究

目的 为了在大肠杆菌中融合表达人β防御素-3基因。方法 根据大肠杆菌对精氨酸密码子使用的偏爱性,设计搭桥引物,并通过PCR扩增法合成了人β防御素的全基因序列,克隆进pGEX-4T-2中构建pGEX-4T-2-hBD-3融合表达载体。将表达载体转化E.coli宿主菌DH5α,进行IPTG诱导表达。将菌体反复冻溶使细胞膜穿孔,释放可溶性蛋白。融合蛋白GST-hBD-3经凝血酶切割。结果 研究得到了重组人防御素蛋白,琼脂孔穴扩散抑菌法检测表明,重组人β防御素3对金黄色葡萄球菌有抗菌活性,抑菌效价为0.843 U。结论 人β防御素-3基因在大肠杆菌中得到了融合表达。     

阴道乳杆菌诱导细菌性阴道病患者β-防御素2表达及其抗菌活性的研究

目的 观察阴道乳杆菌诱导阴道黏膜细胞表达β防御素-2 (hBD-2) 的情况,检测其表达,观察hBD-2的体外抗菌活性.方法 分为3组,即健康对照组(n=10)、BV组(n=10)和阴道乳杆菌干预组(n=8).采用RT-PCR半定量法,检测阴道组织hBD-2 mRNA的水平.用琼脂糖弥散法检测其抗菌活性.结果 与健康对照组相比,BV组、阴道乳杆菌干预组hBD-2 mRNA的水平明显升高(P<0.05);阴道乳杆菌干预组hBD-2 mRNA的水平较BV组增高(P<0.05);琼脂糖弥散法显示,hBD-2对金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌有明显的杀灭效应.结论 阴道乳杆菌干预对BV患者治疗可以使hBD-2 mRNA表达水平上调,提示其在维系正常妇女生殖道内环境稳定、宿主天然抗感染机制中起着重要的作用.     

OSF1在毕赤酵母菌中的分泌表达及其生物活性

为了研究人成骨细胞刺激因子(Human osteoblast-stimulating factor,OSF-1)的生物学活性,构建OSF-1高效毕赤酵母表达菌株并表达纯化具有生物活性的OSF-1。首先通过全基因人工合成的方法合成人osf-1基因,并克隆至毕赤酵母分泌表达载体pPIC9K,构建重组表达质粒pPIC9K/osf-1,线性化后电转化酵母宿主菌GS115,构建P.pastoris GS115/pPIC9K/osf-1,经MD、G418-YPD平板和PCR法筛选,获得多拷贝转化子。阳性表达菌株在25℃,经1%的甲醇诱导表达96 h,重组蛋白的表达量达到最大。经SDS-PAGE电泳分析所表达的重组蛋白约为18 kDa,与人成骨细胞刺激因子相符。表达上清经SP-Sephadex C-50离子交换层析进行纯化,得到纯度达98%以上的OSF-1。Western blotting鉴定该蛋白对人成骨细胞刺激因子抗体具有良好的抗原性。生物活性测定表明提纯的OSF-1能促进鼠成骨细胞MC3T3-E1的增殖和分化。利用重组毕赤酵母高效分泌表达了有生物活性的OSF-1,为进一步开展其抗骨质疏松活性研究及产业化开发奠定了基础。     

Cloning and expression of two plant proteins: similar antimicrobial activity of native and recombinant form

Antimicrobial peptides and proteins are being studied with increasing interest because of their broad range antimicrobial activity. Among plant antimicrobial proteins, the wheat seed polypeptides, puroindoline a and puroindoline b, are particularly interesting because of their established antibacterial activity. In this paper we describe different strategies used to clone His tagged and GST tagged puroindolines obtaining 1.5 mg recombinant protein from 1 l culture. The antimicrobial activity of recombinant and native puroindolines was comparable.     

Soluble fusion expression and characterization of bioactive human beta-defensin 26 and 27

This study reports the first successful recombinant expression of cationic antimicrobial peptides human beta-defensin-26 and human beta-defensin-27 in Escherichia coli. HBD26 and HBD27 genes were synthesized through codon optimization, and each gene was then cloned into the expression vector pET32, which feature fusion protein thioredoxin at the N-terminal. The recombinant plasmids were then transformed into E. coli BL21 (DE3) and cultured in MBL medium, which gave yields of HBD26 and HBD27 fusion proteins of up to 1.38 and 1.29 g l⁻¹, respectively. Affinity chromatography was used to purify the soluble fusion proteins, and the N-terminal TrxA tags were cleaved off by enterokinase. Pure HBD26 and HBD27 were then obtained by cationic exchange chromatography. The overall recovery of HBD26 was 38% and that of HBD27 reached 36%. Both variants showed salt-sensitive antimicrobial activity against gram-negative E. coli but not against gram-positive Staphylococcus aureus and Saccharomyces cerevisiae.     

DCD-1L在毕赤酵母中的克隆和表达

由于细菌对抗生素耐药性的产生 ,迫切需要寻求一种新的抗菌剂来代替它。DCD是最近从人汗腺中发现的具有广谱抗菌活性的抗菌肽。与抗生素不同 ,它不会在生物体内富集 ,也不会诱导产生耐药菌株。为了能快速并低成本地获得该肽 ,DCD 1L基因 ,第一次被克隆到毕赤酵母载体pPIC9中 ,并在毕赤酵母GS1 1 5中进行表达。实验结果显示毕赤酵母GS1 1 5系统所表达的DCD 1L在pH5 5～ 7 4范围内具有抗大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的活性。这个结果说明在毕赤酵母中表达的DCD 1L能够抗部分革兰氏阴性和阳性细菌。     

类橡胶蛋白AbAMP1的重组表达及其抑菌活性研究

将类橡胶蛋白AbAMP1基因克隆至pPIC9,获得重组载体pPIC9-Ab,线性化后转化Pichia pastoris SMD1163,筛选获得阳性转化子.取表型为Mut*的转化子AS16进行诱导表达,上清经Tricine-SDS-PAGE分析,在约4.7 kD处有一条较强主带,与AbAMP1的预期大小相符,表明获得高效表达.上清经酸性非变性电泳后,用凝胶琼脂糖弥散法测定其抑菌活性,在含Bacillus thuringiensis琼脂糖平板AbAMP1对应处有一明显抑菌带,说明重组表达的AbAMP1具有天然活性.上清液抑菌活性试验显示,AbAMP1对Fusarium oxysporum f.sp.cubense以及B.thuringiensis,B.subtilis,Staphylococcus aureus等G 细菌均有显著的抑制作用,而对其它供试丝状真菌、酵母菌以及G-细菌无明显抑制作用.     

日本鳗鲡的C-型和G-型溶菌酶研究

研究以日本鳗鲡(Anguilla japonica Temminck et Schlegel)为研究对象, 根据其基因组数据库, 预测并扩增出2类, 共5个溶菌酶基因, 包括1个C-型溶菌酶和4个G-型溶菌酶, 分别命名为AJLysC、AJLysG1、AJLysG2、AJLysG3和AJLysG4。它们的cDNA全长分别为811、749、1352、1175和733 bp, 编码143、193、185、185和187个氨基酸。SignalP预测表明, AJLysC和AJLysG1的N-端分别包括15和19氨基酸的信号肽, 另外3种溶菌酶没有信号肽。基因组分析显示, AJLysC、AJLysG2、AJLysG3和AJLysG4的基因结构与其他鱼类的同类溶菌酶的基因结构相似, C-型溶菌酶具有4个外显子, G-型则具有5个。但是, AJLysG1的基因结构与其他鱼类G-型溶菌酶不同, 具有6个外显子, 与其他鱼类溶菌酶的蛋白序列比较, 发现AJLysG1缺失其他G-型溶菌酶存在的第2个酶活性位点氨基酸, 即天冬氨酸Asp。AJLysC与其他很多物种的C-型溶菌酶具有较高的同一性, 如与牙鲆的同一性为72.7%。G-型溶菌酶中AJLysG2、AJLysG3、AJLysG4彼此之间以及与其他物种G-型溶菌酶的同一性相对较高; 而AJLysG1与其他物种以及与其他3种G-型溶菌酶的同一性均不高, 且都在50%以下。组织表达分析显示, 所有5个溶菌酶基因在12种检测的组织中均有表达。C-型溶菌酶在胃及免疫相关组织的表达量较高; G-型溶菌酶在各组织/器官中的表达则差异较大, AJLysG1在皮肤和肌肉中的表达量最高, AJLysG2在免疫组织/器官如血液、头肾、体肾和鳃中表达量较高。经迟缓爱德华氏菌(Edwardsiella tarda)刺激48h后, 这5个溶菌酶基因在组织/器官中的表达量均有上调, 其中在血液、肠道和头肾等的上调较为显著。此外, 研究尝试重组表达这些抗菌肽, 获得了AJLysG2、AJLysG3和AJLysG4基因在鲤上皮瘤细胞(Epithelioma papulosum cyprinid, EPC)细胞中的表达, 重组蛋白表现出对溶壁微球菌(Micrococcus lyso-deikticus)生长的明显抑制作用。文章较全面地研究了日本鳗鲡溶菌酶基因的组成和类型及其表达变化, 并重组表达了部分基因, 这为进一步研究这些溶菌酶的功能, 特别是对病原微生物的作用奠定了基础。     

重组乳酸乳球菌表达禽流感病毒HA1基因载体的构建及在禽流感病毒防治领域的应用

目的构建以重组乳酸乳球菌为基础的黏膜输送载体。方法以高致病性禽流感病毒H5N1的HA1基因作为研究对象,利用nisin诱导表达控制系统,构建分泌型与非分泌型重组乳酸乳球菌表达载体,经口服灌胃途径免疫BALB/c小鼠,通过ELISA检测小鼠血清IgG和粪便IgA,最后,对免疫后的小鼠进行H5N1病毒攻击实验,进而比较分泌型与非分泌型重组乳酸乳球菌表达载体的免疫效率。结果分泌型重组乳酸乳球菌免疫小鼠后产生的抗体水平（IgG和IgA）高于非分泌型重组乳酸乳球菌,经过同型H5N1病毒攻击后,分泌型重组乳酸乳球菌免疫的小鼠的存活率为80%,而非分泌型重组乳酸乳球菌免疫的小鼠的存活率为60%。结论本研究为防治高致病性禽流感病毒提供可行的思路与方法。     

人SCYL1-BP1重组蛋白的原核表达及分离纯化鉴定

前期研究结果发现,SCYL1-BP1具有细胞周期调控功能,同时具有肿瘤抑制因子的特性。目的:采用基因工程技术,构建SCYL1-BP1的大肠杆菌重组表达菌株,以获得足够量的高纯度目的蛋白,为后面进行一系列药理学检测及新药安全性测试奠定基础。方法:利用从人胎脑cDNA文库中克隆得到SCYL1-BP1基因克隆为模板,经PCR扩增,通过酶切位点克隆到新型原核表达载体pET-28b-SUMO上,转化大肠杆菌表达菌BL21(DE3)。经IPTG诱导表达,摸索优化表达条件,表达产物经Ni柱进行亲和层析纯化,后再进行SDS-PAGE和Western blot等分析鉴定。结果:成功构建了SCYL1-BP1的原核表达工程菌BL21(DE3)/pET-28b-SUMO-SCYL1BP1。SDS-PAGE和Western blot检验结果表明,诱导表达的融合蛋白His6-SUMO-SCYL1BP1的分子量约为65 kDa,主要以可溶的形式存在,且能被His标签抗体和SCYL1-BP1单克隆抗体特异性识别。结论:原核表达并纯化了人SCYL1-BP1融合蛋白,为其后续功能研究及性质实验奠定基础。