L-苯丙氨酸生产方法及新菌株

<正> L-苯丙氨酸(以下缩写成苯丙氨酸)是合成天门冬苯丙氨酸甲苯酯的重要前体物。天门冬苯丙氨酸是近年来最受人们重视的一种二肽甜味剂。这样就关系到了苯丙氨酸生产工艺问题。在这一工艺程序中最重要的是如何经微生物反应由肉桂酸与氨苯供体生产苯丙氨酸。     

美洲大蠊抗氧化活性成分研究

对美洲大蠊(Periplaneta americana)虫体95%乙醇提取物的化学成分进行研究。采用硅胶柱色谱,凝胶柱色谱,开放ODS柱色谱和半制备高效液相色谱等技术进行分离纯化,通过核磁共振、质谱等方法鉴定化合物的结构。结果从乙酸乙酯部位分离并鉴定14个化合物,分别为:环(L-缬氨酸-L-脯氨酸)二肽(1)、3,4-二羟基苯乙醇(2)、原儿茶酸(3)、环(L-异亮氨酸-L-脯氨酸)二肽(4)、环(L-苯丙氨酸-L-缬氨酸)二肽(5)、烟酸(6)、马尿酸(7)、aspongpyrazine A(8)、aspongopusin(9)、(2R,3S)-2-(3',4'-dihydroxyphenyl)-3-acetylamino-7-hydroxyethyl-1,4-benzodioxane(10)、(2R,3S)-2-(3',4'-dihydroxyphenyl)-3-acetylamino-7-(N-acetyl-2'-aminoethylene)-1,4-benzodioxane(11)、环(亮氨酸-脯氨酸)二肽(12)、1,2-二去氢-N-乙酰多巴胺(13)、3,4-二氢-8-羟基-2(1H)-喹啉酮(14)。其中化合物1、4~9和10~13为首次从大蠊属昆虫中分离得到,化合物10的波谱数据为首次报道。对已分离的14个化合物利用DPPH和ABTS+自由基清除实验评价化合物的体外抗氧化活性,结果显示化合物2、3、13具有潜在的抗氧化活性。     

蓖麻蚕中肠γ-谷氨酰转肽酶和底物的相互作用及其生理功能

蓖麻蚕Philosamta cynthia ?n,高度提纯的中肠γ-谷氨酰转肽酶(γ-GTP)体外转肽作用表明:L-苯丙氨酸、L-甲硫氨酸,L-半胱氨酸、L-色氨酸,L-精氨酸和L-赖氨酸是最好的γ-谷氨酰的受体,而L-谷氨酸和L-谷氨酰胺(L-Gln)系该酶良好的γ-谷氨酰供体。酶对γ-谷氨酰对硝基苯胺(γ-GNA)的K_m为0.13mmol/L(含L-苯丙氨酸)和0.29mmol/L(无L-苯丙氨酸)。谷胱甘肽(GSH)和L-Gln与γ-GNA竞争酶的γ-谷氨酰结合部位,其抑制常数K_1值分别为0.5mmol/L和1.1mmol/L。γ-GTP催化L-Gln的酰胺键水解和转肽,其催化速率相当于对γ-GNA的38％。     

大肠杆菌ppsA基因的克隆表达

L-苯丙氨酸是人体内8种必需氨基酸之一,是医药大输液的基本成分.苯丙氨酸和门冬氨酸组成的二肽甲酯是一种新型甜味剂,市场需求正在不断增长,因此构建高产酸的苯丙氨酸基因工程菌已成为形势所趋.苯丙氨酸工程菌的构建是基于芳香族氨基酸的生化合成途径进行的,包括单基因表达工程菌和多基因表达工程菌.单基因表达主要集中在芳香族转氨酶tyrB基因上,国内外有不少报道[1～3],苯丙酮酸转化为苯丙氨酸的转化率约为91%.在多基因表达方面,Ikeda等[4]克隆了3个芳香族氨基酸合成的有关基因,并进行多基因表达,苯丙氨酸产量为28g/L.磷酸烯醇式丙酮酸(P…     

蓖麻蚕中肠γ-谷氨酰转肽酶和底物的相互作用及其生理功能

蓖麻蚕Philosamta cynthia ricini,高度提纯的中肠γ-谷氨酰转肽酶(γ-GTP)体外转肽作用表明:L-苯丙氨酸、L-甲硫氨酸,L-半胱氨酸、L-色氨酸,L-精氨酸和L-赖氨酸是最好的γ-谷氨酰的受体,而L-谷氨酸和L-谷氨酰胺(L-Gln)系该酶良好的γ-谷氨酰供体.酶对γ-谷氨酰对硝基苯胺(γ-GNA)的K_m为0.13mmol/L(含L-苯丙氨酸)和0.29mmol/L(无L-苯丙氨酸).谷胱甘肽(GSH)和L-Gln与γ-GNA竞争酶的γ-谷氨酰结合部位,其抑制常数K₁值分别为0.5mmol/L和1.1mmol/L.Γ-GTP催化L-Gln的酰胺键水解和转肽,其催化速率相当于对γ-GNA的38%.     

深海放线菌Actinomadura sp.01119的代谢产物研究

采用硅胶柱色谱、制备薄层色谱和凝胶色谱等分离方法,对分离自深海沉积物中的海洋放线菌Actinomadura sp.01119的代谢产物进行研究,从中分离得到9个化合物,经1H NMR、13C NMR和MS等波谱分析并结合相关文献鉴定为环(L-苯丙-L-脯)二肽(1),环(L-脯-L-脯)二肽(2),环(L-酪-L-脯)二肽(3),环(D-酪-L-脯)二肽(4),环(L-异亮-L-脯)二肽(5),环(L-缬-L-脯)二肽(6),棕榈酸(7),对羟基苯甲酸(8),尿嘧啶(9)。其中化合物1~6为环二肽类化合物。     

酶法生产L-苯丙氨酸

<正> 一、前言直到几年前,L—苯丙氨酸(L-phe)主要用作输液,一年不过需要100～200吨。但近来作为人工甜味剂天冬甜精(L-苯丙氨酸甲酯和L-天冬氨酸的肽)的合成原料,对它的需求量显著增加,预测到1990年年需要量近8000吨。L-phe过去主要采用两种方法提供:直     

酶法生产L-高苯丙氨酸的研究进展

L-高苯丙氨酸(L-homophenylalanine,L-HPA)作为一种重要的非天然氨基酸,是合成治疗高血压的普利类药物等的关键中间体,具有广阔的市场前景。目前L-高苯丙氨酸的合成主要依赖于化学法,但化学合成L-高苯丙氨酸具有原料昂贵、步骤繁琐和污染严重等缺点,限制了广泛应用。因此,国内外研究者对L-高苯丙氨酸的酶法生产进行了深入的研究。本文就目前酶法合成L-高苯丙氨酸的工艺,包括脱氢酶法、转氨酶法、海因酶法和脱羧酶法的研究进展进行了综述,为酶法合成L-高苯丙氨酸提供一定的借鉴,为最终实现L-高苯丙氨酸的酶法工业化生产奠定基础。     

米曲霉来源的环二肽对荧光假单胞菌群体感应的抑制及其机制

荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)是一类重要的食品腐败菌,在乳制品、肉制品、水产品等食品中经常被检测到。细菌通过群体感应(quorum sensing,QS)系统来进行彼此之间的交流,腐败菌的一些特性也受到QS系统的调控。因此,以QS系统为靶点来控制食品的腐败,提高食品质量和安全性是一条潜在可行的途径。本研究中,笔者从米曲霉(Aspergillus oryzae) D01的次级代谢产物中分离得到了一种群体感应抑制剂——环二肽(L-苯丙氨酸-L-脯氨酸,cyclo-(L-phenylalanyl-L-prolyl)),并测定了其对荧光假单胞菌群体感应的抑制活性,并用分子对接的方法分析了其抑制机制。结果表明:当环二肽的质量浓度为60μg/m L时,细菌泳动运动、群集运动的区域直径比对照组分别减少了66. 62%和36. 92%;生物被膜含量比对照组减少了75. 86%。L-苯丙氨酸-L-脯氨酸能显著抑制荧光假单胞菌的QS表型——紫色素的产生、泳动和群集运动,胞外蛋白酶的产生和生物被膜的形成。分子对接分析表明,其抑制机制可能是由于环二肽与荧光假单胞菌的Lux I型蛋白竞争性结合,阻碍了信号分子产生并阻断了相关基因的表达所致。     

合成阿斯巴甜菌种的筛选

为了探索酶法合成阿斯巴甜的新思路和新方法,从富含蛋白的土样中筛选出能够分解二肽阿斯巴甜的菌种。利用其可逆性的特点,以L-天门冬氨酸和L-苯丙氨酸甲酯为主要合成原料,以菌体酶作为催化剂进行合成实验。经高效液相色谱检测,结果表明筛选到一株菌(ASPD1)能够合成阿斯巴甜;通过单因素实验法探讨了反应时间、温度、pH值等诸因素对产物形成的影响。     

甜味剂L-天冬氨酰-D,L-氨基丙二酸甲基葑基双酯的合成及其代谢的研究

N-苄氧羰基-β-苄基L-天冬氨酸和N-苄氧羰基-D,L-氨基丙二酸甲基葑基双酯用混合酸酐法缩合成保护的二肽,经钯黑脱保护基后得L-天冬氨酰-D,L-氨基丙二酸甲基葑基双酯,这个二肽的甜度高、甜质好、无苦后味。通过大白鼠的组织(脑、心、肾、脾、胰、胃、肠、肝)匀浆对此二肽甜味剂的分解代谢的研究说明,它能分解成为L-天冬氨酸、甘氨酸及葑醇,并通过体内代谢又可成为谷氨酸和丙氨酸等一般的氨基酸。因而,极其可能作为一个有实用价值而无毒性的甜味剂,应用于糖尿病、肥胖病等患者以及其他方面。     

我国自行构建的L-苯丙氨酸工程菌株发酵产酸率达国际先进水平

福建省发展和改革委员会于2009年1月17日对福建省麦丹生物集团有限公司和福建沙县侨丹实业有限公司共同承担的"L-苯丙氨酸高产基因工程菌的构建和应用"项目进行科技成果鉴定,由中国工程院院士、浙江工业大学原校长沈寅初教授和清华大学曹竹安教授等专家组成的鉴定委员会,对该项目给予很高的评价,认为所构建的工程菌株ES-4573-2其产酸率达国际先进水平,并足以形成具有自主知识产权的科技成果,使我国L-苯丙氨酸生产进入国际先进行列.L-苯丙氨酸是人体和动物不能在体内自行生物合成的必需氨基酸之一,广泛应用于食品、饲料、医药和日用化工等领域.尤其是低热量、高甜度的二肽甜昧剂-阿可斯巴甜的主要原料,市场需求量大.为进一步提高L-苯丙氨酸产酶产酸水平,增强我国L-苯丙氨酸在国际市场中的竞争力,该项目在两位国家级专家施巧琴教授和吴松刚教授的直接领导下,该课题组在国内外首次应用分子定向协同共进化技术对L-苯丙氨酸代谢途径关键酶基因进行整体改造,构建成突变库,筛选出具有高产酸水平的突变株,取得了显著成效.采用上述技术,工程菌株ES-4573-2经小试、中试进入试产,在采间歇式补料及发酵优化控制的基础上,产酸率较酪氨酸缺陷型宿主菌株提高了292％,取得了重大突破.目前,该工程菌株已在大生产中使用,生产性能稳定,对提高L-苯丙氨酸的产量和质量起了重要的作用,为我国发酵工业的发展作出了贡献.     

N~ω-硝基——L-精氨酸的合成

<正> N~ω-硝基—L-精氨酸是一种生化试剂,在国外已收入美国Sigma公司《试剂手册》中,在国內它是以苯甲酰甘氨酰—L—硝基精氨酸二肽产品收入于上海生化所东风试剂厂编的《生化试剂和生化药物》目录中。 1981年我室合成了N~Ф-硝基—L-精氨酸,并发现它具有抗肿瘤作用。经动物筛选     

铁皮石斛内生真菌次生代谢产物研究

为了解铁皮石斛(Dendrobium officinale)内生真菌Phyllosticta aristolochiicola的次生代谢产物,从该真菌中分离得到15个化合物,经波谱分析分别鉴定为N-methyl-2-pyrolidinone (1)、环-(甘氨酸-L-脯氨酸)(2)、环-(D-丙氨酸-L-脯氨酸)(3)、环-(L-缬氨酸-L-脯氨酸)(4)、环-(L-亮氨酸-L-脯氨酸)(5)、cyclo-(L-Leu-D-4-hydroxyprolinyl)(6)、环-(L-苯丙氨酸-L-脯氨酸)(7)、环-(L-苯丙氨酸-L-4-羟基脯氨酸)(8)、环-(L-酪氨酸-L-脯氨酸)(9)、环-(L-苯丙氨酸-L-亮氨酸)(10)、啤酒甾醇(11)、对羟基苯乙醇(12)、对羟基苯乙酸(13)、(2S,3R)-1-(4-羟基苯基)丁烷-2,3-二醇(14)和(2R,3S)-1-苯基丁烷-2,3-二醇(15)。采用MTS法检测抗肿瘤活性表明,化合物2、10和14对HL-60、A-549、SMMC-7721、MCF-7和SW-480细胞株具有一定的抑制活性。     

L-苯丙氨酸产生菌的选育

本文报导了不产酸的谷氨酸棒杆菌(Corynebacteriumglutamicum)经亚硝基胍处理,在一定浓度的L-苯丙氨酸结构类似物——对氟苯丙氨酸(DLP-Fluorophenylalalline,PFP)存在下,筛选获得了一批能产生与积累L-苯丙氨酸的抗代谢突变菌株,其中PFP-17突变菌株的产物在纸层析谱上L-苯丙氨酸的显色点较深,定量测定产酸为1.5mg/ml经两次自然分离获得的17-3-4菌株产酸特性稳定,在以葡萄糖为主要碳源,初糖为4.5%的摇瓶发酵中。产酸可达5.5mg/ml,产物经氨基酸自动分析代鉴测确证其主要产物是L-苯丙氨酸,此突变菌株经进一步选育所得的突变菌株3-PAP-42在提高初糖为6%时,发酵产酸可达8.28mg/ml。     

酪氨酸酶产生菌诱变及其转化条件的研究

<正> 酪氨酸酶(Tyrosinase)是一单加氧酶,可从哺乳动物、真菌、链霉菌属细菌、链孢霉属菌、芽孢杆菌属细菌中提取,它催化L—酪氨酸转化成L-3,4-二羟基苯丙氨酸(即左旋多巴,L—Dopa),转化能力的高低与菌株酪氨酸酶活性高低普遍具有正相关性。     

荧光法测定发酵液中的苯丙氨酸含量

本文介绍荧光测定微生物发酵液中苯丙氨酸含量的方法。它的原理是苯丙氨酸和茆三酮在pH5.8的酸性二肽溶液中能形成荧光产物。所产生的荧光再被铜离子增强并稳定之后,即可用荧光分先光度计进行测定。测定的激发光波长为365mm,发射光波长为500nm。本文对荧光测定的条件进行了研究,结果表明荧光测定发酵液中苯丙氨酸的含量是一种专一性强,灵敏度高,操作简便的微量分析方法。     

粘红酵母产L-苯丙氨酸解氨酶发酵培养基的优化

通过单因子和正交试验 ,对粘红酵母产 L -苯丙氨酸解氨酶 ( PAL )培养基进行优化 ,L-苯丙氨酸的积累浓度可以从 2 .0 g/1 0 0 ml提高到 3 .3 g/1 0 0 ml,最终得到了 L-苯丙氨酸解氨酶发酵的最适条件     

α-核突触蛋白基因突变小鼠脑组织中内源性代谢产物的变化

目的:明确α-核突触蛋白与帕金森病的病理生理相关性及其临床意义。方法:采用相色谱-质谱联用(UPLC-MS)检测野生型小鼠和基因突变型小鼠脑组织中内源性代谢性产物,通过mzcloud法对小鼠脑组织中内源性代谢物质进行鉴定,将相应数据进行主成分分析(PCA)和聚类分析,分析其相关差异表达代谢物,并构建通路图和互作网络图。结果:(1)基于LC/MS法的代谢组分析结果显示两组间差异代谢物以氨基酸类及磷脂类等为主,包括β-丙氨酰-L-组氨酸、L-精氨酸、L-组氨酸、L-亮氨酸、L-苯丙氨酸、L-缬氨酸、L-天门冬氨酸、L-丙氨酸、磷脂酰胆碱等;(2)构建的代谢通路主要涉及酮体的合成和降解、牛磺酸和亚牛磺酸代谢、丙氨酸,天冬氨酸和谷氨酸代谢、精氨酸和脯氨酸代谢、组氨酸代谢、苯丙氨酸代谢、缬氨酸,亮氨酸和异亮氨酸的生物合成、甘油磷脂代谢等,从中发现18个具有标志性的代谢成分。结论:α-核突触蛋白基因突变后,酮体的合成和降解、牛磺酸和亚牛磺酸代谢、丙氨酸,天冬氨酸和谷氨酸代谢、精氨酸和脯氨酸代谢、组氨酸代谢、苯丙氨酸代谢、缬氨酸,亮氨酸和异亮氨酸的生物合成、甘油磷脂代谢等代谢通路发生了变化,涉及β-丙氨酰-L-组氨酸、L-精氨酸、L-组氨酸、L-亮氨酸、L-苯丙氨酸、L-缬氨酸、L-天门冬氨酸、L-丙氨酸、磷脂酰胆碱等的生物学标志性代谢产物变化。     

大肠杆菌产L-苯丙氨酸发酵调控及代谢通量分析

考察了外源添加中间代谢产物、维生素B1和硫酸镁对大肠杆菌发酵产L-苯丙氨酸的影响,结果表明,添加1g/L柠檬酸三钠、1g/Lα-酮戊二酸、150mg/L维生素B1及3g/L硫酸镁均对L-苯丙氨酸的合成有利。根据构建的大肠杆菌合成L-苯丙氨酸的生化反应网络,利用代谢通量分析其原因。结果表明,这些物质的添加均可以调节G6P和PEP节点处的代谢通量分布,为L-苯丙氨酸的合成提供更多的前体物质赤藓糖四磷酸(E4P)、磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)和还原力NADPH。通过补料分批发酵实验得出,优化后菌体对总葡萄糖的消耗提高了24.49%,菌体终浓度提高了23.50%,L-苯丙氨酸的终浓度提高了62.87%,L-苯丙氨酸的收率提高了30.88%,乙酸的合成降低了56.51%。