三重RT-PCR同步检测马铃薯多种病毒影响因素*

根据病毒外壳蛋白区序列设计PVX、PVS特异性引物对 ,根据P1基因区序列设计PVA特异性引物对 ,应用三重RT PCR同步检测马铃薯X病毒 ,马铃薯A病毒及马铃薯S病毒 ,分别得到 5 62bp、 2 5 5bp、 1 82bp大小的扩增片段。试验从反转录反应、PCR反应及循环条件 3方面讨论了试剂和循环条件对三重RT PCR同步检测 3种病毒的影响。结果表明反转录反应中dNTPs浓度、 3种病毒下游引物浓度比例对整个反应影响较大 ;其次是PCR反应中MgCl₂ 浓度和退火温度 ;     

马立克病毒基因缺失疫苗与商品化疫苗的分子鉴别方法

为了对马立克病毒(MDV)meq基因缺失疫苗株SC9-1与商品化MD疫苗CVI988/Rispens株、814株和HVT FC-126株进行分子鉴别,本研究根据疫苗株SC9-1与其它MD疫苗株的基因组差异,分别针对I型MDVmeq基因以及SC9-1基因组中的禽网状内皮组织增殖症病毒-长末端重复序列(REV-LTR)插入片段,设计三对PCR扩增引物,同时合成针对meq基因和REV-LTR片段的地高辛标记探针,通过PCR扩增和斑点杂交方法区分SC9-1株与其他疫苗株。结果表明,使用针对meq基因的引物F1/R1进行PCR扩增,SC9-1株、CVI988/Rispens株、814株分别扩增出184bp、1 297bp、1 297bp目的片段,HVT FC-126株没有条带;使用针对meq基因的引物F2/R2进行PCR扩增,CVI988/Rispens株、814株均扩增出746bp目的片段,SC9-1株、HVT FC-126株均没有条带;使用针对REV-LTR片段设计的引物F3/R3进行PCR扩增,SC9-1株扩增出512bp目的片段,CVI988/Rispens株、814株、HVT FC-126株均没有条带。同时,使用针对meq基因的探针进行斑点杂交,CVI988/Rispens株、814株均显示阳性结果,SC9-1株、HVT FC-126株均为阴性;使用针对REV-LTR的探针进行斑点杂交,SC9-1株显示阳性结果,CVI988/Rispens株、814株、HVT FC-126株均为阴性。因此,利用本研究设计的特异性PCR引物以及探针,通过PCR扩增和斑点杂交方法可有效区分SC9-1与其他商品化MD疫苗。     

轮状病毒NASBA检测研究

轮状病毒是世界范围内流行性胃肠炎暴发的重要病因。以患者粪便为样抽提轮状病毒RNA,在轮状病毒VP7高保守基因区段上设计引物,运用核酸序列依赖的扩增(NASBA)法进行检测,变性琼脂糖凝胶电泳和Northern杂交验证。NASBA预期的特异性产物为392bp,并在仅以目标核酸为模板或在浓度高达1μg/μL的非特异性核酸存在的混合模板中,均有清晰的目标带产生,表现出了很高的特异性。其灵敏度和RT-PCR相同甚至更高,可检测到50pg的核酸,并且当反应时间为3h时检测灵敏度最高。NASBA法扩增效率高、灵敏度高、快速易操作,尤其适用在基层单位推广应用。     

广东地区两种兰花病毒病害的分子鉴定及检测

根据已报道的建兰花叶病毒(CyMV)和齿兰环斑病毒(ORSV)基因组核苷酸序列,在其cp基因上下游设计PCR引物。CyMV预计扩增产物784bp,ORSV预计扩增产物604bp。以采集自广东省顺德的墨兰和文心兰表现病毒病症状的病株叶组织总RNA为模板,进行RT—PCR扩增。对预期大小的5个扩增产物进行克隆和测序,结果表明,来源于不同兰种或同一兰种不同兰场的病样CyMV引物扩增产物核苷酸序列存在少量差异,但均与世界各地的CyMV分离物cp基因高度同源;而来源于不同兰种的病样ORSV引物扩增产物核苷酸序列完全相同,与世界各地的ORSV分离物cp基因高度同源。因此可将侵染广东兰花的两种病毒鉴定为CyMV和ORSV。混合上述两种病毒的PCR引物,采用双重RT—PCR扩增,对采自广东顺德23个兰场共153份样品进行病毒检测,76份(49．7％)检出CyMV,52份(34．0％)检出ORSV,2份(1．3％)同时检出CyMV和ORSV。     

大熊猫轮状病毒PCR检测方法的建立及应用

轮状病毒是威胁大熊猫健康的主要病原微生物之一。为了对大熊猫轮状病毒进行快速、方便且准确地检测,研发适合于基层饲养单位和保护区的检测方法是非常有必要的。本研究通过合成大熊猫轮状病毒Vp7基因序列,构建了PUC-VP7的重组质粒,并将其作为阳性对照对大熊猫轮状病毒样本进行PCR检测和分析。结果表明,在进行PCR扩增分析时,该质粒和病毒cDNA二者均在340 bp处出现了特异性条带。此外,对收集到的45份大熊猫粪便样本进行轮状病毒抗原检测时,其中2份样品在340 bp处出现条带,该基因片段与大熊猫轮状病毒CH-1株的相似性为99.89%。本研究构建的PUC-VP7质粒不但可以作为大熊猫轮状病毒PCR检测中的阳性质控品,而且还能有效地促进该PCR病毒检测技术在基层饲养单位和保护区的推广和应用。     

RT—PCR方法扩增白蛉热病毒M片段的研究

为建立扩增未知序列白蛉热病毒M片段的RT—PCR方法,本研究选取7个血清组成员和8个未分组血清型,共42株白蛉热病毒为RT—PCR检测对象。通过排列GenBank中已知的4型白蛉热病毒M片段氨基酸序列,选择保守区设计引物。根据保守区各已知病毒的cDNA特异序列合成寡核苷酸,将相同区的寡核苷酸等量混合成为“鸡尾酒”引物,用于RT—PCR。扩增产物经电泳检测,纯化后直接测序。引物对Ph—M—2FM和Ph—M—3RM扩增产物长度约为600bp,从42株病毒中扩增出34株,阳性率为81．0％。另一引物对Ph—M—2FM和Ph—M—4R2M扩增产物长度约为1400bp,扩增出22株病毒,阳性率为52．3％。测出序列经BLAST检索,与GenBank中已知白蛉热病毒同源。本研究首次成功地应用RT—PCR扩增不同血清型未知序列白蛉热病毒的部分M片段,并测出扩增产物序列,为白蛉热病毒属成员的基因鉴定和种系发生关系分析提供了实验手段,并将有助于白蛉热病毒感染的基因诊断。     

转基因大豆GTS40-3-2转化事件特异性PCR检测

GTS40-3-2是抗草甘膦转基因大豆,为建立GTS40-3-2大豆转化体特异性PCR检测方法,本研究以GTS40-3-2标准品为实验材料,根据已公布转基因大豆GTS40-3-2基因与大豆基因组连接序列信息,利用Primer5.0软件设计了5对品系特异性引物,对每对引物进行了退火温度、特异性及扩增效率的PCR检测,结果显示,5对特异性引物均能够从GTS40-3-2中扩增出大小约279bp、238bp、470bp、490bp和257bp的预期产物,可用于特异性检测转基因大豆GTS40-3-2转化事件。以转基因大豆GTS40-3-2含量为5%、2%、1%、0.5%和0.1%的标准品进行PCR灵敏度检测,结果表明5对引物的检测灵敏度均能达到0.1%。通过荧光定量PCR对5对特异性引物的Ct值与溶解曲线比较,最后选择出RRS2引物对为转基因大豆GTS40-3-2品系特异性检测的最适引物。本文结果将为我国未来转基因生物产品成分检测提供科学合理的实验参考。     

逆转录-聚合酶链反应检测鼠肝炎病毒方法的建立

建立特异、灵敏的逆转录聚合酶链反应（RT－PCR）技术,结合碱性磷酸酶标记的探针杂交检测鼠肝炎病毒（MHV）,采用MHV－3,MHV－A59病毒株感染DBT细胞,37℃培养,待细胞出现病变时收集提取病毒RNA。依据MHV基因序列设计一对高度保守区特异性引物,进行RT－PCR扩增,结果可见147bp的鼠肝炎病毒产物特异扩增带。敏感性实验检测到10pg的鼠肝炎病毒RNA,同时用ELISA方法对照。结果提示应用RT—PCR技术结合探针杂交检测鼠肝炎病毒。具有简便、快速、灵敏等优势。本研究在国内尚未见报道。     

多重RT-PCR同时检测鉴别三种对虾病毒的研究与应用

根据基因库中对虾桃拉综合征病毒（TSV）、白斑综合征病毒（WSSV）、传染性皮下和造血器官坏死病毒（IHHNV）的基因序列,分别设计了三对特异性引物,通过对多重RT—PCR扩增条件的优化,研究建立了可同时检测鉴别TSV、WSSV和IHHNV的多重RT—PCR。该技术对同一样品中的TSV RNA、WSSV DNA和IHHNV DNA模板进行扩增,结果均同时得到3条大小与实验设计相符的231bp（TSV）、593bp（WSSV）和356bp（IHHNV）的特异性多重RT—PCR扩增带,对其它对虾病原核酸的扩增结果为阴性。敏感性试验结果表明,该技术最低能检测到10pgTSV RNA、100pg WSSV DNA和100pg IHHNV DNA。临床检测试验结果表明,该技术对TSV、WSSV和I—HHNV的检出率明显高于传统的临床症状观察和组织病理学检查,提示该技术适用于这三种病毒的临床快速检测和鉴别诊断。     

小菜蛾酯酶基因的克隆

根据已知的酯酶基因的保守性氨基酸序列设计简并引物 ,通过逆转录 -聚合酶链反应 (RT PCR)扩增出小菜蛾PlutellaxylostellaL .酯酶基因片段 ,然后按照测序结果再设计 1对特异引物 ,利用PCR方法 ,筛选小菜蛾的cDNA文库。将RT PCR获得的 1条长度为 3 3 0bp的目的条带 ,亚克隆入T -载体 ,测序结果表明共得到了 1 0个不同的酯酶基因片段。利用特异引物对小菜蛾的cDNA文库进行初筛 ,显示文库中存在有小菜蛾的酯酶基因。     

实验感染的三带喙库蚊和来亨鸡体内西尼罗病毒的分离与鉴定

采用C6/36细胞培养分离活病毒、间接免疫荧光染色检测病毒抗原、RT-PCR扩增病毒基因片段和PCR产物测序等方法,对实验感染的三带喙库蚊Culex tritaeniorhynchus和来亨鸡血液样本中的西尼罗病毒进行分离和鉴定。结果表明,接种实验感染蚊虫研磨液和来亨鸡血液样本的C6/36细胞出现细胞融合、空泡形成的病变效应; 用西尼罗病毒抗血清进行间接免疫荧光染色,感染病毒的细胞呈现黄绿色荧光,为阳性反应; 采用3对不同引物的RT- PCR体系扩增分别出现预期的408 bp、498 bp和559 bp的基因片段,序列测定证实扩增序列与实验所用毒株相应的基因序列基本相同。从而证实实验感染三带喙库蚊和来亨鸡体血液内的西尼罗病毒与实验感染所用的西尼罗病毒Chin-01株一致。     

热带小奥德蘑的序列特异性扩增标记开发

[目的]为了快速、准确地对热带小奥德蘑JZB2115055进行鉴定和保护,该研究开发了该菌的序列特异性扩增(SCAR)标记。[方法]采用26个ISSR引物对19个小奥德蘑属菌株进行PCR扩增,以引物P826扩增时,JZB2115055在700 bp～1 000 bp之间出现了一条特异条带,获得此条带的DNA序列并设计特异性引物对P826-1-2XF/R。[结果]以19个小奥德蘑DNA为模板,P826-1-2XF/R为引物在JZB2115055中能够特异性地扩增出2条条带,长度分别为431 bp、537 bp;该引物在2～19号菌株中扩增不出目的条带或者扩增条带在2 000～5 000 bp之间。[结论]开发了热带小奥德蘑JZB2115055的SCAR标记,能够在该菌中特异性地扩增出431 bp和537 bp大小的条带,而其他18株菌株不能扩增出特异条带,此标记能够快速、准确地进行该菌的鉴定和保护。     

检测A组轮状病毒的微阵列技术初探

采用荧光染料TAMRA标记上游引物,经RT semi nestedPCR扩增A组轮状病毒的保守区域,并将扩增产物与自行研制的玻片微阵列进行杂交。经杂交信号扫描分析,可简便快速地检出A组轮状病毒,并能达到高灵敏性,为下步进入临床打下了基础。     

人A组轮状病毒地方株外壳蛋白VP4的原核表达

目的：制备轮状病毒外壳蛋白VP4。方法：从病人粪便中分离的毒株中提取病毒dsRNA为模板,经RT—PCR获得编码VP4截短蛋白基因片段cDNA(1—1253bp),将VP4基因片段克隆于pGEX-4T-2融合表达载体中,经dot印迹筛出阳性重组子,重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)。工程菌经IPTG诱导,11％聚丙烯酰胺凝胶电泳。结果：Western印迹分析表明,工程菌能正确表达VP4蛋白片段,且具有良好的抗原性。结论：为研制轮状病毒重组疫苗、亚单组疫苗、转基因植物口服疫苗做了前期准备。     

沙门菌、大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的多重PCR检测

根据沙门菌invA基因、大肠杆菌phoA基因和金黄色葡萄球菌nuc基因序列,设计3对特异性引物进行多重PCR并对反应条件进行优化。结果表明3对引物能特异地扩增出284bp、622bp、484bp的目的条带;最佳反应条件为沙门菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌的引物浓度分别为40nmol／L、40nmol／L、80nmol／L,Mg^2＋浓度2．4mmol／L,dNTP浓度2001μmol／L,Taq DNA聚合酶1.5u,退火温度55．0℃-57．4℃之间;在此条件下多重PCR同时检测DNA的敏感性分别是10．2pg、10．2pg、102．0pg,检测时间4h。建立的多重PCR是一种敏感、特异、准确、快速的方法,为同时检测食品中沙门菌、大肠杆菌和金黄色葡萄球菌奠定了基础。     

一种通用的基于NSP5基因的A组轮状病毒荧光定量RT-PCR检测方法的建立

建立一种通用的检测不同物种来源A组轮状病毒的逆转录实时荧光定量PCR方法(RT-qPCR)。根据轮状病毒保守的NSP5基因的保守序列设计引物和探针,建立并优化RT-qPCR检测体系;同时通过9份轮状病毒毒株和96份临床标本的检测对该方法和目前常用的基于NSP3基因的2种RT-qPCR方法进行灵敏度和检出率的比较。新建立的RT-qPCR方法特异性高,重复性好;与基于NSP3基因的方法相比:(1)在临床标本检测中,检出率无差异;(2)9株培养病毒检测中,NSP5体系可全部检出,两个NSP3对照体系NSP3-1和NSP3-2的检出率分别为78.78%(7/9)和88.89%(8/9);(3)NSP5体系与对照NSP3-1体系灵敏度相当,检测下限比NSP3-2体系低100倍。本研究建立的基于NSP5的荧光定量PCR体系灵敏度高,可检测毒株范围广,为检测不同物种来源的A组轮状病毒提供一种新的选择。     

SA11株轮状病毒VP7基因的克隆及表达

采用RT PCR方法 ,从提取的SA1 1株轮状病毒总RNA中扩增出VP7基因片段 ,进行鉴定后 ,将该片段克隆于真核表达载体pEF1 HisC dhfr,构建成重组质粒pEF1 HisC dhfr VP7,然后用质脂体法转染COS 7细胞 ,进行真核系统的表达 .获得了长 981bp的PCR片段 ,序列分析结果与已知VP7序列相同 .表达后经细胞超声破碎 ,Westernblot检测表达产物 ,在相对分子质量 38× 1 0 3 处有表达条带 ,表达蛋白主要存在于上清中 .因此 ,获得了VP7基因 ,并在COS 7细胞中获得了表达 ,表达蛋白质免疫Balb c小鼠 ,获得了具有特异性结合活性的抗体     

小麦淀粉粒束缚淀粉合成酶基因多态性的分子鉴定

运用6％的SDS-PAGE对14个小麦品种成熟籽粒Wx蛋白的多态性进行了鉴定,结果表明,14个小麦品种根据其Wx蛋白的缺失情况可分为6种组合类型。另外,根据Wx-A1、Wx-D1和Wx-D1这3个位点基因序列和变异情况分别设计了PCR引物,扩增结果表明：Wx-A1位点突变材料扩增产物为327bp,正常材料中扩增不到该特异带;在Wx-B1位点扩增出187bp目标带,突变材料没有该扩增产物;在Wx-D1位点扩增出约700bp目标带,突变材料没有该特异带。与前人的研究结果相比,Wx-B1引物在3个位点的扩增产物长度更短,差异更大,在2％琼脂糖胶上即可清楚分开,缩短了鉴定时间,提高了效率,为大规模筛选优质面条小麦品种提供了可能。     

葡萄病毒B的RT-PCR检测技术研究

旨在建立适合葡萄的葡萄病毒B的RT-PCR检测技术。从感染葡萄病毒B的葡萄皮层中提取总RNA,以其为模板合成cDNA第一链,并利用两对引物分别进行PCR扩增;回收PCR特异扩增产物,与pUCm-T载体连接,并进行转化、重组克隆的筛选、重组质粒的酶切鉴定和序列测定。结果显示,两对引物均能获得与预期片段大小一致长约460 bp和470 bp的扩增产物扩增片段序列与已报道GVB序列(序列号:X75448)的核苷酸同源性均为81%,经反复多次试验证实,利用总RNA为模板合成cDNA并进行PCR扩增检测GVB是准确、可靠的。     

3种鲤科鱼β珠蛋白基因的比较研究

根据 β珠蛋白的N末端和C末端氨基酸序列的保守性设计 2 0bp长的简并引物 ,用RT PCR方法扩增并克隆了鲤、草鱼、鲫的 β珠蛋白基因cDNA。结果显示克隆 3种鱼的 β珠蛋白基因cDNA全长为 4 4 1bp。对它们所编码的氨基酸序列的比较可以看出虽然它们都属于鲤科但氨基酸的组成却有较大的差异。根据所克隆的cDNA分别设计特异引物用PCR方法克隆了 3种鱼的基因组DNA全长 ;从起始密码子到终止密码子的长度分别为鲤 6 6 7bp、草鱼6 2 9bp、鲫 6 6 7bp。 3种鱼中均含有 3个外显子和 2个内含子且内含子的插入位置相同。内含子的碱基序列差异很大。鲫与鲤内含子 1和 2的长度完全相同 ,而与草鱼的内含子长度则相差较大。