hTERT基因片段的克隆、表达和抗hTERT抗体用于端粒酶及hTERT检测的研究

端粒酶是一种重要的肿瘤生物学标志,其活性在生殖细胞、绝大多数肿瘤细胞和体外培养的永生细胞可以测知,但在大多数体细胞中不易测出。人端粒酶由两部分组成,包括hTERC和hTERT,hTERC在正常细胞和肿瘤细胞中均有表达,而hTERT的表达似乎受到严格的调控且和端粒酶活性一致。为了检测肿瘤细胞中端粒酶及hTERT的表达,我们制备了抗hTERT蛋白的特异性多克隆抗体。首先用RT-PCR方法克隆了hTERTcDNA的一个片段,将其连接到GST融合表达载体pGEX-5X-3后在大肠杆菌中融合表达。将纯化的融合蛋白抗原免疫动物,制备抗hTERT蛋白的多克隆抗体。不同的细胞抽提物用该抗体进行了Westernblot分析,结果表明该抗体可特异识别端粒酶阳性细胞株中的hTERT及端粒酶,为端粒酶及hTERT的检测初步提供了一个简单有效的检测手段。     

hTERT cDNA片段的克隆及其单克隆抗体与喉癌的发病机制

端粒酶的激活及其调控机制至今不仍不清楚。为研究喉癌发生中端粒酶表达规律及激活的可能机制,我们克隆了hTERT cDNA片段并制备了抗hTERT单克隆抗体。应用此抗体对喉癌组织进行了免疫组化检测,发现喉癌分化程度降低与癌组织中hTERT阳性细胞率增高有关;而c-Myc表达与hTERT表达呈明显正相关,提示c-Myc可能对喉癌发生过程中端粒酶的激活起着重要作用。这些研究表明,喉癌的发生可能是由于c-Myc的过度表达使端粒酶表达上调,从而使喉鳞状上皮细胞达到永生化,这一机制不仅存在于喉癌发生的早期,而且贯穿于喉癌的发展过程。     

特异性人端粒酶催化亚单位基因小干扰RNA对HeLa细胞生长的抑制作用

通过设计并化学合成人端粒酶催化亚单位(hTERT)特异性siRNA,观察其对hTERT表达水平及肿瘤细胞生长的影响。将hTERT-siRNA以脂质体法转染入HeLa细胞,应用RT-PCR、实时定量TRAP、Western印迹、软琼脂克隆形成实验、荷瘤裸鼠肿瘤内注射等方法检测细胞内hTERTmRNA、蛋白质表达水平及对肿瘤细胞生长的影响。RT-PCR、实时定量TRAP和Western印迹的结果显示hTERT-siRNA明显降低了HeLa细胞内hTERT的mRNA及蛋白质表达水平并伴随有端粒酶活性的下降。克隆形成实验表明hTERT-siRNA组的体外肿瘤形成能力受到抑制。荷瘤裸鼠肿瘤内注射hTERT-siRNA使肿瘤平均体积显著小于对照组。TUNEL凋亡检测表明hTERT-siRNA转染组的凋亡率明显高于对照组。研究表明hTERT特异性siRNA可以明显抑制HeLa细胞内hTERT的表达水平,对其生长有明显抑制作用,是一种有前途的肿瘤治疗新方法。     

E-box元件修饰端粒酶核心启动子序列及体外转录活性分析

人类端粒酶启动子(hTERT启动子)在肿瘤基因治疗中的有效性已经得到了证实. 然而,hTERT启动子有限的肿瘤靶向转录活性困扰着它的临床应用.早期研究已经揭示,核心hTERT启动子上的-34位E-box元件与该启动子的肿瘤靶向转录活性有关.为进一步探索核心hTERT启动子序列3′端富余E-box元件是否能提高启动子的肿瘤靶向转录能力,用化学合成方法在野生型hTERT(WT-hTERT)核心启动子片段(编码蛋白起始子ATG上游-268 bp～-10 bp)的3′端接入3个E-box序列, 构建成修饰型hTERT(Mod-hTERT)启动子. 然后,分别用WT-hTERT和Mod-hTERT启动子去调控增强型绿色荧光蛋白(EGFP)及荧光素酶报告基因在293FT、HepGⅡ、SGC7901、U2OS、以及原代培养人成纤维细胞(PHF)中表达. 结果表明, 在Mod-hTERT启动子的各实验组细胞中,能够在端粒酶阳性的293FT、HepGⅡ及 SGC7901细胞组中观测到EGFP的表达,而在端粒酶阴性的U2OS及PHF细胞组中没有观测到EGFP的表达;在端粒酶阳性的293FT、HepGⅡ和SGC7901细胞株中,Mod-hTERT启动子调控下的荧光素酶活性要高于WT-hTERT启动子组（P＜0.01）; 而在端粒酶阴性的U2OS细胞组中,Mod-hTERT启动子调控下的荧光素酶活性则低于WT-hTERT启动子组（P＜0.01); 在PHF细胞组中,Mod-hTERT启动子组与WT-hTERT启动子组的荧光素酶活性差异不显著(P＞0.05).研究提示,在3′端增加E-box元件可以提高核心hTERT启动子序列的肿瘤靶向转录活性.     

端粒酶在干细胞研究中的主要进展

端粒酶的表达对于维持干细胞自我更新能力和复制潜能具有重要意义。影响干细胞中端粒酶表达的因素包括生长因子、基因调控及其它物理化学因素。利用人端粒酶催化亚单位 (hTERT)基因修饰干细胞 ,可有效地体外长期扩增并维持某些干 /祖细胞的多向分化潜能特性 ;通过异位表达hTERT使干细胞永生化 ,可为干细胞基础研究及临床应用提供药物筛选模型或细胞模型     

外源性端粒酶基因对人脐静脉内皮细胞的影响

为了观察外源性端粒酶逆转录酶基因(hTERT)在人脐静脉血管内皮细胞(HUVEC)的表达及对细胞功能和生长的影响。采用逆转录病毒载体转导的方法,将hTERT基因转入HUVEC,检测基因转导后内皮细胞端粒酶的活性和生物学特性。结果发现hTERT转导后细胞端粒酶表达阳性,未转导的亲代细胞为阴性;转导细胞的体外生存时间延长但未永生化,而内皮细胞黏附分子表达的功能未受影响。     

端粒酶抑制剂

端粒酶被激活被认为是发生恶性肿瘤的主要因素,其激活及表达程度与肿瘤的发生和转移密切相关,因此端粒酶是肿瘤靶向治疗的理想靶点。研究和开发端粒酶抑制剂将为肿瘤治疗揭开新的篇章。端粒酶全酶复合物有很多可以做抑制剂的靶点,包括hTR(端粒酶RNA成分)、hTERT(端粒酶逆转录催化亚单位)、引物锚定位点、全酶的组装和那些招募端粒酶到端粒的因子。     

人端粒酶催化亚基基因启动子调控的肿瘤细胞特异表达载体

为获得端粒酶阳性肿瘤细胞特异表达载体用于癌症的基因治疗 ,克隆并构建了人端粒酶催化亚基 (hTERT)基因启动子调控的萤光素酶报告载体 .用脂质体转染法将其分别转染肿瘤细胞和正常细胞 ,检测其在肿瘤细胞和正常细胞中的转录活性 .hTERT启动子在所检测的 4种端粒酶阳性的肿瘤细胞中具有明显的转录活性 ,平均为阳性对照的 4 4 3% ;而在端粒酶阴性的正常人胚肺成纤维细胞中则无明显的转录活性 .提示hTRET启动子的转录活性在端粒酶阳性的肿瘤细胞中明显上调 ,由hTERT启动子构建的载体可能是一种新颖和有前景的肿瘤细胞特异性表达的基因治疗载体     

酪氨酸磷酸酶Z1型受体、环氧合酶-2、人端粒酶逆转录酶在口腔黏膜下纤维性变癌变中的表达及相关性研究

摘要 目的：探究酪氨酸磷酸酶Z1型受体（PTPRZ1）、环氧合酶-2（COX-2）、人端粒酶逆转录酶（hTERT）在口腔黏膜下纤维性变（oral submucosal fibrosis, OSF）癌变中的表达及相关性。方法：采集2018年6月-2019年6月于我院接受治疗的OSF癌变患者OSF癌变组织30例,作为本文研究OSF癌变组;采集2018年6月-2019年6月于我院接受治疗的OSF患者OSF组织30例,作为本文研究OSF组;同时选取无槟榔、烟酒嗜好、正常口腔粘膜组织30例作为本文研究正常组。Western blot法检测PTPRZ1、hTERT相对表达量,酶联免疫吸附法检测COX-2表达,对待测标本进行免疫组化染色,并对PTPRZ1、COX-2、hTERT在OSF癌变中的相关性进行分析。结果：OSF组PTPRZ1、COX-2、hTERT相对表达量均高于正常组（P＜0.05）;OSF癌变组PTPRZ1、COX-2、hTERT相对表达量均高于正常组、OSF组（P＜0.05）。低分化OSF癌变组织中PTPRZ1、COX-2、hTERT相对表达量均高于高分化、中分化OSF癌变组织（P＜0.05）。Ⅳ期OSF癌变组织中PTPRZ1、COX-2、hTERT相对表达量均高于Ⅱ期、Ⅲ期OSF癌变组织（P＜0.05）。OSF癌变组织中PTPRZ1、COX-2、hTERT相对表达量呈正相关。结论：PTPRZ1、COX-2、hTERT在OSF癌变中呈异常高表达,低分化、病理分期较高的OSF癌变中PTPRZ1、COX-2、hTERT表达较高,并且PTPRZ1、COX-2、hTERT在OSF癌变中表达呈正相关。     

食管癌组织人端粒酶反转录酶、肿瘤转移相关蛋白1的表达与临床病理特征及预后的关系研究

摘要 目的： 探讨食管癌组织中人端粒酶反转录酶（hTERT）、肿瘤转移相关蛋白1（MTA1）的表达与临床病理特征及预后的关系。方法：选择2015年1月至2016年10月我院收治的食管癌患者80例,应用免疫组织化学染色法检测其癌组织和癌旁组织中hTERT、MTA1表达,分析食管癌组织中hTERT、MTA1表达与临床病理特征的关系及其表达的相关性。所有患者均随访36个月,观察不同hTERT、MTA1表达情况患者的生存情况并分析hTERT、MTA1的表达与患者预后的关系。结果：食管癌组织中hTERT、MTA1阳性率显著高于癌旁组织（P<0.05）。中低分化、TNM分期为III+IV期、有淋巴结转移者食管癌组织hTERT、MTA1阳性率分别高于高分化、TNM分期为I+II期、无淋巴结转移者（P<0.05）,不同性别、年龄、病灶最大直径者、肿瘤部位、病理类型食管癌组织hTERT、MTA1阳性率比较均无统计学差异（P>0.05）。Spearman相关分析显示,食管癌组织中hTERT表达与MTA1表达呈正相关（r=0.645,P=0.000）。随访36个月后,患者存活33例,存活率41.25%（33/80）,食管癌组织hTERT阴性、MTA1阴性患者生存率、中位生存期分别为64.29%（9/14）、23.6个月,60.87%（14/23）、24.9个月均显著优于hTERT阳性、MTA1阳性患者的36.36%（24/66）、19.2个月,33.33%（19/57）、18.5个月（P<0.05）。结论：食管癌组织中存在hTERT、MTA1异常高表达,其水平与食管癌的组织分化程度、TNM分期、淋巴结转移相关,且其表达情况与食管癌患者预后有密切关系。     

hTERT、PCNA在人宫颈癌组织中的表达

目的探讨人端粒酶逆转录酶(hTERT)、增殖细胞核抗原(PCNA)在人宫颈癌发生发展中的作用.方法采用免疫组织化学S-P法检测hTERT蛋白和PCNA在42例正常宫颈上皮、宫颈上皮肉瘤样病变(CIN)及宫颈鳞癌组织中的表达.结果随着宫颈病变加重,hTERT和PCNA表达逐渐增高;图像分析测定正常宫颈、CIN及鳞癌组织中hTERT和PCNA的平均吸光度值(A)分别为0.1426±0.0044、0.1586±0.0042、0.1747±0.0035和0.1444±0.0111、0.2286±0.0093、0.3218±0.0151,平均阳性面积(S)分别为1497.23±412.40、2658.08±250.73、3699.40±895.80和1149.76±458.41、3083.01±1407.66、5562.28±1681.51,差异均有极显著性. hTERT和PCNA的表达呈显著正相关性.结论 hTERT和PCNA的异常表达与宫颈癌的发生发展相关. hTERT和PCNA二指标可能在宫颈癌的早期筛查、诊断、治疗及预后判断中具有一定意义.     

端粒酶逆转录酶基因的结构特点及转录调控

调节端粒酶活性的最主要成份是端粒酶逆转录酶（hTERT) ,它往往在肿瘤发生的早期巳表达,故对其研究具有重大的临床意义,近年hTERT基因启动子区巳克隆鉴定,研究发现在其核心启动子区含有多个转录因子结合位点,体内外的转录因子结合在这些位点和“CPG岛”甲基化、组蛋白去乙酰化以及hTERT转录变异体的自身调节等构成了对hTERT基因转录调控的复杂系统。研究hTERT基因的转录调控将对肿瘤的发生发展、诊断和治疗提供重要的帮助。     

人端粒酶催化亚单位启动子调控自杀基因HSV-TK肿瘤细胞特异性表达载体的构建

将自杀基因形插入质粒pGL3-hTp和pGL3-Control中,取代其上的荧光素酶基因,分别构建hTERT启动子和SV40启动子调控的TK基因表达质粒pGL3-hWp-TK和pGL3-SV40-TK,酶切和PCR鉴定结果显示重组质粒pGL3-hTp-TK和pGL3-SV40-TK构建成功;用脂质体法将pGL3-hTp-TK和pGL3-SV40-TK瞬时转染端粒酶阳性的人肺腺癌细胞株A549及端粒酶阴性的人胚肺成纤维细胞株MRC-5,RT-PCR显示转染pGL3-SV40-TK的细胞A549和MRC-5均有TK mRNA表达,转染pGL3-hTp-TK的A549细胞中也有形mRNA表达,但转染pGL3-hTp-TK的MRC-5细胞无TK mRNA表达,提示hTERT启动子可以调控自杀基因HSV-TK在肺癌细胞中靶向表达,可能是肿瘤靶向性基因治疗中比较理想的转录调控元件．     

EBV LMP1通过诱导c-myc表达活化端粒酶hTERT

利用原代人胚鼻咽上皮细胞和Tet on LMP1HNE2等良好的细胞体系,采用报道基因法和Westernblot法等,分别检测Epstein Barr病毒(EBV)潜伏膜蛋白1(LMP1)诱导的c myc反式激活活性和蛋白表达水平,从LMP1诱导细胞内c myc表达的角度,探讨LMP1诱导端粒酶表达的分子机制。结果表明,LMP1促使细胞内c myc反式激活活性增强,c Myc蛋白表达量升高;导入反义LMP1表达质粒阻断LMP1表达后,c myc反式激活活性下降。将端粒酶hTERT启动子上c myc结合位点突变后,LMP1不能诱导端粒酶hTERT表达。因而认为,EB病毒LMP1通过诱导c myc表达而活化端粒酶hTERT。     

靶向端粒酶的肿瘤治疗方案相关进展

近年来,端粒作为真核细胞染色体末端的保护染色体免受核酸酶降解的特殊的DNA重复结构,成为现代生物学的研究热点。端粒与基因表达调控、细胞生长、肿瘤发生、衰老有着密切的关系。端粒维持过程中有2类重要的蛋白,即端粒相关蛋白和端粒酶。端粒酶,特别是其催化亚基hTERT,在端粒延长过程中起着不可替代的作用,与细胞永生化和癌变密切相关。近年来,靶向端粒酶的肿瘤治疗在逆转录酶抑制剂尤其是反义核酸和免疫治疗方面都取得了突破性的进展。肿瘤干细胞在肿瘤的发生发展过程中起重要作用,将很有希望成为未来靶向端粒酶的肿瘤治疗的一个重要靶标。