MBP-gldABC融合蛋白基因的原核表达载体的构建

目的：构建可高效生产甘油脱水酶的大肠杆菌工程菌,方法：将编码甘油脱水酶的三个基因gldA、gldB、gldC,分别克隆至克隆载体pMD18-T和pSIM-T中,经测序正确后,再亚克隆至表达融合蛋白的高效表达载体pMAL-c2X上,构建成表达质粒pMAL-gldABC,并转化大肠杆菌E.coli DH5α。结果：成功地将甘油脱水酶基因gldABC以同向串联方式克隆到大肠杆菌融合表达载体pMAL-c2X中,结论：得到了含gldABC基因的MBP融合蛋白表达载体,为研究甘油脱水酶基因（gldABC）的在原核表达载体中的串联表达奠定了基础。     

棘孢木霉几丁质酶tachi2 基因的原核表达及酶学性质研究

目的:实现棘孢木霉(Trichoderma asperellum)几丁质酶基因tachi2的原核高效表达,研究几丁质酶Tachi2的酶学性质.方法:利用PCR技术扩增得到几丁质酶基因tachi2,将其克隆到原核表达载体pEHISTEV中,测序后,转化大肠杆菌BL21感受态细胞,经异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导后进行Tachi2蛋白的纯化和复性.用纯化的目的蛋白Tachi2进行几丁质酶酶学性质的研究.结果:tachi2基因在重组大肠杆菌中正确表达,其主要以包涵体形式存在;重组蛋白Tachi2分子量约为44kDa,经过纯化和复性后得到的Tachi2有较高的几丁质酶活性.该酶的最适温度为40℃,最适pH值为7.0,几丁质酶在40℃以下比较稳定、pH 6～9时酶有较高活性,受Cu2和Zn2+的强烈抑制.结论:成功实现了棘孢木霉几丁质酶基因tachi2的原核高效表达,表达纯化了重组蛋白,明确了几丁质酶Tachi2的酶学性质,为该几丁质酶的进一步开发利用和深入研究奠定了基础.     

里氏木霉分泌型表达载体的构建及绿色荧光蛋白的表达

【目的】构建里氏木霉分泌型表达载体,通过表达绿色荧光蛋白论证载体的可行性并初步观察绿色荧光蛋白在里氏木霉中的分泌过程。【方法】应用PCR及分子克隆技术将里氏木霉(Trichoderma reesei)纤维二糖水解酶(CBH1)的启动子及CBH1自身信号肽、终止子和潮霉素筛选基因依次插入骨架质粒pUC19中,构建出T.reesei表达载体Ppth15。将增强型绿色荧光蛋白(eGFP)基因装载入Ppth15中,获得eGFP表达载体Ppth15-eGFP。再将Ppth15-eGFP转化进T.reesei原生质体,通过潮霉素抗性筛选、基因组PCR检测等方法鉴定,获得阳性重组转化子。【结果】用PDA培养基培养阳性转化子2-3 d后,可在菌丝顶端、隔膜及培养基中清晰地观察到大量绿色荧光。【结论】表达载体构建成功且能够用于eGFP的表达,实验为进一步研究T.reesei表达其他基因提供了有效工具,同时为T.reesei胞外蛋白分泌的研究提供了参考。     

含绿色荧光蛋白标记的木霉表达载体的构建

ACCC 30150是由本实验室筛选的一株对黄瓜枯萎病、青椒疫病等多种土传病害具有较好防治效果的长柄木霉生防菌,为研究其在蔬菜根际的定殖情况,本试验将含绿色荧光蛋白(GFP)和潮霉素B抗性的融合基因交换整合到真核表达骨架载体pNOM102上.通过酶切鉴定和测序鉴定证明目的片段与载体片段连接正确,木霉表达载体pNOM102-HygEGFP构建成功,为下一步进行生防木霉根际定殖研究奠定基础.     

一个抗真菌蛋白在绿色木霉中的分泌表达

AFP(antifungalprotein)是在丝状真菌巨大曲霉 (AspergillusgiganteusMDH18894 )中分泌的一个抗真菌蛋白。其mRNA含长度为 4 30bp的开放阅读框 ,编码 94个氨基酸的AFP前体 ,而成熟的AFP为 5 1个氨基酸的多肽。根据推测 ,在巨大曲霉中 ,AFP前体可能经两步剪切去除前导序列 (4 3个氨基酸 ) ,并最终形成具有抗真菌活性的成熟AFP ,已有报道证实 ,在另一种丝状真菌绿色木霉 (Trichodermaviride)基因组中存在一个类似AFP基因但不表达的序列 ,该序列与没有内含子的AFPcDNA序列完全一样。为了解巨大曲霉AFP基因可否在绿色木霉中表达 ,将AFP基因开放阅读框插入真菌表达载体trpC基因的启动子和终止子之间 ,并成功的转化了绿色木霉。SDS PAGE和Western印迹分析表明 ,绿色木霉转化子分泌表达了具有抗真菌活性的成熟AFP。为研究在绿色木霉中分泌表达具有重要应用价值的异源真核蛋白质打下了基础。     

茶树CsCOR1基因的原核表达

将来自茶树的冷诱导基因CsCORI与pGEX-6p-1质粒上的谷胱甘肤-S-转移酶(GST)融合,构建为融合表达载体,最终实现了在0.8 mmol/L IPTC诱导下的原核表达,获得了36 kD的可溶性融合蛋白,为对CsCOR1基因功能的进一步研究奠定基础.     

里氏木霉纤维二糖酶bg1Ⅱ基因的cDNA克隆及其在大肠杆菌中的表达

将里氏木霉总RNA反转录得到cDNA第一链，并以之为模板进行RT－PCR合成约1．4kb的纤维二糖酶基因cDNA,将所得的cDNA经测序后克隆到温度敏感型载体pJW2中，经PCR和双酶切鉴定筛出阳性重组子，温度诱导后，经酶活测定，bg1Ⅱ基因在大肠杆菌中得到了表达，酶活为0．75IU／mL。     

里氏木霉绿色荧光蛋白表达载体的构建及功能鉴定

为了后续研究里氏木霉(Trichoderma reesei)纤维素酶基因的表达与调控,利用overlap PCR及分子克隆技术构建了含有Col E1原核复制起始位点、氨苄青霉素抗性、里氏木霉的丙酮酸脱羧酶启动子、丙酮酸脱羧酶终止子、潮霉素B抗性的筛选标记并能表达增强型绿色荧光蛋白(Zs Green)的表达载体p LXT-Zs Green。将该载体转化里氏木霉QM9414原生质细胞,使用潮霉素B筛选平板得到阳性转化子,随后使用荧光显微镜在488 nm激发光下观察菌丝,并随机挑取4个转化菌株进行Western-blot验证。结果显示,里氏木霉菌丝体可发出明亮的绿色荧光,而且Western-blot验证了该载体能够在里氏木霉中有效地表达增强型绿色荧光蛋白。上述研究表明,载体p LXT-Zs Green在里氏木霉中能够稳定高效地表达外源基因,为研究里氏木霉的基因表达调控奠定了实验基础。     

高山离子芥CbMAPK3基因克隆与原核表达

促分裂原活化蛋白激酶（MAPK）在信号传导过程中发挥着重要的作用。以高山离子芥叶片为材料,利用RT-PCR法克隆到全长CbMAPK3基因cDNA,将其与大肠杆菌表达载体pET-30a连接,构建原核表达载体pET-30a-CbMAPK3,并转化大肠杆菌BL21,经IPTG诱导表达后,SDS-PAGE以及Western blot检测结果表明该基因表达了1个约46kD的蛋白,为进一步研究目的蛋白的结构和功能提供了实验基础。     

猪SsBHMT基因的原核表达及条件优化

甜菜碱高半胱氨酸甲基转移酶（BHMT）是一种甲基代谢酶,催化甜菜碱转甲基到高半胱氨酸生成甲硫氨酸。对含有pET30a-SsBHMT重组质粒的菌株进行诱导表达分析,通过对菌株、IPTG诱导浓度、时间等诱导表达条件进行优化,结果表明：该目的蛋白主要以包涵体的形式出现;经过条件优化,目的蛋白表达量在上清和沉淀中均有所增加,但仍主要以包涵体的形式存在;大肠杆菌菌株ER2566为适合目的蛋白表达的菌株;在37℃,IPTG浓度为0.4 mmol/L,诱导时间为10 h的条件下,目的蛋白表达量最多。研究结果为进一步蛋白纯化与抗体制备奠定了基础。     

烟草SKP1基因的原核表达

为获取大量高纯度的枯斑三生烟SKP1蛋白以便研究其功能和性质,以pMD18-SKP1质粒为模板, PCR扩增枯斑三生烟的SKP1基因的cDNA编码区,经酶切后构建表达载体pET23b-SKP1,转入大肠杆菌BL21(DE3)进行诱导表达,并考察不同的IPTG诱导终浓度、表达时间和表达温度对目的蛋白His-SKP1表达量的影响.SDS-PAGE分析结果表明:最佳表达条件为不加诱导剂的情况下,37℃表达8 h.     

木霉几丁质酶基因克隆及植物转化载体构建

利用PCR技术从绿色木霉LTR-2(Trichoderma virede)基因组DNA中扩增到一段序列,测序结果表明,该编码基因片段大小为 1 508 bp,其中包括一个 1 459 bp的开放阅读框,起始密码子位于 45 bp,终止密码子位于 1 501 bp,共编码氨基酸 424 个.在Genbank中进行序列比对,发现该序列同已发表的Trichoderma viride 42 ku几丁质酶氨基酸序列具有99%的同源性.将该片段同pCAMBIA1300中的35S启动子和35S-polyA终止子连接后,插入载体pCAMBIA1302多克隆位点中,构建成植物转化载体,最后将构建好的载体pCHI1302-42通过转化导入根癌农杆菌LBA4404中,为进一步构建转基因植物奠定了基础.     

甘蔗花叶病毒E株系外壳蛋白基因原核表达载体的构建与表达

目的:用原核表达的方法获取大量带6个His标记的甘蔗花叶病毒E株系(ScMV-E)外壳蛋白(CP)。方法:用带有BamHⅠ和SalⅠ酶切位点的特异引物,以带有多个基因的重组质粒pNUSCP为模板,扩增出片段长度为942bp的ScMV-E外壳蛋白基因,亚克隆到pMD18-T载体上,转化E.coliDH5α,经双酶切检测获得阳性克隆。BamHⅠ和SalⅠ双酶切阳性克隆质粒,回收目的片段ScMV-E的CP基因。把目的片段插入表达载体pET29a( ),转化E.coliBL21(DE3),测序。结果:阳性质粒pET29a-CP在E.coliBL21(DE3)中得到大量特异表达。SDS-PAGE分析表明,该蛋白的相对分子质量约36000,与预测一致。结论:以上方法可以得到带6个His标记的目的蛋白,有利于纯化并获取高纯度的ScMV-E的外壳蛋白。     

Trichoderma lentiforme ACCC30425脂肪酶基因的原核表达及其酶学性质的初步研究

基于在Trichoderma lentiforme ACCC30425全基因组序列注释的15个脂肪酶基因,进行脂肪酶基因合成与Escherichia coli BL21异源表达,获得11个产脂肪酶阳性克隆,其中酶活力最高为1.5 U/mL。经初步酶学分析,结果表明重组表达脂肪酶普遍具有耐热性、耐碱性的特征,最适温度范围为50~90℃,最适pH范围为8.5~9.5。其中,LipP最适温度为90℃,远高于目前已知脂肪酶的最适温度;LipQ最适温度为50℃,最接近洗涤工业的中温温度;其他脂肪酶最适温度为70℃或80℃,均属耐热脂肪酶。     

苯甘氨酸氨基转移酶基因hpgt的原核优化表达与酶动力学特性研究

苯甘氨酸氨基转移酶(4-Hydroxyphenylglycine aminotransferase)是假单胞菌所产生的一种能够合成D-苯甘氨酸的重要转氨酶。利用密码子优化技术,合成苯甘氨酸转移酶基因。构建原核重组质粒pCDF-hpgt,转入感受态细胞E.coli BL21(DE3),优化表达His-HpgT蛋白。利用Ni-NTA柱纯化技术获得高纯度的His-HpgT融合蛋白。分别测定融合蛋白在正反向反应中的酶活力单位及最佳的反应温度、pH值及其他动力学参数,并对该酶特性作相关的机理分析。测定结果表明,正向反应和反向反应的酶比活力分别为749mU/mg、2 257mU/mg,此酶分解苯甘氨酸的能力要强于合成苯甘氨酸;正向反应的最适温度与pH分别是35℃和8.0;由米氏方程得出该酶对苯甘氨酸的亲和力远大于谷氨酸;较低浓度的苯乙醛酸即可抑制反应的进行。     

SDH全基因的拼接及原核表达

目的:构建闭联异松树脂醇二脂脱氢酶(SDH)全基因片段与原核表达质粒载体,在大肠杆菌中进行表达.方法:将SDH3'端和5'端序列通过PCR方法拼接获得全基因后,然后将其插入到相应的原核表达质粒载体PGEX-6p-1中,形成了重组载体,并使其在大肠杆菌BL21中经IFFG诱导其表达蛋白,再用SDS-PAGE电泳检测表达结果.结果:成功的将SDH基因片段拼接成全基因,并将其构建入原核表达载体PGEX-6p-1中.测序结果表明载体构建成功,无插入和移码突变.经1.5mmol/LIPTC诱导后获得与预测大小(29.253kDa)完全一致的目的蛋白即闭联异松树脂醇二脂脱氢酶蛋白,并测得在37℃、250r/min的实验条件下的最佳诱导时间为4h.结论:成功获得了重组质粒并在大肠杆菌中较好的诱导表达得到了闭联异松树脂醇二脂脱氢酶的蛋白.     

抗HIV-1白喉免疫毒素的构建及原核表达

目的：构建重组DTA—hS120融合基因表达载体,并诱导其在大肠杆菌中表达。方法：通过PCR扩增,获得只含白喉毒素（DT）活性部位（DTA）的基因片段,将其克隆入原核表达载体pET-28a,转化大肠杆菌BL21（DE3）,IPTG诱导表达,经SDS—PAGE和Western印迹分析鉴定。结果：酶切及DNA序列测定鉴定质粒构建正确;SDS—PAGE和Western印迹分析证实,可表达出相对分子质量为54000的融合蛋白,与DTA—hS-20融合蛋白的分子量一致;经凝胶成像分析,其表达量约占菌体总蛋白的23％,表达形式主要为包涵体。结论：构建了DTA—hS-20重组表达质粒,并获得了高效表达,为进一步研究抗HIV-1治疗药物奠定了基础。