测定T_4-RNA连接酶活力的新方法及tRNA单加反应条件的研究

本文对T_4-RNA连接酶催化tRNA单加pCp的反应条件进行了探讨。tRNA单加pCp的反应在37℃进行1小时,产率一般可达80%以上,条件适当时可达定量产率。利用这个反应建立了一个T_4-RNA连接酶活力测定的新方法。单加活力单位定义为,在标准条件下,37℃,60分钟,催化tRNA单加pCp产生1 pmole产物的酶量为1单加活力单位。1单加活力单位约相当于0.58焦磷酸交换单位。用该方法进行T_4-RNA连接酶制备过程的活力测定表明,该方法适合于纯酶制剂的活力测定也适合于粗酶制剂的活力测定。     

5′-和3′-末端带双羟基的寡聚核糖核苷酸具有不寻常的聚丙烯酰胺凝胶电泳行为

为了制备核糖核酸酶P的底物——人工合成的tRNA前体,我们用五核苷四磷酸_(HO)U_PC_PC_PA~*_PC_(OH)(~*P代表~(32)P)与天然的酵母丙氨酸tRNA或其5′半分子在T_4RNA连接酶催化下反应,连接产率甚低。但观察到一个很奇特的现象:不管何种反应条件,甚至不加tRNA和不加酶的对照实验中,经聚丙烯酰胺凝胶(PAG)电泳分析反应产物时发现,在约相当于RNA序列分析“梯子”18核苷酸(nt)处总     

酵母丙氨酸转移核糖核酸中十三核苷酸(23～35)类似物(CpGpCpGpCpUpCpCpCpUpUpIpGp)的合成

本文报道了利用酶促合成的方法(RNase N_1和T_4 RNA连接酶)合成了酵母丙氨酸转移核糖核酸分子中第23位到第35位的十三核苷酸的类似物CpGpCpGpCpUpCpCpCpUpUpIp-Gp(天然酵母丙氨酸tRNA中第26位是m_2~2G)。CpGpCpG是由CpG>p和CpG经RNase N_1酶催化合成的,产率为20%。十三核苷酸CpGpCpGpCpUpCpCpCpUpUpIpGp的合成是由T_4 RNA连接酶催化CpGpCpG与pCpUpCpCpCpUpUpIpGp之间的连接反应实现的,产率为80%。产物经双向电泳层析分析为一点,用蛇毒磷酸二酯酶部分酶解后的双向图谱分析证明十三核苷酸的核苷酸排列顺序正确。     

2′—5′寡聚腺苷酸衍生物的研究——Ⅰ.以2′-5′寡聚腺苷酸作为T_4-RNA连接酶的供体和受体合成其衍生物的方法

在干扰素的功能表达中,2′-5′寡聚腺苷酸是一类重要的媒介物。本文研究了T_4-RNA连接酶的专一性及其用于2′-5′寡聚腺苷酸衍生物合成的可能性。1980年,我们曾发现2′-5′寡聚腺苷酸可以作为RNA连接酶的受体。本文对此作了进一步的研究,证实了T_4-RNA连接酶可以将pNp(N=A,G,C,U)、pCpUpC、pCpm_2~2G等供体连到2′-5′P_3A_3受体上去,生成各种相应产物。2′-5′磷酸二酯键连接的寡核苷酸能否作为T_4-RNA连接酶的供体,有人估计不大可能。本文也证实了T_4-RNA连接酶能将供体pA~(2′)p~(5′)A连接到CpUpC、UpCpCpA、Cpm′IpψpG等受体上面去。从而说明T_4-RNA连接酶也可使用2′-5′磷酸二酯键连接的寡核苷酸作为供体。应用T_4-RNA连接酶,可以合成既含有2′-5′又含有3′-5′磷酸二酯键的寡核苷酸。本工作还证明A~(2′)p~(5′)A也可以作为T_4-多核苷酸激酶的底物。     

酵母丙氨酸转移核糖核酸3′-端(36～45)CP~(m~1)IpψpGpGpGpApGpApG十核苷九磷酸片段的合成

本文报道利用T_4 RNA连接酶酶促合成酵母丙氨酸转移核糖核酸3′端(36～45)Cp~(m~1)Ip-ψpGpGpGpApGpApG十核苷九磷酸片段的工作。合成制备时,我们采用将Cp~(m~1)IpψpG、GpG、ApGpApGp三片段从5′向3′延伸的合成路线。在合成路线的探索中我们发现了一些新现象:1.在T_4 RNA连接酶催化反应中Cp~(m~1)Ipψ作为受体有局限性。2.GpG等二核苷一磷酸可以与pCp等供体分子连接。3.60℃预温育对GpG片段的标记和六核苷酸、十核苷酸连接反应提高产率有明显的作用。     

免疫亲和层析法纯化T_4RNA连接酶

本文描述了一种新的、简化了的纯化T_4RNA连接酶的方法——免疫亲和层析法.利用这种纯化方法得到的酶,经SDS-凝胶电泳,得到一条主带。将此酶与~(32)pCp及CpGpGpA(或tRNA)一起进行连接反应,未见到RNase杂酶的降解作用。用此方法制备的酶,可用于确定顺序的核酸的合成。     

酵母丙氨酸tRNA的纯化、半分子制备及其末端鉴定

本文报道了用DEAE-葡聚糖凝胶A-25柱层析纯化酵母丙氨酸tRNA的方法,纯化的tRNA,按接受丙氨酸的活力计算,其纯度达60～70%。经核糖核酸酶T_1(RNase T_1)限制性降解(tRNA与RNase T_1的比率为1毫克/15单位,0℃,4分钟),柱层析,制备了tRNA的两个半分子。用萤光标记法,[~3H]标记法,测得5′半分子的3′末端为鸟苷酸;用[~(32)P]标记法测得3′半分子的5′末端为胞苷酸。因此,RNase T_1限制性降解丙氨酸tRNA的切点在反密码子的G—C键之间。     

酵母丙氨酸tRNA的纯化、半分子制备及其末端鉴定

本文报道了用DEAE-葡聚糖凝胶A-25柱层析纯化酵母丙氨酸tRNA 的方法,纯化的tRNA,按接受丙氨酸的活力计算,其纯度达60～70%。经核糖核酸酶T_1(RNase T_1)限制性降解(tRNA 与RNase T_1的比率为1毫克/15单位,0℃,4分钟),柱层析,制备了tRNA 的两个半分子。用萤光标记法,[~3H]标记法,测得5′半分子的3′末端为鸟苷酸;用[~(32)P]标记法测得3′半分子的5′末端为胞苷酸。因此,RNase T_1限制性降解丙氨酸tRNA 的切点在反密码子的G—C 键之间。     

用于转化实验的最佳DNA连接反应

T_4DNA连接酶催化DNA分子末端的共价连接。目前已经测定了这种酶的最适反应条件,但还不清楚在克隆实验中这些条件是否也适用。比如,将DNA片段有效地连接到载体DNA上所需要的反应温度和辅助因子(即ATP)的浓度可能与定量测定该酶活性所需要的显著不同。     

多核苷酸合成的研究 Ⅷ.用T_4RNA联结酶酶促合成 GpCpmIpΨpGpGp

本文报导了酵母丙氨酸转移核糖核酸3′-半分子反密码区中GpCpm~1IppGpGp的酶促合成。作者发现,当以~(32)pGpGp(2′,3′)为供体,GpCpm~1Ip为受体,用T_4RNA 联结酶在一般条件下联结时(37℃,2小时),产率只有10%左右;但在10℃条件下,供体与受体比为1:5时,可以得到50～60%的较高产率。将~(32)pGpGp(2′,3′)与GpCpm~1lp用T_4RNA 联结酶在pH8.3,10℃下反应48小时后,再经DEAE-葡聚糖凝胶A-25柱层析分离纯化,即可得到GpCpm~1Ip~(32)pGpGp(2′,3′)。产物经双向电泳层析图谱分析,抗单酯酶测定,毗邻分析,用牛胰核糖核酸酶水解然后5′端用~(32)p 标记,再经双向图谱和核苷酸组成比例等鉴定,证明产物的纯度和排列顺序符合预定要求。     

多核苷酸合成的研究 Ⅷ.用T_4RNA联结酶酶促合成GpCpm~1ⅠpφpGpGp

本文报导了酵母丙氨酸转移核糖核酸3′-半分子反密码区中GpCpm~1IpψpGpGp的酶促合成。作者发现,当以~(32)pGpGp(2′,3′)为供体,GpCpm~1Ipψ为受体,用T_4RNA联结酶在一般条件下联结时(37℃,2小时),产率只有10%左右;但在10℃条件下,供体与受体比为1:5时,可以得到50～60%的较高产率。将~(32)pGpGp(2′,3′)与GpCpm~1Ipψ用T_4RNA联结酶在pH8.3,10℃下反应48小时后,再经DEAE-葡聚糖凝胶A-25柱层析分离纯化,即可得到GpCpm~1Ipψ~(32)pGpGp(2′,3′)。产物经双向电泳层析图谱分析,抗单酯酶测定,毗邻分析,用牛胰核糖核酸酶水解然后5′端用~(32)p标记,再经双向图谱和核苷酸组成比例等鉴定,证明产物的纯度和排列顺序符合预定要求。     

多核苷酸合成的研究——Ⅲ.CpUpCpG>p的合成

本文报道用PNPase和RNase N_1相结合的方法合成了CpUpCpG>p。选择适当的反应条件,包括1.CpUpC:GDP=1:5(克分子比),2.RNase N_1:PNPase=4:1(活力单位比),3.反应pH为7.6,4.37°反应10小时,CpUpCpG>p产率可达64%。另有18%开环产物CpUpCpGp。后者又可用氯甲酸乙酯进行环化得到60%产率的CpUpCpG>p。     

多核苷酸合成的研究 Ⅲ.CpUpCpG>p的合成

本文报道用PNPase和RNase N_1相结合的方法合成了CpUpCpG>p。选择适当的反应条件,包括1.CpUpC∶GDP=1∶5(克分子比),2.RNase N_1:PNPase=4∶1(活力单位比),3.反应pH为7.6,4.37°反应10小时,CpUpCp@>p产率可达64%。另有18%开环产物CpUpCpGp。后者又可用氯甲酸乙酯进行环化得到60%产率的CpUpCpG>p。     

酵母tRNA~(Ala)3'端第四个核苷酸在tRNA-氨酰基tRNA合成酶识别中的作用

用逐步高碘酸氧化法除去酵母tRNA~(Ala) 3'端的pACCA;最终产物用tRNA_O~(Ala)表示;用T_4 RNA连接酶使tRNA_C~(Ala)接上pAp、pGp、pCp、pCCCA和pUCCA;经磷酸单酯酶处理、聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后,测得tRNA_(CA)~(Ala)、tRNA_(CG)~(Ala)、tRNA_(CC)~(Ala)、tRNA_(CCCCA)~(Ala)和tRNA_(CUCCA)~(Ala)接受丙氨酸的活力,分别是80%、36%、12%、6%和8.8%(以tRNA~(Ala)的活力为100%计)。tRNA_(CA)~(Ala)、tRNA_(CG)~(Ala)和tRNA_(CC)~(Ala)首先被混合氨酰基tRNA合成酶制剂中的转核苷酸酶,在CTP和ATP存在的情况下,加上了CCA末端。实验证明,酵母tRNA~(Ala)3'端第四个核苷酸对于合成酶-tRNA的识别是重要的,但又非绝对必需的。     

酵母tRNA~(Ala)3’端第四个核苷酸在tRNA-氨酰基tRNA合成酶识别中的作用

用逐步高碘酸氧化法除去酵母tRNA~(Ala)3′端的pACCA;最终产物用tRNA_O~(Ala)表示;用T_4RNA连接酶使tRNA_O~(Ala)接上pAp、pGp、pCp、pCCCA和pUCCA;经磷酸单酯酶处理、聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后,测得tRNA_(OA)~(Ala)、tRNA_(CG)~(Ala)、tRNA_(CO)~(Ala)、tRNA_(CCCCA)~(Ala)和tRNA_(CUCCA)~(Ala)接受丙氨酸的活力,分别是80%、36%、12%、6%和8.8%(以tRNA~(Ala)的活力为100%计)。tRNA_(CA)~(Ala)、tRNA_(CG)~(Ala)和tRNA_(CC)~(Ala)首先被混合氨酸基tRNA合成酰制剂中的转核苷酸酶,在CTP和ATP存在的情况下,加上了CCA末端。实验证明,酵母tRNA~(Ala)3′端第四个核苷酸对于合成酶-tRNA的识别是重要的,但又非绝对必需的。     

康氏木霉TN-27饲用木聚糖酶制剂的制备及其性质研究

以康氏木霉为出发菌株 ,经亚硝基胍 (NTG)和60 Co辐射交替诱变处理 ,获得 1株木聚糖酶高产菌TN 2 7,在优化培养条件下 ,产酶活力可达 3 61 7U/g。对该酶的性质研究表明 ,其米氏常数为 4.76g/L ,最适温度 5 0℃ ,最适pH 5 .2 ,热稳定性较好 ,适合于用作饲料酶制剂。     

一株霉菌产木聚糖酶固态发酵培养基的优化及酶学性质研究

对一株霉菌B45固态发酵产木聚糖酶的培养基组分进行优化,通过单因素实验观察了不同碳源、氮源、无机盐、水料比4种因素对产木聚糖酶的影响,确定了4种最佳的单因素成分。在单因素的基础上,再通过正交实验确定了所试因素的最佳组合,并对其粗酶的酶学性质进行了研究。结果表明,在培养基组分为玉米芯与麸皮的比例=7∶3,硫酸铵为1.5%,KH2PO4为0.8%,水料比为2.1∶1时,得到的酶活力最高,产酶量可达1 079.93 U/g。其粗酶液的最适反应温度为60℃,最适反应pH为5,在pH5～pH6的范围内酶活性较稳定。但粗酶液的热稳定较差,在40℃条件下酶活力开始下降,当温度升至70℃时酶活力损失85%以上。     

人血浆LCAT活力测定方法的探讨——自身底物法

本文介绍了一种简单快速的人血浆LCAT活力测定方法。本方法以血浆本身为底物,用酶法测定游离胆固醇的降低来反映LCAT活力大小。在37℃反应60分钟,LCAT活性可达100nmole/ml/hr左右。方法测定的灵敏度较高,重复性好。     

木霉菌株T6木聚糖酶固态发酵条件和酶学性质研究*

研究了碳源和氮源、起始pH、接种量及温度等条件对一野生型木霉Trichoderma sp.T6菌株固态发酵产木聚糖酶的影响。在28℃培养4d后,酶活力可达1918IU/g干培养物。酶的最适反应温度为50℃,最适反应pH4.5。不同温度保温1h后,测定酶的半失活温度为47.7℃,酶的pH稳定性也进行了研究。     

木霉菌株T6木聚糖酶固态发酵条件和酶学性质研究

研究了碳源和氮源、起始pH、接种量及温度等条件对一野生型木霉Trichoderma sp.T6菌株固态发酵产木聚糖酶的影响。在28℃培养4d后,酶活力可达1918IU/g干培养物。酶的最适反应温度为50℃,最适反应pH4.5。不同温度保温1h后,测定酶的半失活温度为47.7℃,酶的pH稳定性也进行了研究。