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本文对T_4-RNA连接酶催化tRNA单加pCp的反应条件进行了探讨。tRNA单加pCp的反应在37℃进行1小时,产率一般可达80%以上,条件适当时可达定量产率。利用这个反应建立了一个T_4-RNA连接酶活力测定的新方法。单加活力单位定义为,在标准条件下,37℃,60分钟,催化tRNA单加pCp产生1 pmole产物的酶量为1单加活力单位。1单加活力单位约相当于0.58焦磷酸交换单位。用该方法进行T_4-RNA连接酶制备过程的活力测定表明,该方法适合于纯酶制剂的活力测定也适合于粗酶制剂的活力测定。 相似文献
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随着大量与人类疾病和药物治疗相关的单核苷酸多态性(Single-nucleotide polymorphism,SNP)的发现,出现了多种SNP分型检测的方法和技术。然而,大多数方法由于受限于检测灵敏度低或对检测设备和实验条件要求较高,不适宜于在一般实验条件下进行常规临床检测。通过建立一种基于连接酶-ELISA的SNP快速分型新方法,以非小细胞肺癌个体化治疗中,酪氨酸激酶抑制剂药物的生物标记基因—表皮生长因子受体基因(EGFR)为检测对象,对EGFR,c.2573T〉G(L858R),EGFR,c.2582T〉A(L861Q)和EGFR,c.2155 G〉T(G719C)3个SNP位点进行了突变检测。经过18~28个循环的PCR扩增,能够通过琼脂糖凝胶电泳和ELISA反应,根据电泳条带的有无和ELISA显色值清晰判断检测位点的基因型,并且能够从混合等位基因样本中检测出5%的突变型等位基因。结果表明,方法具有较高的特异性和灵敏度,适合于在常规实验条件下从不均一的样本中进行突变等位基因的检测。 相似文献
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毛细管电泳测定蛋白激酶A活力的新方法 总被引:2,自引:0,他引:2
建立了以毛细管电泳为基础的蛋白激酶A活力测定的新方法,对其他一些激酶的活力测定具有一定的通用性。此方法是基于蛋白激酶A的检测底物及其磷酸化产物容易在毛细管电泳中分开,并且可以通过在线检测进行积分定量。同时发展了连续进样技术,使能在一个电泳过程中分析十个以上的样品,大大节省分析时间和费用。 相似文献
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在干扰素的功能表达中,2′-5′寡聚腺苷酸是一类重要的媒介物。本文研究了T_4-RNA连接酶的专一性及其用于2′-5′寡聚腺苷酸衍生物合成的可能性。1980年,我们曾发现2′-5′寡聚腺苷酸可以作为RNA连接酶的受体。本文对此作了进一步的研究,证实了T_4-RNA连接酶可以将pNp(N=A,G,C,U)、pCpUpC、pCpm_2~2G等供体连到2′-5′P_3A_3受体上去,生成各种相应产物。2′-5′磷酸二酯键连接的寡核苷酸能否作为T_4-RNA连接酶的供体,有人估计不大可能。本文也证实了T_4-RNA连接酶能将供体pA~(2′)p~(5′)A连接到CpUpC、UpCpCpA、Cpm′IpψpG等受体上面去。从而说明T_4-RNA连接酶也可使用2′-5′磷酸二酯键连接的寡核苷酸作为供体。应用T_4-RNA连接酶,可以合成既含有2′-5′又含有3′-5′磷酸二酯键的寡核苷酸。本工作还证明A~(2′)p~(5′)A也可以作为T_4-多核苷酸激酶的底物。 相似文献
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反应条件下苯丙氨酸解氨酶的活力稳定性 总被引:2,自引:0,他引:2
在苯丙氨酸解氨酶(PAL)的作用下由肉桂酸和氨合成L-苯丙氨酸(L-Phe)是酶法合成该氨基酸的重要途径,国外已利用该途径进行L-苯丙氨酸的工业生产,但是该过程仍存在着转化率低和酶活力稳定性差的问题。为解决这些问题,有必要在现有基础上开展提高酶活力稳定性的研究。 相似文献
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纳豆激酶的纯化及活力测定 总被引:17,自引:0,他引:17
利用SephadexG—100s柱凝胶层析法从纳豆菌(BacillusNatto)提取液中分离纯化出具有体外活性的纳豆激酶,并通过纤维蛋白平板法测定其纤溶活力,发现其具有较强的促进纤维凝块溶解的作用。 相似文献
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从埋麻土壤中分离到放线菌298株,经初筛和复筛得到产酶活性较高的一株放线菌5-71。最适产酶条件是:果胶0.5%,葡萄糖0.5%,蛋白胨0.5%,酵母粉0.1%,K2HPO4 0.1%,KH2PO4 0.1%,NaCl0.1%,MgSO4·7H2O0.05%,pH8.0。25℃培养3天达产酶高峰。通气量对产酶影响不大。酶促反应最适条件是:pH9.6,45℃,底物果胶浓度0.75%,作用时间90mi 相似文献
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高活力碱性淀粉酶菌种的选育及培养条件研究 总被引:2,自引:0,他引:2
通过对产碱性淀粉酶芽胞杆菌B-9545进行紫外线、原生质体亚硝基胍复合诱变等反复处理,获得一株具有较高碱性淀粉酶活力的变异株PN-6。产酶活力从540u/ml提高到780u/ml,确定的最佳培养条件是:pH8-10,30℃培养48h。从变异株和出发菌株的生长及产酶曲线看到,变异株的生长速度低于出发菌株,其产酶高峰与出发菌株相比略拖后一段时间,但是酶活力要远大于出发菌株。 相似文献
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豌豆NAD激酶的提纯及活力测定 总被引:9,自引:0,他引:9
NAD激酶(ATP:NAD 2′-磷酸转移酶EC 2.7.1.23简称NADK)催化NAD磷酸化生成NADP,其活性随着酶的纯化而降低,其激活依赖于Ca~(2 )激活的钙调素(Calmod-ulin简称CaM),两者之间成剂量关系,因此,可用该酶定量CaM。活性CaM一般采用酶法[如环腺苷酸磷酸二酯酶(PDE)和红血球Ca~(2 )-ATP酶等]定量,但采用这类酶时,酶活性易受磷酯与脂 相似文献
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大肠杆菌精氨酰—tRNA合成酶高表达条件的优化及酶… 总被引:3,自引:2,他引:3
控制培养基中氨苄青霉素的用量、PH和培养时间,从含E.coli args变种ARGS381KA的E.coli TG1转化子中,得到了E.coli ArgRS变种ArgRS381KA的高表达。从2升培养液中得到15克湿菌体,粗抽液中ArgRS381KA的比活为503单位/毫克。经过两次DEAE-Sephacel柱层析,在4天时间内,可得到78毫克电泳一条的纯酶,活力回收达80%。该方法可以作为从含a 相似文献
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体外研究血管内皮细胞单层通透性的新方法 总被引:7,自引:1,他引:6
血管壁通透性增高足创伤、烧伤、感染、休克和炎症等病理过程的重要变化和特征,其机理尚不十分清楚。内皮细胞是血管壁的主要通透屏障,研究内皮单层的通透性特征及其在病理情况下的变化机制对人们了解血管壁的通透性增高机制和寻找临床防治方法有着极为重要的意义。我们建立了用体外培养的内皮细胞单层研究通透性的装置,可以较为准确地测定内皮单层对液体的滤过系数Kf,便于体外研究各种体液因子和炎症介质对血管通透性的影响及其机制,也可用于研究白细胞-内皮细胞的相互作用。 相似文献
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控制培养基中氨苄青霉素的用量、pH和培养时间,从含E.coliargy变种argr381KA的E.coliTG1转化子中,得到了E.coliArgRS变种ArgRS381KA的高表达。从2升培养液中得到15克湿菌体,粗抽液中ArgRS381KA的比活为503单位/毫克。经过两次DEAESephacel层析,在4天时间内,可得到78毫克电泳一条带的纯酶活力回收达80%。该方法可以作为从含args的E.coliTG1转化子中提纯E.coliArsRS的通用方法。 相似文献
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一种测定SOD活力的新方法——碱性二甲基亚砜-鲁米诺化学发光法 总被引:15,自引:0,他引:15
本文介绍一种测定SOD(超氧化物歧化酶)活力的新的碱性二甲基亚砜——鲁米诺化学发光法。用碱性二甲基亚砜作为产生O2-·体系,用鲁米诺作为指示O2-·的化学发光剂,观察了不同浓度的NaOH、鲁米诺、pH、碱性二甲基亚砜加入量、测定时间及心绿染料对此法的影响。测定了山羊烟雾吸入伤后SOD活力和肺淋巴SOD清除量的变化。结果证明,本法灵敏度高、特异性强、操作简便、方法稳定,可快速、重复测定粗提取生物样品的SOD活力。 相似文献
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黄连ISSR反应条件优化的研究 总被引:12,自引:2,他引:10
以黄连(味连,Coptis Chinensis Franch.)基因组DNA为模板,通过单因子、双因子实验研究了ISSR反应体系中主要成分(Mg2+、dNTP、引物、模板、Taq DNA聚合酶)以及热循环参数(退火温度、循环数、变性时间、退火时间、延伸时间)对扩增结果的影响,并找出各自的最适条件,建立了适合黄连ISSR分析的反应体系和扩增程序,即在25μL反应体系中,内含1×PCR buffer、1.5mmol·L-1 Mg2+、200μmol·L-1 dNTP、0.3 μmol·L-1引物、40 ng模板、1 U TaqDNA聚合酶。扩增程序为94℃预变性5 min,然后进行35个循环:94℃变性30 s,(据不同引物的退火温度)复性1 min,72℃延伸1.5 min,循环结束后72℃延伸7 min,-4℃保存。这一优化系统的建立为今后利用ISSR标记技术进行黄连鉴定及种质遗传多样性分析提供了一个标准化程序。 相似文献
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通过正交旋转试验,探讨了反应温度(X1)、pH值(X2)、反应时间(X3)、底物浓度(X4)、DNS用量(X5)5个测定条件对木聚糖酶活力(Y)测定结果的影响,并构建了测定条件对木聚糖酶活力影响的数学模型:Y=10.2950+1.6563X1-0.0704X2+0.3179X3+1.7004X4-1.3413X5+0.0669X1X2+0.2094X1X3+0.7631X1X4+0.3301X1X5+0.1256X2X3-0.0881X2X4+0.1544X2X5+0.2596X3X4+0.1469X3X5-0.2594X4X5-0.4121X1^2-0.1258X2^2-0.2233X3^2-0.8358X1^2+0.5217X3^2.实验结果表明:反应温度、底物浓度和DNS用量对木聚糖酶活力测定结果有极显著影响. 相似文献