嗜杀酵母的生物学功能及其应用

嗜杀酵母能够分泌毒素蛋白,杀死敏感酵母。嗜杀酵母对自身分泌的嗜杀毒素具有免疫力。嗜杀酵母的嗜杀特性与两种双链线状RNA(dsRNA)有关,即编码产生毒素蛋白的M-dsRNA和编码自身和M-dsRNA外壳蛋白的L-dsRNA。嗜杀毒素破坏细胞跨膜化学质子梯度,造成ATP和钾离子泄漏,导致细胞死亡。应用嗜杀酵母可避免野生型酵母污染,净化发酵体系,改善发酵产物品质;嗜杀毒素也可作为抵制病原酵母和类酵母微生物的抗真菌剂。     

酿酒酵母两种不同嗜杀菌株的比较研究

以酿酒酵母两种不同类型的嗜杀菌株SK4（K1型）和ERRI（K2型）为材料,分析了不同嗜杀酵母的嗜杀特性,两株嗜杀酵母具有相互杀死作用,其嗜杀活性与菌体生长有关。SK4和ERRI的嗜杀质粒的比较表明：M1－dsRNA质粒和M2-dsRNA质粒分子量分别为1．7kb和1．5kb,两株菌的L－dsRNA质粒均为4．0kb。用高温和紫外线处理嗜杀酵母,嗜杀活性随之消失,消除菌中的M－dsRNA质粒也相应消失,嗜杀活性的消除率随菌株和消除剂的不同而变化。实验证明两株菌产生的毒素蛋白的最适嗜杀作用条件不同,最适pH和温度分别为4．8、16℃和4．0、22℃,但两种毒素蛋白均对在对数生长期的敏感细胞作用最显著。     

以酵母嗜杀系统为基础的抗病毒药物筛选模型的建立

根据嗜杀酵母T158c/S14a中L-A病毒-1移码效率改变影响M1病毒的存活,导致K1毒素减少,在低pH的美蓝平板上用杯碟法通过抑菌圈的大小检测酵母K1毒素的嗜杀活性,建立了一个以酵母嗜杀系统为基础的抗病毒药物筛选模型。研究了杯碟法检测酵母毒素嗜杀活性的各种条件。对不同pH和温度下酵母的嗜杀活性进行了研究,确定了模型用于筛选的最适pH范围为4.3~4.7,最适温度范围为20~22℃。运用该模型研究了几种中药对嗜杀活性的抑制作用,发现了金银花和升麻具有一定的抗病毒作用。该模型为抗病毒药物的高通量初筛奠定了基础。     

嗜杀酵母KillerYeast的杀伤性质和酵母的病毒假说

嗜杀酵母Killer Yeasf,杀伤酵母或逆戟酵母,是指能释放毒素杀死其同类的酵母。具有杀伤性质的真菌有酵母属(Sac-charomyces),黑粉菌属(Usfflago),吲酵母属(Torulopsfs),德巴里酵母属(Debaromyces),汉逊酵母属(Han-     

一种检测酵母嗜杀活性的简便方法及其应用

本文以嗜杀酵母ＥＲＲＩ为材料建立了一种双层平板单菌落嗜杀活性检测法。此法与常规营养缺陷型筛选方法相结合,可直接筛选出具有嗜杀活性的酵母营养缺陷型菌株ＭＫ２—３：Ｋ＋Ｒ＋Ｌｅｕ－,并成功地用于检测理化因子对嗜杀质粒的消除作用。进一步采用此法在直接混合培养中做出了嗜杀酵母对敏感酵母作用的动力学曲线。结果表明,敏感酵母活菌数在混合培养的对数生长后期开始急剧下降。     

酿酒酵母两种不同嗜杀菌的比较研究

以酿酒酵母两种不同类型的嗜杀菌株ＳＫ４（Ｋ１型）和ＥＲＲ１（Ｋ２型）为材料,分析了不同嗜杀酵母的嗜杀特性,两株嗜杀酵母具有相互杀死作用,其嗜杀活性与菌体生长有关。ＳＫ４和ＥＲＲ１的嗜杀质粒的比较表明：Ｍ１－ｄｓＲＮＡ质粒和Ｍ２－ｄｓＲＮＡ质粒分子量分别为１．７ｋｂ和１．５ｋｂ,两株菌的Ｌ－ｄｓＲＮＡ质粒均为４．０ｋｂ。用高温和紫外线处理嗜杀酵母,嗜杀活性随之消失,消除菌中的Ｍ－ｄｓＲＮＡ质粒也相应     

一种精子表面GPI锚定蛋白初步鉴定方法的建立

精子表面糖基磷脂酰肌醇（GPI）锚定蛋白(GPI-Aps)在精子不同阶段都发挥着关键作用.本研究介绍了嗜水气单胞菌毒素（aerolysin）作为生物探针来鉴定精子表面的GPI锚定蛋白.实验依次进行了嗜水气单胞菌培养、毒素提取纯化、多克隆抗体制备以及三明治蛋白印迹验证实验.凝胶蛋白分离实验显示,硫酸铵沉淀加Sephadex G-100层析柱纯化得到了分子质量为45 kD高纯度细菌毒素|蛋白印迹实验验证了制备的多克隆抗体的特异性|三明治蛋白印迹结果显示,嗜水气单胞菌毒素能识别出12条精子脂筏提取蛋白条带,其分子质量主要分布在15~130 kD之间|Alex488标记的免疫荧光实验显示,嗜水气单胞菌毒素识别的GPI锚定蛋白主要分布在精子头部和尾部.研究结果提示,嗜水气单胞菌毒素能够有效地识别精子表面的GPI锚定蛋白.     

蛇毒素蛋白毕赤酵母表达进展

蛇毒是许多具有独特生物活性的蛋白质与酶的混合物,在基础科学研究和临床上有重大应用价值,但是通过从蛇毒中分离获取活性组分具有局限性。巴斯德毕赤酵母表达系统是最为常用的真核表达系统之一,其真核加工、折叠、翻译后修饰等能力使得所表达的重组蛋白具有与天然蛋白近似的生物活性,因而该系统在富含二硫键或糖基化的蛇毒素蛋白表达中被广为采用。迄今为止,已经有12个属的25种蛇毒素蛋白(包括蛇毒丝氨酸蛋白酶、金属蛋白酶/去整合素、L-氨基酸氧化 酶、C-型凝集素和神经毒素、血管收缩因子、神经生长因子等家族)在毕赤酵母中获得成功表达,蛇毒富半胱氨酸蛋白、缓激肽增强肽(BPP)等至今尚未见酵母表达的报道。毕赤酵母表达蛇毒素蛋白失败的原因可能在于,有关密码子偏爱性、目的基因转录出的RNA二级结构特征、糖基化程度不均一及糖型差异、所表达毒素对酵母细胞的毒性等方面,并对解决的方法进行了讨论。     

利用细胞质导入法选育嗜杀啤酒酵母

利用细胞质导入(Cytoduction)法中的核融合缺陷细胞融合技术,在对酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)D518菌株不做任何遗传标记,将嗜杀酵母5045菌株的嗜杀质粒转移到受体菌D518中,获得了具有两亲株优良性状的融合子KD102菌株。对融合子分析表明:融合子遗传性状稳定,不仅含有供体菌5045的嗜杀质粒,而且受体菌D518的核基因被原封不动地保留下来,为异质体细胞(Heteroplasmon)。将融合子KD102菌株用于小型、中型及生产性酿酒试验,结果表明,具有与亲株D518同样的酿造特性。在发酵过程中,能抑制野生酵母污染,净化发酵体系。对于保证啤酒纯种酿造及提高成品酒的生物稳定性具有明显效果。     

利用细胞质导人法选育嗜杀啤酒酵母

利用细胞质导入(Cytoduction)法中的核融合缺陷细胞融合技术,在对酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)D518菌株不做任何遗传标记,将嗜杀酵母5045菌株的嗜杀质粒转移到受体菌D518中,获得了具有两亲株优良性状的融合子KDl02菌株。对融合于分析表明：融合子遗传性状稳定,不仅含有供体菌5045的嗜杀质粒,而且受体菌D518的核基因被原封不动地保留下来,为异质体细胞(Heteroplasmon)。将融合子KDl02菌株用于小型、中型及生产性酿酒试验。结果表明．具有与亲株D518同样的酿造特性。在发酵过程中．能抑制野生酵母污染,净化发酵体系。对于保证啤酒纯种酿造及提高成品酒的生物稳定性具有明显效果。     

破伤风毒素保护性抗原在毕氏酵母中的分泌表达

采用PCR方法．从C.Tetani 64008菌株中扩增大小为1353bp的破伤风毒素与靶细胞起结合作用的重链C端基因(Tetc),直接连接pGEM-T栽体进行测序,并以pPIC9K为表达栽体构建重组表达质粒,经线形化的重组质粒电转化毕氏酵母细胞GS1l5和KM71．甲醇诱导获得了分泌表达,表达产物存在于培养上清中,占分泌蛋白的10％,通过免疫印迹可以检测到重组表达产物,活性测定表明,重组蛋白具特异结合活性,本研究通过实现破伤风毒素保护性抗原在酵母系统中的分泌表达、研究其影响因素,为其它细菌毒素蛋白高效可溶性表达,及进一步抗原片段介导保护性免疫研究及抗毒素制备奠定了基础。     

嗜线虫致病杆菌HB310菌株杀虫蛋白的纯化及活性鉴定

嗜线虫致病杆菌Xenorhabdus nematophila HB310是从河北省土壤中筛选出的一株昆虫病原线虫体内分离纯化获得的共生菌,该菌的发酵液对多种昆虫有较高的杀虫活性。利用85％饱和度的硫酸铵盐析分别获得胞内蛋白提取物和上清液中胞外蛋白提取物,生测结果表明这两种蛋白提取物中都含有胃毒素和血腔毒素。通过制备型非变性凝胶电泳对蛋白提取物进行分离和纯化,得到了3种有杀虫活性的毒素蛋白（毒素Ⅰ、毒素Ⅱ和毒素Ⅲ）,胞内的毒素蛋白与分泌到胞外上清液中的毒素蛋白是同种蛋白。毒素Ⅰ和毒素Ⅱ对棉铃虫初孵幼虫有明显的胃毒活性,但没有血腔毒性;毒素Ⅲ对大蜡螟幼虫有很强的血腔毒性,LD₅₀为0.18 μg/头。SDS-PAGE图谱显示毒素Ⅰ和毒素Ⅱ是由多个多肽组成的复合蛋白,而毒素Ⅲ只分离出一条多肽。毒素Ⅱ在50℃处理10 min,其杀虫活性没有显著变化;70℃处理10 min对毒素Ⅲ杀虫活性没有显著影响。     

球形芽孢杆菌Mtx1蛋白和苏云金杆菌Cyt1Aa晶体蛋白的协同作用

采用常规的生物测定方法确定了纯化的球形芽孢杆菌(Bacillus sphaericus)的缺失信号肽的97kDa营养期杀蚊毒素(Mosquitocidal toxin 1,Mtx1)蛋白和苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)27.3kDa的Cyt1Aa晶体蛋白对致倦库蚊(Culex quinquefasciatus)幼虫的杀虫活性。结果表明Mtx1和Cyt1Aa不同比例的混合物对致倦库蚊的毒力比单独毒素蛋白高,经统计分析表明两毒素蛋白对目标蚊幼虫具有明显的协同作用。在LC98处理浓度下,Mtx1和Cyt1Aa按3∶1混合的混合物LT50值比单独Mtx1的提前了6.36h。表明Cyt1Aa和Mtx1对致倦库蚊具有协同毒杀作用,提高对目标蚊虫的毒力、缩短半致死时间。该结果为深入研究Mtx1和Cyt1Aa的杀蚊作用方式奠定了基础,同时为其在蚊虫防治中的应用提供了新的思路和方法。     

球形芽孢杆菌C3-41二元毒素基因在苏云金芽孢杆菌以色列亚种中的克隆和表达

球形芽孢杆菌C3-41是我国分离的一株对蚊幼虫有毒杀作用的高毒力菌株,对库蚊、按蚊幼虫的毒性高于2362菌株,Southern杂交证明C\-3\|41总DNA中35Kb HindIII片段上带有419和514kD二元毒素基因,该片段由3479个核苷酸组成,核苷酸序列同2362菌株的二元毒素基因序列完全相同。含二元毒素基因的重组质粒pCW\|1和pCW\|2能在大肠杆菌中表达产生二元毒蛋白,但表达量低,重组子杀蚊毒性低。无晶体型苏云金芽孢杆菌以色列亚种重组子在其芽孢形成中能产生以晶体形式存在的二元毒素蛋白,其全发酵液和纯化晶体蛋白的杀蚊活性与C\-3\|41相近。     

嗜热毛壳菌CT2纤维二糖水解酶Ⅰ在毕赤酵母中的高效表达

嗜热毛壳菌ChaetomiumthermophilumCT2可产生具有重要工业生产价值的纤维素酶类。RT-PCR扩增cbh1成熟蛋白的编码基因,利用基因重组的方法构建可在毕赤酵母分泌表达系统中表达纤维二糖水解酶的重组表达载体,并转化毕赤酵母得到重组子。在毕赤酵母醇氧化酶AOX1基因启动子的作用下,重组蛋白得到高效表达,小规模发酵量达1.42mg/mL。表达蛋白分泌到培养基中,分子量约80kD;以脱脂棉为底物测得酶活为21U/mL。表达蛋白在60℃稳定,70℃保温60分钟仍保持90%的酶活力,具有较高的热稳定性。     

表达乙肝病毒包膜中蛋白的嗜甲醇毕赤酵母菌株的构建

巴斯德毕赤酵母是一种很有潜力的真核表达体系。本文报告将已克隆的乙型肝炎病毒ｐｒｅＳ２－Ｓ基因亚克隆于巴斯德毕赤酵母胞内表达质粒ｐＰＩＣ３,构建重组ｐＰＩＣ３／ｐｒｅＳ２－Ｓ质粒,经酶切线性化后,将其用电转化导入酵母细胞内,经ＰＣＲ及ｄｏｔｂｌｏｔ检测,挑选出在染色体上稳定整合了乙肝病毒包膜中蛋白编码基因的嗜甲醇毕赤酵母菌株,为高效表达乙肝病毒包膜中蛋白奠定了基础     

抑菌试验用于测定T-2毒素

本文从镰刀菌中提取T-2毒素,对不同的酵母菌进行抑菌试验,结果证明红酵母属(Rho-dotorula)的三个种,即红酵母(R.glutrnis)、深红酵母(R.ruber)和小红酵母(R.minuta)对T-2毒素最敏感,被定为测毒敏感菌。将抑菌试验与家兔皮肤反应试验、豌豆发芽抑制试验进行对比,结果有部分重合,但不能相互取代。由于抑菌试验具有快速、简便、准确的优点,可做为测定T-2毒素的方法之一。     

杀线虫的苏云金芽孢杆菌蛋白

苏云金芽孢杆菌是杀虫剂蛋白的主要来源。现在Mgcogen公司已找到对线虫有毒的菌株。杀线虫蛋白作为现在用于控制蛔虫侵染家畜的氯化物的替换物可找到很好的市场。象杀虫剂蛋白一样,杀线虫蛋白也可在环境中降解而且可能比合成的杀虫剂更安全。苏云金芽孢杆菌杀虫剂蛋白对特定类型的昆虫有高度专一性。多数只对鳞翅目(蛾,蝴蝶,及其它蝎有效。抗线虫苏云金芽孢杆菌毒素不同于那些用于昆虫的杀虫剂产物,它只针对线虫而不影响昆虫。     

信息库

1　用法弗克鲁维酵母的杀伤毒素控制葡萄酒细尖酵母酵母杀伤毒素在发酵工业中 ,可用于控制野生酵母的生长。当前 ,在葡萄酒工业中用于酿造和改进葡萄酒质量的杀伤酵母属于酿酒酵母 (Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ)。但是Ｋ2型酿酒酵母的杀伤毒素对酵母的杀伤谱比较窄 ,只能杀伤敏感的酿酒酵母 ,对其他野生酵母 ,如有孢汉逊酵母 (Ｈａｎｓｅｎｉａｓｐｏｒａ) ,克勒克酵母 (Ｋｌｏｅｃｋｅｒａ) ,毕赤酵母 (Ｐｉｃｈｉａ) ,类酵母 (Ｓａｃｃｈａ ｒｏｍｙｃｏｄｅｓ)等属的菌株没有杀伤作用。研究表明 ,在葡萄表面和新鲜葡…     

球形芽孢杆菌C_3—41菌株胞外蛋白酶特性

球形芽孢杆菌能够合成具杀蚊活性的蛋白晶体,该晶体在蚊中肠碱性条件下降解产生毒性,尽管球形芽孢杆菌蛋白酶与杀蚊毒素的降解无关,但它在球形芽孢杆菌杀蚊制剂的产生中有重要意义。同时球形芽孢杆菌产生的碱性蛋白酶具有潜在的医疗价值。 我们以本实验室分离的高效杀蚊菌C_3—41菌株为材料,研究了球形芽孢杆菌蛋白酶的产生特性及其理化性质,在国内尚属首次报道。