测量细胞内吞过程中膜受体流动性的新方法

本文首次提出用ＡＢＣ（ＡｖｉｄｉｎＢｉｏｔｉｎＣｏｍｐｌｅｘ）法标记细胞膜受体,通过ＦＲＡＰ（ＦｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅＲｅｃｏｖｅｒｙＡｆｔｅｒＰｈｏｔｏｂｌｅａｃｈｉｎｇ）技术,测量细胞内吞过程中受体流动性变化的方法。实验选择巨噬细胞ＣｏｎＡ受体,比较了用ＣｏｎＡ－Ｂｉｏｔｉｎ＋Ａｖｉｄｉｎ－ＦＩＴＣ（ＡＢＣ法）和ＣｏｎＡ－ＦＩＴＣ（直接法）标记的膜表面ＣｏｎＡ受体荧光强度和内吞过程中受体的流动性测量结果。结果显示ＣｏｎＡ－Ｂｉｏｔｉｎ＋Ａｖｉｄｉｎ－ＦＩＴＣ标记的巨噬细胞膜受体的平均荧光强度比用ＣｏｎＡ－ＦＩＴＣ标记的平均荧光强度高大约３倍;ＡＢＣ法标记的受体,测量结果误差小、灵敏度高;ＣｏｎＡ刺激１５ｍｉｎ后,巨噬细胞膜表面ＣｏｎＡ受体的扩散系数和荧光恢复率较静息状态时明显下降。讨论了两种标记方法对测量结果的影响     

巨噬细胞细胞内吞过程中膜受体流动性的测量——两种标记受体…

本文首次实现了细胞内吞过程中膜受体流动性的测量。实验选择巨噬细胞膜和伴刀豆凝集素Ａ（ＣｏｎＡ）。分别用ＣｏｎＡ－Ｂｉｏｔｉｎ＋Ａｖｉｄｉｎ－ＦＩＴＣ（ＡＢＣ法）和ＣｏｎＡ－ＦＩＴＣ（直接法）两种方法标记巨哓细胞膜ＣｏｎＡ受体，比较了这两咱方法标记的巨噬细胞ＣｏｎＡ受体的荧光强度，利用ＦＲＡＰ技术。分别用两种标记方法测量了巨细胞ＣｏｎＡ受体的流动性。结果显示ＣｏｎＡ－Ｂｉｏｔｉｎ＋Ａｖｉｄｉｎ－ＦＩ     

巨噬细胞吞噬过程中膜磷脂流动性和受体流动性的关系

本文用ＦＲＡＰ（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｒｅｃｏｖｅｒｙａｆｔｅｒｐｈｏｔｏｂｌｅａｃｈｉｎｇ）技术,测量了静息状态和刀豆素Ａ刺激不同时间后巨噬细胞膜磷脂、ＣｏｎＡ受体扩散系数和荧光恢复率的变化。结果显示ＣｏｎＡ刺激后膜磷脂和ＣｏｎＡ受体的扩散系数和荧光恢复率均较静息状态的巨噬细胞明显降低,磷脂流动性的变化与ＣｏｎＡ受体流动性的变化呈正相关。提示受体介导内吞导致的膜磷脂流动性的降低,可能是由于配体与细胞膜上受体结合形成配体－受体复合体,增加了受体的负荷,使受体的流动性降低,进而使膜磷脂的流动性降低。巨噬细胞内吞过程中膜磷脂和ＣｏｎＡ受体流动性的降低,可能还与ＣｏｎＡ刺激后巨噬细胞胞浆ｐＨ值有关。     

ATP对巨噬细胞内吞和溶酶体pH的影响

ＦＩＴＣ－ｄｅｘｔｒａｎ标记培养的小鼠腹腔巨噬细胞溶酶体,ＣｏｎＡ－ＦＩＴＣ标记细胞内吞。用激光扫描共聚焦显微镜测量伴刀豆球蛋白（ＣｏｎＡ）、ＡＴＰ引起的巨噬细胞溶酶体ｐＨ动态变化和ＡＴＰ对细胞内吞ＣｏｎＡ－ＦＩＴＣ的影响。结果显示ＣｏｎＡ引起巨噬细胞溶酶体ｐＨ迅速增加,６ｍｉｎ左右达到峰值（ｐＨ５．７）;ＡＴＰ刺激３０ｍｉｎ后再加入ＣｏｎＡ,溶酶体ｐＨ无明显变化（ｐＨ４．０）;同时加入ＡＴＰ和ＣｏｎＡ,５ｍｉｎ左右溶酶体ｐＨ降到最低点（ｐＨ４．１）;ＡＴＰ对巨噬细胞内吞ＣｏｎＡ－ＦＩＴＣ有明显的抑制作用。探讨了受体介导内吞与溶酶体ｐＨ的关系。     

人食管鳞状上皮癌糖复合物表达的研究

凝集素可与其相对应的糖复合物特异性结合。在癌症形成过程中细胞表面经历着显著的变化,本文用十种生物素化凝集素即ＵＥＡ－Ｉ、ＲＣＡ－Ｉ、ＤＢＡ、ＰＳＡ、ＰＮＡ、ＢＳＬ、ＬＣＡ、ＷＧＡ、ＣｏｎＡ和ＳＢＡ作为探针,对正常食管上皮和食管鳞状上皮癌进行研究,以确定正常食管上皮和食管鳞状上皮癌中糖复合物的改变,结果发现,ＰＮＡ和ＰＳＡ在正常食管和食管鳞状上皮癌中均无反应,ＲＣＡ－Ｉ、ＤＢＡ、ＢＳＬ、ＬＣＡ、ＣｏｎＡ和ＳＢＡ受体在正常和癌组织中有着特征性变化,ＢＳＬ和ＤＢＡ在食管中无反应,ＬＣＡ、ＳＢＡ和ＲＣＡ－１正常食管和食管鳞状上皮癌中反应方式不同,ＣｏｎＡ和ＷＧＡ则在同一癌组织的不同部位都显示出不同的反应。尽管ＵＥＡ－Ｉ在正常食管和食管鳞状上皮癌均呈阳性反应,但似乎未表现出有意义的变化。上述结果提示食管癌的发生与含α－Ｄ－ＧａｌＮＡｃ（ＤＢＡ和ＳＢＡ）、β－Ｄ－Ｇａｌ／β－Ｎ－ａｃｅｔｙｌ－Ｄ－Ｇａｌａｃｔｏｓａｍｉｎｅ（ＲＣＡ－Ｉ）、α－Ｄ－Ｇｌｃ／α－Ｄ－Ｍａｎ（ＬＣＡ和ＣｏｎＡ）、［β－（１－４）－Ｄ－ＧｌｃＮＡｃ］２／ＮｅｕＮＡｃ（ＷＧＡ）和α－Ｄ－Ｇａｌ（ＢＳＬ）等的糖复合物的改变有较为密切的关系。     

伴刀豆球蛋白A与巨噬细胞膜受体结合对膜下F－actin的影响

配体与膜受体结合可启动细胞信息传递通路,激活细胞并产生生物学效应。应用共聚焦激光扫描显微术,流式细胞分光光度计,生物活性测量等技术,研究ＭＡ与巨噬细胞膜受体结合后,膜下肌动蛋白丝构筑和含量随时间变化,以及细胞热能量改变。结果是ＣｏｎＡ结合巨噬细胞膜受体后,膜下肌动蛋白多聚化加快,构筑成细胞内Ｆ－ａｃｔｉｎ立体空间网络,Ｆ－ａｃｔｉｎ含量增加具有时间相关性,细胞热能量增加。巨噬细胞内这些变化提示ＣｏｎＡ通过膜受体诱导膜下肌动蛋白多聚化和构筑过程有信息传递和激活细胞等重要作用。     

伴刀豆球蛋白A与巨噬细胞膜受体结合对膜下F－actin的影响

配体与膜受体结合可启动细胞信息传递通路,激活细胞并产生生物学效应。应用共聚焦激光扫描显微术,流式细胞分光光度计,生物活性测量等技术,研究ＭＡ与巨噬细胞膜受体结合后,膜下肌动蛋白丝构筑和含量随时间变化,以及细胞热能量改变。结果是ＣｏｎＡ结合巨噬细胞膜受体后,膜下肌动蛋白多聚化加快,构筑成细胞内Ｆ－ａｃｔｉｎ立体空间网络,Ｆ－ａｃｔｉｎ含量增加具有时间相关性,细胞热能量增加。巨噬细胞内这些变化提示ＣｏｎＡ通过膜受体诱导膜下肌动蛋白多聚化和构筑过程有信息传递和激活细胞等重要作用。     

鼠脑突触体Mg^2＋—ATP酶质子泵活性的研究

位于突触体质膜的外向型（ｅｃｔｏ）Ｍｇ＾２－ＡＴＰ酶具有水解ＡＴＰ活性,能量偶联的ＡＣ－ＭＡ荧光淬灭实验表明Ｍｇ＾２＋－ＡＴＰ酶水解ＡＴＰ时向膜内转移质子,建立跨膜质子梯度,跨膜质子梯度可以被电中性Ｋ＾＋／Ｈ＾＋离子载体Ｎｉｇｅｒｉｃｉｎ消除,利用Ｈ＾＋敏感的ＢＣＥＣＦ荧光分子测定突触的ｐＨｉ变化,结果表明水解ＡＴＰ产生的质子转移突触体ｐＨｉ下降了光分子测定突触的ｐＨｉ变化,结果表示水解ＡＴＰ产生     

用细菌/杆状病毒系统在昆虫细胞中表达GFP与HCV抗原融合蛋白

用细菌／杆状病毒（Ｂａｃ－ｔｏ－Ｂａｃ）系统在昆虫细胞中高效表达了绿色荧光蛋白（ＧＦＰ）与ＨＣＶ抗原的双功能融合蛋白,经ＥＬＩＳＡ测定和荧光显微镜观查证实,表达产物既能发射易于检测的绿色荧光,又具有ＨＣＶ的抗原活性,实现了用绿色荧光蛋白等分子标记抗原,为免疫诊断新方法的建立打下了理论基础．     

高及低转移潜能小鼠肝癌细胞株糖蛋白凝集素结合特征的研究

为探讨肿瘤转移与细胞表面的糖结构的关系,对小鼠肝癌细胞的高、低淋巴道转移株Ｈｃａ－Ｆ和Ｈｃａ－Ｐ进行了蛋白质电泳及经蛋白质印迹术后的５种凝集素（ＣｏｎＡ、ＷＧＡ、ＵＥＡ、ＳＢＡ、ＰＮＡ）结合糖蛋白谱的对比分析．结果表明：高、低转移两株细胞的ＳＤＳ－ＰＡＧＥ谱基本相同;ＣｏｎＡ特异结合糖蛋白共有５种（～７２,８０～９０,～１０４,～１５０,～２００ｋＤ）;其中较明显的差异为～７２ｋＤＣｏｎＡ特异结合糖蛋白,它在Ｈｃａ－Ｐ细胞的表达明显高于Ｈｃａ－Ｆ细胞．ＷＧＡ特异结合糖蛋白１种（～１５０ｋＤ）,在Ｈｃａ－Ｐ细胞的表达略高于Ｈｃａ－Ｆ细胞．此外,实验发现两种性质未明的蛋白质（～７９,～１３０ｋＤ）,后者在Ｈｃａ－Ｐ细胞的含量明显高于Ｈｃａ－Ｐ细胞．结果提示Ｈｃａ－Ｆ和Ｈｃａ－Ｐ细胞不同的转移表型可能与其糖蛋白的表达有一定的关联．     

小鼠精子表面Con A结合糖复合物的形成与变化

用辣根过氧化物酶标记的ＣｏｎＡ（伴刀豆素Ａ）对小鼠睾丸与附睾切片,以及对取自附睾和子宫（交配后）内的精子涂片进行了标记,旨在认识精子在发生、成熟和获能过程中表面糖复合物的形成与变化。本研究表明,睾丸内的生精细胞和支持细胞均呈ＣｏｎＡ标记阳性。附睾的输出小管和附睾管上皮细胞,ＣｏｎＡ标记呈中度至强阳性,有部位的差别。附睾头和附睾尾内精子表面的标记无明显差别,标记位置均主要在顶体区和尾部。精子在子宫内存留１．５小时后,顶体后区出现中度阳性标记,但存留３小时和６小时后,顶体和顶体后区的标记均减弱或消失。这些结果提示,（１）精子发生期即可合成ＣｏｎＡ结合糖复合物,（２）精子在附睾成熟过程中表面的ＣｏｎＡ结合糖复合物无明显变化,（３）精子获能后顶体后区出现的ＣｏｎＡ结合糖复合物可能与受精能力有关。     

PAF对肺内小动脉平滑肌细胞TXA_2，PGI_2乃Ca~（2＋）－ATPase的影响

本工作采用分离培养家兔肺内小动脉平滑肌细胞（ＰＡＳＭＣｓ），观察了外源性血小板活化因子（ｐｌａｔｅｌｅｔａｃｔｉｖａｔｉｎｇｆａｃｔｏｒ，ＰＡＦ）、ＢＮ５２０２１（ＰＡＦ受体拮抗剂）、吲哚美辛、维拉帕米对ＰＡＳＭＣｓ产生血栓素Ａ_２（ＴｘＡ_２）、前列环素（ＰＧＩ_２）及对细胞膜Ｃａ~（２＋）－ＡＴＰａｓｅ活力的影响。结果表明：（１）基础状态下ＰＡＳＭＣｓ存在花生四烯酸（ＡＡ）代谢。（２）外源性ＰＡＦ通过受体后途径激活环加氧酶促进ＡＡ代谢致ＴＸＡ_２及ＰＧＩ－２增加，ＴＸＡ_２／ＰＧＩ_２比值无明显变化。（３）外源性ＰＡＦ能直接抑制Ｃａ~（２＋）－ＡＴＰａｓｅ活力。（４）维拉帕米可逆转ＰＡＦ抑制ＰＡＳＭＣｓ膜Ｃａ~（２＋）－ＡＴＰａｓｅ活力的效应。     

Wistar大鼠和RCS大鼠视网膜色素上皮细胞和视杆细胞外节表面Con－A受体

为探讨正常大鼠与吞噬功能缺陷大鼠视网膜色素上皮（ＲＰＥ）和视杆细胞外节（ＲＯＳ）膜表面的甘露糖受体的存在和分布,本实验用胶体金标记物对１２只Ｗｉｓｔａｒ大鼠和１２只ＲＣＳ大鼠的ＲＰＥ细胞及临近其顶部的ＲＯＳ表面的Ｃｏｎ－Ａ受体进行标记．结果表明。两种大鼠ＲＰＥ细胞及ＲＯＳ膜表面均有胶体金标记物．胶体金标记物在两种ＲＰＥ细胞微绒毛上分布密度较低,而在两种大鼠ＲＯＳ膜表面分布密度则高。说明两种大鼠ＲＰＥ细胞和ＲＯＳ膜表面均有Ｃｏｎ－Ａ受体分布。在两种大鼠ＲＯＳ被ＲＰＥ细胞吞入后,均无胶体金标记物。     

应用荧光原位杂交和RFLP标记检测多小穗小麦新种质10—A中的黑麦染 …

利用ＡＰＡＧＥ,荧光原位杂交技术和ＲＦＬＰ标记,对导入黑麦（ＳｅｃａｌｅｃｅｒｅａｌｅＬ．）多小穗等性状创制的小麦新种质１０－Ａ进行了分子标记检测,ＡＰＡＧＥ分析发现,１０－Ａ与其他１ＲＳ／１ＢＬ易位系一样,含有１ＲＳ的醇溶蛋白标记位点Ｇｌｄ１Ｂ３。以黑麦基因组总ＤＮＡ作探针,用中国春（Ｔｒｉｔｉｃｕｍａｅｓｔｉｕｍｃｖ．ＣｈｉｎｅｓｅＳｐｒｉｎｇ）基因组ＤＮＡ作封阻,与１０－Ａ根尖细胞有丝分裂染     

重组人GM—CSF基因在昆虫细胞中的表达

利用苜蓿夜蛾核型多角体病毒（ＡｃＮＰＶ）带β－Ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ基因标记的非融合蛋白基因转移载体ｐＢｌｕｅＢａｃ将人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子（ｈＧＭ－ＣＳＦ）基因成功地插入病毒ＡｃＮＰＶ的基因组中．ｈＧＭ－ＣＳＦ基因在感染重组病毒的草地夜蛾（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）培养细胞Ｓｆ９中得到表达,感染后的Ｓｆ９细胞培养液能刺激人骨髓细胞在体外形成典型的集落,表达水平可达２．７×１０５５ＣＦＵ／ｍｌ。以ｈＧＭ－ＣＳＦ单抗所作的ＷｅｓｔｅｒｎＢｌｏｔｔｉｎｇ表明,表达的ｈＧＭ－ＣＳＦ对是３种糖基化程度不同的产物,分子量分别约为１５ｋｄ,１８ｋｄ和２０ｋｄ。     

脱落酸对植物线粒体膜生物物理特性的影响

采用１,６－二苯基－１,３,５－已三乙烯（ＤＰＨ）荧光偏振法和中性红法分别研究了脱落酸（ＡＢＡ）对玉米黄化芽及大豆子叶离体线粒体膜的微粘度（η）、表面电位（ψ）等生物物理特性的影响。结果表明：ＡＢＡ有降低线粒体膜的微粘度及提高线粒体膜的表面电位作用,并导致呼吸速率升高,呼吸控制和氧化磷酸化偶联下降。ＡＢＡ对线粒体膜微粘度的作用具有浓度饱和效应;ＡＢＡ对线粒体膜表面电位的提高作用,因植物不同而有差异,对玉米的作用要大于对大豆的。追踪线粒体Ａ（３５０）值的变化,还证实,ＡＢＡ提高了大豆线粒体的Ａ（３５０）值,即导致大豆线粒体的相互聚集（ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ）。     

乳腺癌ConA、LCA、PSA免疫组化研究

运用ＡＢＣ法研究５０例乳腺癌三种凝集素受体（Ｌｅｃｔｉｎ－Ｒ）的表达,并以乳腺纤维瘤和乳腺小叶增生症各１０例作为对照。结果表明：该三种凝集素受体在乳腺良、恶性病变中的表达率无显著性差异。ＣＯｎＡ－Ｒ在乳腺癌以胞浆型定位为主,在纤维腺瘤则以胞膜型多见（Ｐ＜０．０５）。ＬＣＡ－Ｒ和ＰＳＡ－Ｒ在乳腺三种病变中均以胞浆型为主。ＣｏｎＡ－Ｒ与乳腺癌分化程度具良好的相关性;ＬＣＡ－Ｒ与乳腺癌瘤体大小有关。该三种凝集素受体与ＥＲ、ＰＲ及ＣＥＡ的表达未显示密切的关联。     

氧化脂质及对大鼠心肌肌质网Ca~（2＋）－ATPase磷酸化微区运动状态的影响

用ＴＢＡ法测定了三尖杉酯碱的膜脂氧化效应;用纳秒荧光偏振技术研究了氧化膜脂对ＤＰＨ标记大鼠心肌肌质网膜脂、ＡＮＭ标记心肌肌质网Ｃａ２＋－ＡＴＰａ功能及磷酸化微区运动状态的影响。随膜脂中氧化磷脂的增加,肌质网膜脂双层的微粘度增加,磷脂分子摆动角减小：ＤＰＨ的荧光强度减弱,荧光寿命缩短。Ｃａ２＋－ＡＴＰａｓｅ的ＡＴＰ水解活性降低。ＡＮＭ标记Ｃａ２＋－ＡＴＰａｓｅ磷酸化微区的ｒ（ｔ）曲线半衰期减至６８±４ｎｓｅｃ。结果提示,膜脂中氧化磷脂的含量影响膜脂双层的流动性及Ｃａ２＋－ＡＴＰａｓｅ的ＡＴＰ水解活性和磷酸化微区的微细结构。     

诱导的HL60细胞表面β1—4半乳糖基转移酶的研究

本文用荧光标记的受体底物〔Ｇｎβ１－２Ｍα１－６（Ｇｎβ１－２Ｍα１－３）Ｍβ１－４Ｇｎβ１－４（Ｆｕｃα１－６）Ｇｎ－ＰＡ〕,结合高效液相层析（ＨＰＬＣ）建立了细胞表面β１－４半乳糖基转移酶的活性检测方法。用这种方法研究ＨＬ６０细胞,发现不同的培养时间,其细胞表面的酶变化明显,在２４小时酶活性最高,此时细胞处在分裂间期。用佛波酯（ＰＭＡ）,视黄酸（ＲＡ）等细胞诱导分化剂处理ＨＬ６０细胞株时,发现其表面活性发生了明显的变化,ＰＭＡ诱导的细胞其表面酶活性在２４小时变化最大,升高到对照的１．３倍;而ＲＡ处理的细胞其表面酶活性在７２小时变化最大,升高到对照的１．７２倍。     

黄地老虎颗粒体病毒DNA片段的克隆与颗粒体蛋白基因的定位

用ｐＵＣ１９质粒作载体,克隆了黄地老虎颗粒体病毒（Ａｇｒｏｌｉｓｓｅｇｅｔｕｍｇｒａｎｕｌｏｓｉｓｖｉｒｕｓ,简称ＡｓＧＶ）ＤＮＡＰｓｔＩ－Ｄ．Ｅ．Ｆ．Ｇ．Ｈ．Ｊ．Ｋ．等７个片段。以［￣（３２）Ｐ］－ｄＣＴＰ标记的油桐尺蠖核型多角体病毒（Ｂｕｚｕｒａｓｕｐｐｒｅｓｓａｒｉａｎｕｃｌｃａｒｐｏｌｙｈｅｄｒｏｓｉｓｖｉｒｕｓ简称ＢｓＮＰＶ）多角体蛋白基因为探针,在３７℃条件下对ＡｓＧＶ）颗粒体蛋白基因进行了定位,将其分别定位于ＢｓｌⅡ－Ｓ或ＴＰｓＴＩ－Ａ或Ｂ和ＥｃｉＲＩ－Ａ片段上。