用有限酶切法分析蛋白质的氨基酸序列

报道了一个通过有限酶切蛋白质产生多肽片段的方法.蛋白质经单向SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离和用考马斯亮蓝短暂染色后,切下所需的蛋白质带,将其放入另一个SDS-PAGE凝胶的样品槽内,在电泳过程中该蛋白质被蛋白酶如蛋白酶V8降解,所产生的多肽片段随之被分离.电泳结束后,将多肽片段电印迹至聚偏二氟乙烯(polyvinylidene difluoride,PVDF)膜上.这些多肽片段从PVDF膜上切下后可以直接被用于分析氨基酸序列.该方法能广泛适用于分析一般蛋白质和N端被修饰蛋白质的氨基酸序列.     

一种直接用于蛋白质测序的快速电印渍技术

蛋白质印渍是指在一定的驱动力作用下将蛋白从凝胶上转移至某种印渍膜上的方法,有扩散印渍、真空印渍和电印渍三种。其中电印渍应用最为广泛,在理想条件下可将90％以上的蛋白质转移至印渍膜上。印渍膜有多种多样,如硝酸纤维素膜、阳离子化尼龙膜、DBM（diazo－benzy－loxymethy）、DPT（diazo－phenylthioether）、SGF（siliconnedglassfiber）和PVDF（polyvinylidenedifluoride）膜等“‘。近年来,又在此基础上发展了一种微量蛋白质N一端序列分析技术［’j。如果把蛋白质数据库资料与计算机结合起来,人们就有可能根据N一端序列…     

一种简便经济的薄层凝胶电泳保存方法——滤纸转移自干法

在分析性聚丙烯酰胺凝胶电泳特别是平板等电聚焦电泳中,薄层凝胶越来越被广泛采用,它有节省试剂、加样量少、电泳时间短、分辨率高及冷却效果好等优点。分析者都希望能将电泳染色后的凝胶理想地保存下来,目前所采用的方法均是直接将凝胶干燥在玻璃板或凝胶支持膜上(由于凝胶太薄不能转移),或者使用专用的透明保存膜,有时还要用真空干燥器干燥。     

虎纹捕鸟蛛粗毒双向凝胶电泳分析及部分蛋白质点的N端序列测定

采用固相 p H梯度等电点聚焦 - SDS双向聚丙烯酰胺凝胶电泳对虎纹捕鸟蛛粗毒进行了分析 ,通过考马斯亮蓝与银染法显色 ,电脑软件识别出约 30 0个蛋白质点 .约有 35个含量较高的蛋白质点分布在分子量 1 0 k D以下区域 ,通过印迹法将凝胶上蛋白质点转移到 PVDF膜上以后 ,对上述分子量 1 0 k D以下的组分进行了 N端序列测定 ,鉴定到了虎纹捕鸟蛛毒素 HWTX- ,HWTX- ,HWTX- 和 SHL- 1在凝胶上的位置 ,同时发现了 5种新的肽类毒素组分 .     

介绍一种新的半干式免疫转渍法

蛋白质免疫转渍法(Western blotting)是近十年发展起来的一种生化新技术。其原理是用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离待分析的蛋白质样品,然后用转渍装置把蛋白质转移到硝酸纤维素膜(NC膜)上。再利用免疫检测法检出要分析的蛋白质区带。过去报道的大多是利用液相夹心式电转渍仪完成转渍的,这     

一种改进的蛋白质超薄凝胶电泳方法

介绍了一种将聚丙烯酰胺凝胶固定在电泳夹板上的蛋白质电泳方法.通过此方法蛋白质电泳可以在0.4 mm厚的聚丙烯酰胺凝胶上进行.实验证明,经此方法处理的玻板结合凝胶非常牢固,在电泳后的所有处理步骤中都不会发生凝胶脱落现象.     

醋酸纤维素膜上的蛋白质等电聚焦电泳

等电聚焦电泳一般以聚丙烯酰胺作为支撑物。但凝胶配制麻烦,两性载体用量多,价格昂贵。利用醋酸纤维素膜进行等电聚焦电泳,则可能克服上述缺点。但是醋酸纤维素膜的强电渗作用,影响了等电聚焦。过去解决这一问题的方法,条件复杂,要求高,有些试剂国内无法得到。我们试用了甲基化方法来封闭醋酸纤维素膜上的解离基团,有效地消除了电渗作用,不需转移而直接进行了大鼠血浆凝血酶原的酶联免疫染色。     

蛋白电泳铜染色后胶中生物活性IL-2的回收

SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)已广泛用于蛋白质样品组分分析。通常的方法染色后蛋白质和肽即固定在凝胶上,尽管凝胶用SDS平衡后可对蛋白质进行洗脱或转移,但由于回收率低、耗时,同时回收的蛋白只能保存其抗原性而生物活性丧失,因而限制了SDS-PAGE在蛋白质回收领域中的应用。最近     

一种改进的超薄聚丙烯酰胺等电聚焦电泳实验

目的:介绍一种自制、简易、高效的平板微型聚丙烯酰胺凝胶等电聚焦电泳方法。方法:将载玻片黏合作为制胶模具,剪滤纸制成上样芯子进行等电聚焦电泳。结果:电泳条带清楚,样品容量大,电泳时间短,操作性强。结论:此方法简单、有效、实用,所需凝胶量少,节约成本,值得推广。     

影响PVDF膜对蛋白吸附效率的主要因素

通过结合有抗原的PVDF膜进行亲和纯化是小规模快速获取特异性抗体的一种重要手段.该方法的关键步骤之一是将抗原蛋白有效地吸附到PVDF膜上.尽管人们广泛使用PVDF膜亲和纯化抗体,但对影响PVDF膜吸附抗原蛋白的因素至今仍缺乏系统研究.以BSA为模型蛋白,检测在不同蛋白浓度、不同孵育时间、不同溶质溶液和不同pH值的情况下,PVDF膜吸附蛋白的效率.当蛋白溶液为PBS时,1 cm2 PVDF膜与2 mg·mLl BSA溶液孵育1h可达到其最大吸附率.常见的蛋白质缓冲液组分对PVDF膜的蛋白吸附率影响不一.其中,咪唑、Tris-HCl、NaCl、KCl在广泛的浓度范围内对PVDF膜吸附蛋白没有明显影响,而较高浓度的SDS、Triton-X 100、Tween-20、乙二醇、甘油、盐酸胍、尿素等可显著降低PVDF膜对蛋白的吸附效率,在pH为6.5～9.5的Tris-HCl中,随着pH的增高而吸附效率降低.     

2DE中IPG胶条转移到SDS-PAGE中的技术改进

2-维凝胶电泳(Two—dimensional gel electrophoresis,2DE)因其高通量、高分辨率等特点,被广泛用于蛋白质组的分离．然而,在蛋白质从第一向一固相(Immobilized pH gradients,IPG)胶条转移到第二向一十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶(Sodium dodecyl sulfate,SDS;Polyacrylamide gel electrophoresis．PAGE)时,常会引起蛋白质的损失．尤其是当将IPG胶条放入浓缩胶上时,在胶面不平、技术不熟练等情况下,常会在IPG胶条下引入气泡,导致蛋白质更多的损失．现将IPG胶条转移过程进行改进：先在第二向的十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶上加上薄薄的一层(约1～2mm厚)琼脂糖溶液,然后将IPG胶条转移上去,最后再封住胶条的上面．这样的转移不会引起气泡,可以大大提高实验的成功率及重复性,有利于蛋白质的转移(尤其是相对分子质量大于40kDa的蛋白质)．提高质谱鉴定的准确性．此法操作简便,可以减少因操作不熟练而带来的麻烦．     

一种转移非特异性蛋白带的染色方法

考马斯亮蓝是常用的聚丙烯酰胺凝胶蛋白电泳的染料,利用硝酸纤维素膜(NCF)对染料的吸附作用,将低浓度的考马斯亮蓝(0.025%)染色液直接对NCF上的转移蛋白带进行染色,经实验反复验证.它是一种较好的NCF上转移非特异性蛋白带的染色方法.     

葡萄糖氧化酶免疫酶染色检测硝酸纤维膜印染的病毒抗原或抗体

<正>近十年来,由于引进了下列技术,包括聚丙烯酰胺凝胶电泳后免疫沉淀、等电聚焦及将样品转移到支持基质的印染技术,分析复杂抗原混合物和其抗体反应的能力显著地提高了。人们已综述了蛋白质印染的一般技术。研究了影响样品经电泳转移到硝酸纤维素(NC)膜上的许多条件。可用同位素或免疫酶方法检测蛋白质印迹。同位素方法很敏感,但较昂贵而配置有些问题,并且有效使用期短。由于同位素法有上述缺点,导致了免疫酶方法的建立。     

蛋白质的印迹法

所谓印迹法就是生物样品(如核酸、蛋白质等)先经过凝胶(琼脂、聚丙烯酰胺等)电泳后,载有样品区带或点子的凝胶通过压片扩散或电泳迁移,把凝胶中分离的样品转移到硝酸纤维素滤纸上,并用一定的探针进行检测的方法。     

用银染色显示的rHuIFN-αD垂直板聚丙烯酰胺凝胶等电聚焦电泳测定法

本文报道了用聚丙烯酰胺垂直凝胶板进行蛋白质等电聚焦的方法,用改进的银染法使测定灵敏度达到ng水平。通过分析蛋白质等电聚焦的影响因素,建立了稳定的电泳条件,并用该方法发现了重组人αD型干扰素(rHu IFN-αD)基因表达产物的带电荷不匀一性。     

凝胶干胶的实验台制作法

目前,制作聚丙烯酰胺凝胶干胶的方法很多,大多数都是将凝胶干燥在玻璃板或凝胶支持膜上制得.下面介绍一种不用玻璃板,只用一张玻璃纸的简单经济、效果也好的凝胶干燥方法.　　1将脱色后背景清楚的凝胶浸泡在20%的甘油中,过夜.　　2将一张长度约为凝胶长度25倍,宽度比凝胶?..     

一种提高固定pH梯度（IPG）凝胶双向电泳的重复性、分辨率和通量的方法

在蛋白质组学研究中 ,双向聚丙烯酰胺凝胶电泳是现行蛋白质分离的最重要的方法之一。实验发展了一种提高固定pH梯度 (IPG)凝胶双向电泳的重复性、分辨率和通量的方法 :在一块SDS 聚丙烯酰胺凝胶上同时进行多块固定pH梯度(IPG)凝胶 (Multi stripsononeSDSgel,MSOG)电泳。用此方法比较了人肝癌细胞、不同生长状态的人肝癌细胞、3T3细胞的蛋白质以及同一个样品在不同大小的第二向凝胶系统 (大型和中型凝胶 )的双向电泳图谱。结果表明 ,同一样品在 13cmIPGStrip双向电泳可分离 2 0 0 0以上蛋白质点且图谱蛋白质点的匹配率可超过 95 %以上。同时又可以最大程度地降低凝胶背景对蛋白质点比较分析的干扰 ,从而提高了双向电泳分离蛋白质的分辨率和通量。这些优点都有助于差异蛋白质组学特别是细胞器差异蛋白质组学研究的自动化。     

SMA基微孔膜固定化β-半乳糖苷酶的研究

以超临界二氧化碳（SCCO2）为分散介质在聚偏氟乙烯（PVDF）微孔膜表面和孔内进行马来酸酐和苯乙烯的接枝共聚,合成出超高分子量的苯乙烯/马来酸酐交替共聚物（SMA）基微孔PVDF膜。以SMA基PVDF膜为载体通过酸酐基和酶分子上的氨基偶联,制备出具有酶催活性的功能性分离膜。考察了影响酶固定化的因素,确定其最佳固定化条件为: 温度,4oC;pH,8.2; 酶/膜,1:10;反应时间,6h。固定化酶膜的最适温度为55oC,最适pH为7.8,均比自由酶稍高;Km（0.3mM/L）与自由酶接近。固定化酶膜活力达13.5 U/cm2 膜, 比活为280.0 U/mg 蛋白,蛋白载量为68.2 g/cm2 膜,相对活力为89.0%。固定化酶膜表现出良好的操作稳定性和储存稳定性,SMA基PVDF微孔酶膜超滤制备低乳糖牛奶实验表明该技术应用前景广阔。     

一种简单而灵敏的蛋白质肽图分析方法

聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)已广泛用于多组分蛋白质体系的分离、纯化和分子量比较分析,而蛋白质肽图分析方法则能进一步在寡肽的水平上对蛋白质进行比较研究。部分揭示蛋白质氨基酸组成的异同。常规的肽图分析方法所需样品量较大(n mole或接近mg量),制备样品不仅步骤繁杂而且损耗量大,因而限制其广泛应用.1977年Elder等对PAGE分离得到的凝胶小片中的蛋白质,直接用放射性碘标记,然后进行酶解、电泳-层析、放射自显影     

一种简便的凝胶干燥法

SDS-PAGE(聚丙烯酰胺凝胶电泳)已成为分析蛋白质核酸等样品的一种常用方法。为使染色后的凝胶长期保存,需制成干胶。下面介绍一种比已报道的更为简便易行的凝胶干燥方法。取一块如电泳用大小的玻璃扳,将二张略大于玻璃板的玻璃纸浸于脱色液中。先取一张玻璃纸平铺于玻璃板上,从一端向另一端平铺,抚平去气泡,涂一层50%甘油。将凝胶放其上,在凝胶面上也涂一层50%甘油。将另一张玻璃纸覆盖在凝胶上从一端开始慢慢平铺,抚平赶尽气泡,将大于玻璃板的玻璃纸向玻璃板