一种新的丝状真菌油脂含量快速鉴定方法

本文报导了通过染色对含油脂丝状真菌进行快速半定量的筛选方法.我们通过实验发现,以苏丹混合染液对丝状真菌的菌丝染色,能使菌丝中的脂肪小滴着橙色至深红色,脂质小滴的大小和着色的深浅跟真菌菌丝的油脂含量是近似的正比关系.     

丝状真菌被孢霉产生油脂的研究

被孢霉的三个菌株与Ｍ１４生长在以葡萄糖为碳源、尿素为氮源的液体培养基中,所得到的菌丝体内堆积含ｒ－亚麻酸的油脂。油脂产率以Ｍ１０菌株为高,而油脂中的ｒ－亚麻酸含量却以Ｍ１４菌株为高。这种油脂的脂肪酸中,所含饱和脂肪酸主要有豆寇酸,棕榈酸,和硬脂酸;所含不饱和脂肪酸主要有棕榈油酸,油酸,亚油酸以及ｒ－亚麻酸。上述被孢霉菌株的培养物接种在含葡萄糖、尿素的培养基中生长大约４８小时后,菌丝体顶端细胞形成鼓     

一种经济快速提取丝状真菌基因组DNA的方法

以螺旋木霉(Trichoderma SpiraleXX)、小克银汉霉(Cunninghamella phaeospora MK)和卵形孢球托霉(Gongronella butleri XT)3种丝状真菌为材料,采用改进的CTAB法提取基因组DNA.方法改进后无需液氮、聚乙烯砒咯烷酮(PVP)和NaAc等试剂,过程简洁,且所需菌体量少,提取的DNA纯度较好,适用于一次微量提取多个样品的基因组DNA.此方法得到的基因组DNA可用于PCR扩增.     

使用BODIPY荧光染料快速测定微藻油脂含量方法

使用BODIPY505/515荧光染料,通过荧光分光光度法测定藻细胞中的油脂含量。结果表明：BODIPY505/515的最佳染色条件为二甲基亚砜（DMSO）体积分数2%,BODIPY505/515最终质量浓度0.25μg/mL,染色时间30min,染色温度35℃。在最佳染色条件下,微藻油脂含量与荧光强度呈线性相关（R2=0.976 4）。通过测定BODIPY505/515染色的不同种属微藻的荧光强度,应用该关系计算其油脂含量,与质量法测定的结果相比没有显著差异。该方法较为普适,比传统方法相比具有简便快捷,试样用量少的特点,与尼罗红荧光染料相比具有较窄的发射波谱范围,不会与微藻的自身荧光相互干扰,更适于过程监控及高含油藻株的筛选。     

大庆湖藻的分离、鉴定和高油脂含量筛选

目的:对大庆6个典型湖泊的湖藻进行分离和鉴定,筛选出高油脂含量的大庆湖藻。方法:采用吸管分离法、稀释平板分离法和平板划线法共分离出8株硅藻和5株绿藻,并利用化学方法对所分离的湖藻进行油脂含量测定。结果:所分离13株藻种名称和油脂含量分别为GF-1四尾栅藻9.3%、GF-2鼓藻2.7%、GF-3布朗葡萄藻20.9%、GF-4布纹藻32.6%、HY-1卵囊藻5.5%、HY-2舟形藻37.1%、HY-3二形栅藻6.4%、YL-1舟形藻32.2%、YL-2刀形布纹藻38.3%、YL-3舟形藻34.5%、HQ-1脆杆藻36.6%、QY-1盒形藻33.8%、CY-1脆杆藻29.4%。结论:筛选出YL-2、HY-2和HQ-1三株高油脂含量的大庆湖藻。     

MALDI-TOF MS技术在侵袭性丝状真菌快速鉴定中的应用

探索不同培养基、不同培养时间和不同蛋白质提取方法对侵袭性丝状真菌质谱鉴定准确率的影响, 旨在提高基质辅助激光解析电离飞行时间质谱技术鉴定侵袭性丝状真菌的准确率。

采用分子生物学方法为金标准, 同时运用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱技术对所收集临床丝状真菌进行鉴定。根据分子生物学的鉴定结果, 去除VITEK-MS v3.0数据库中没有的菌株, 其余菌株接种在沙氏葡萄糖琼脂(SDA)、马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)和察氏培养基(CA)3种不同的培养基中, 采用2种不同的蛋白质提取方法(甲酸乙腈法和磁珠法), 获得了不同培养时间点(2、3、5、7和9 d)的特异性质谱指纹图谱。

不同丝状真菌蛋白质提取方法进行比较, 甲酸乙腈法总鉴定准确率为79.8%, 磁珠法总鉴定准确率为77.5%, 2种丝状真菌蛋白质提取方法的质谱鉴定准确率差异无统计学意义(χ²=1.040, P=0.308)。不同培养基进行比较, SDA培养基总鉴定准确率为90.7%, PDA培养基总鉴定准确率为81.4%, CA培养基总鉴定准确率为67.4%, 3种不同培养基的丝状真菌质谱鉴定准确率差异有统计学意义(χ²=36.609, P < 0.001), 其中使用SDA培养基鉴定准确率最高, 使用CA培养基鉴定准确率最低(SDA vs PDA, χ²=7.748, P=0.005;SDA vs CA, χ²=35.131, P < 0.001;PDA vs CA, χ²=10.994, P=0.001)。不同培养时间进行比较, 丝状真菌培养2、3、5、7和9 d后的质谱总鉴定准确率分别为64.3%、88.4%、89.1%、79.1%和78.3%, 不同培养时间的质谱鉴定准确率差异有统计学意义(χ²=32.274, P < 0.001)。培养3 d和培养5 d的质谱鉴定准确率优于培养7 d和培养9 d的质谱鉴定准确率, 培养2 d的质谱鉴定准确率明显低于其他时间(3 d vs 5 d, χ²=0.039, P=0.844;7 d vs 9 d, χ²=0.023, P=0.879;3 d vs 7 d, χ²=4.095, P=0.043;2 d vs 9 d, χ²=6.139, P=0.013)。

侵袭性丝状真菌使用SDA培养基培养3 d, 运用甲酸乙腈法提取蛋白质进行质谱鉴定最理想。

     

一种快速制备丝状真菌PCR反应模板的方法

为建立一种快速、简便制备丝状真菌PCR反应模板的方法,提高丝状真菌菌株鉴定与转化子筛选效率,本试验以10种不同种丝状真菌为材料,比较了3种不同试剂微波法制备丝状真菌PCR反应模板的效果,并优化了微波处理的时间。试验结果表明,取少量菌丝,加入50mmol/L NaOH,无菌吸头将菌丝打散,微波炉高火处理30s,离心取上清,即可获得用作PCR反应的模板。该方法制备的10种不同种丝状真菌PCR反应模板用ITS引物进行扩增,都可得到与传统CTAB法提取的DNA模板同样清晰明亮的扩增条带。该法制备的PCR模板可用于不同引物和不同公司的PCR反应产品扩增。将该方法制备的PCR模板用于囊状匍柄霉Stemphyliumvesicarium转化子的筛选,其结果与传统CTAB法提取的DNA结果一致。此法为丝状真菌提供了更加快速简便的PCR模板制备方法,极大减少了DNA提取的人力和物力成本。     

一种快速高效获取丝状真菌PCR反应模板的方法

建立一种快速高效获取丝状真菌PCR反应模板的方法,提高丝状真菌PCR鉴定效率。通过单因素法对机械破壁联合微波法进行条件优化,利用优化后的方法获取13株不同种属丝状真菌的PCR反应模板,同时与Chelex-100法、机械破壁法作对比,以试剂盒抽提法作为阳性对照,进行ITS序列扩增,琼脂糖凝胶电泳检测扩增结果。机械破壁联合微波法获取丝状真菌PCR反应模板的最佳条件为40 Hz机械破壁1 min、微波700 W高温裂解3 min,采取该法与试剂盒抽提法获得的模板均成功扩增13株不同种属丝状真菌ITS序列,且PCR鉴定结果一致;Chelex-100法获得的模板成功扩增6株丝状真菌ITS序列;机械破壁法获得的模板虽成功扩增9株丝状真菌ITS序列,但扩增效果欠佳。机械破壁联合微波法能够有效获取丝状真菌PCR反应模板,与试剂盒抽提法相比具有操作简便、快速高效的优点,提高丝状真菌PCR鉴定效率。     

生物油脂高产菌株筛选方法研究

本文采用脂肪粒计数法、苏丹III菌泥染色法、碳饥饿检出法等对生物油脂高产菌株进行了筛选比较研究。通过试验表明, 苏丹III菌泥染色法简便快捷, 其结果与菌体的油脂含量有较好的相关性, 此法是筛选产脂菌株的较理想的初筛方法。碳饥饿检出法准确性较高, 但过于繁琐; 相比之下, 脂肪粒计数法虽简便, 但缺乏准确性, 使用时必须同时考虑脂肪粒的大小。通过筛选, 获得了一株生物油脂高产菌株IFFI01368, 其菌体中油脂含量为54.25%。     

微藻细胞油脂含量的快速检测方法

以斜生栅藻(Scenedesmus obliquus JNU20)为实验材料,采用尼罗红(NR)荧光光谱法和傅里叶变换红外光谱法(FTIR)测定该藻细胞中的油脂含量。研究结果表明NR的最佳染色条件为:染色前微波处理40 s,二甲基亚砜体积分数1%, NR最终质量浓度1.5 μg/ml,染色时间5 min,染色温度40℃。比较了NR荧光光谱法、FTIR与传统重量法测定的该藻在不同时相的油脂积累情况,利用激光共聚焦显微镜观察了细胞中油体形成的动态过程。实验结果表明NR荧光光谱法、FTIR与传统重量法测定的结果显著相关(R²=0.9258, R²=0.9844),但NR荧光光谱法和FTIR更简便快速,研究结果为规模化筛选高含油量藻株及跟踪产油微藻油脂积累过程奠定了基础。     

尼罗红荧光优化法快速检测微拟球藻细胞内油脂含量

【目的】利用尼罗红荧光染色法快速检测微拟球藻细胞内的油脂含量。【方法】系统性地调整激发波长与发射波长,确定最佳二甲基亚砜(DMSO)浓度、尼罗红终浓度、染色时间和细胞密度的范围,比较重量法和Triolein标准品的油脂含量分别与荧光强度之间的关系。【结果】分析得出了尼罗红荧光强度与微拟球藻细胞油脂含量的关系,确定优化后染色条件为:二甲基亚砜浓度为5%,尼罗红终浓度为1 mg/L,染色时间为6 min,且细胞密度为(0.5-3.0)×10~6 cells/m L的范围内,激发波长和发射波长分别为515 nm和570 nm。重量法和Triolein标准品的油脂含量分别与尼罗红染色荧光强度之间的关联性,表明尼罗红荧光染色方法可以用来快速准确地检测细胞内的油脂含量,且油脂含量与荧光强度之间正相关,相关系数R~2为0.997 3。尼罗红染色优化后油脂的检测下限达到2μg,大大减少了测定油脂含量所需细胞量。【结论】针对不同种属系统性地确认了荧光激发波长和发射波长,并优化验证得到了最佳尼罗红荧光染色条件,可以快速准确地检测微量微拟球藻细胞内的油脂含量,便于大规模筛选高产油突变藻株。     

一种用于PCR扩增的丝状真菌DNA快速提取方法

丝状真菌在工业、农业、医药以及基础生物学研究中具有重要作用。利用遗传转化技术对丝状真菌进行菌株改良和基因功能分析, 也越来越受到重视。然而, 丝状真菌DNA提取方法繁琐、费时, 难以满足利用PCR技术高通量筛选转化子的需要。本文以曲霉菌为例建立了一种快速提取丝状真菌DNA的实验方法, 微波处理置于10 × TE buffer中的菌丝即可得到DNA。RAPD试验和PCR扩增证明, 该方法提取的DNA能够达到PCR扩增的要求。研究结果为高通量快速筛选丝状真菌转化子奠定了基础。     

乌桕种子各部位比率和油脂含量与环境因子的关系

对全国11个省16个市（县）19个鸡爪桕[Sapium sebiferum(L.)Roxb.var.laxicarpum Hu]种子样品进行分析,以探讨乌桕种子的外种皮、内种皮、种仁的比率及皮油、梓油的含量和种子总含油率、百粒重与纬度、经度、年积温和年降水量的相关性,结果表明,乌桕种子外种皮、种仁的比率和皮油含量与纬度、经度、年积温和年降水量呈正相关;梓油的含量与经度、年积温和年降水量呈正相关,内种皮的比率与上述环境因子均呈负相关;种子的百粒重与经度和年积温呈正相关,与纬度和年降水量的相关性不明显;种子的总含油量与经度、年积温及年降水量呈较明显的相相关,而与纬度没有明显的正相关。     

大豆种子蛋白和油脂含量调控的研究进展

作为重要的粮油饲兼用作物,大豆为世界膳食提供高达约71%的蛋白质和29%的油脂。随着人口不断增长和大豆消费需求的不断提高,在有限的耕地面积和单产条件下,大豆品质的遗传改良则更具重要意义。该文综述了大豆种子蛋白和油脂含量两个重要品质性状调控的研究进展,总结了调控大豆蛋白和油脂合成的关键酶和转录因子及因子间的相互作用,并根据蛋白和油脂合成代谢调控途径中关键酶和转录因子作用机制,绘制了大豆蛋白和油脂合成代谢的分子调控网络。此外,该文还讨论了当前大豆种子蛋白油脂含量调控研究存在的瓶颈及对策,以期为大豆种子品质的遗传改良和高产品种培育提供参考。     

微生物油脂中花生四烯酸含量的准确快速测定

建立了快速、准确测定微生物油脂中花生四烯酸(ARA)含量的气相色谱检测方法。选用DB-23毛细管色谱柱,设置合适的载气压力,采用FID检测器,对ARA含量进行了定量分析。测定结果表明:油脂中各脂肪酸组分可有效分离,分析时间仅需20 min,ARA的回收率为90.146%~100.634%,相对标准偏差为4.175%。     

莱茵衣藻中Limp77基因干涉后油脂含量升高

随着能源危机问题日益严重,可再生能源的研究渐渐成为目前研究的热点.微藻生物能源又以众多的优点成为目前可再生能源的研究重点.我们发现,在减氮培养下的莱茵衣藻,其油脂含量增加,Limp77基因的表达量明显下降.Limp77基因编码的是一类CCCH型锌指蛋白,具有通过与DNA、RNA结合来实现转录的调控或通过调控其它基因转录的锌指蛋白来实现转录调控的功能,极可能参与到莱茵衣藻油脂代谢调控中.通过利用RNAi干涉技术构建Limp77基因的干涉载体,并通过玻璃珠法转入莱茵衣藻（Chlamydomonas reinhardtii）2A38中,研究其与油脂相关的生理生化指标的变化.实验结果表明,Limp 77基因明显抑制莱茵衣藻油脂的积累.     

不同产地山茱萸种子中油脂含量及脂肪酸组成分析

山茱萸( Cornus officinalis Sieb. et Zucc.)为山茱萸科( Cornaceae)山茱萸属( Cornus Linn.)的多年生木本植物[1],主要产自中国的陕西、河南和浙江等地,在四川、安徽和山东等地亦有栽培[2]。山茱萸是世界三大名贵木本药材之一[3],临床上常以成熟果实去核后的果肉入药,而占山茱萸果实质量约80%的种子则被大量废弃。因此,对山茱萸种子资源的研究有利于提高山茱萸的综合利用价值。     

一种简便,快速的真菌油脂提取方法

利用微生物发酵生产不饱和脂肪酸(ＰＵＦＡｓ)即将大规模工业化生产,诱变筛选富含ＰＵＦＡｓ的高产菌株成为工业育种的热门课题,快速判断真菌中油脂含量对菌株的筛选有着重要意义。对真菌进行油脂含量鉴定的方法有两种:一种是半定量方法———脂肪染色法,该法判断结果较困...     

马尾松内生真菌产油脂菌株的分离、筛选和鉴定

采用组织块法从马尾松(Pinus massoniana Lamb.)根、茎和叶片中分离获得内生真菌,初步筛选出产油脂菌株且对其油脂含量进行了分析;并采用形态学及分子生物学方法对产油脂菌株进行了分类鉴定。结果显示:从马尾松植株中共获得21株内生真菌菌株,其中分离自根、茎和叶片的菌株分别为4株、6株和11株。有14株菌株的菌丝中有油滴;其中,分离自叶片的菌株ZP-1、分离自根的菌株ZP-2和分离自茎的菌株ZP-3的菌丝内油滴较多且油脂含量较高,平均油脂含量分别达到29.12%、25.03%和30.56%,差异极显著(P<0.01)。不同菌株的菌落颜色、菌丝和分生孢子形态特征明显不同,菌株ZP-1、ZP-2和ZP-3的形态分别与拟青霉属(Paecilomyces Bainier)、生赤壳菌属(Bionectria Speg.)和镰刀菌属(Fusarium Link)菌种的形态相似。与GenBank中相关真菌ITS序列的比对以及NJ系统树分析结果显示:菌株ZP-1与拟青霉属、菌株ZP-2与生赤壳菌属、菌株ZP-3与镰刀菌属间的ITS片段序列相似性均达到99%,在各自的NJ系统树上它们也分别聚在一起。初步确定菌株ZP-1、ZP-2和ZP-3分别属于拟青霉属、生赤壳菌属和镰刀菌属。     

黄腐酸对单针藻生长和油脂含量的影响

为了研究不同浓度的黄腐酸对单针藻Monoraphidium sp.FXY-10细胞生长、油脂合成的影响,研究于Kuh1培养基中添加4种不同浓度的黄腐酸(40、80、120和160 mg/L),优化出异养培养条件下最适合藻细胞生长的黄腐酸浓度;并采用黄腐酸与异养-自养两步培养联用的方法提高细胞量和油脂含量,自养培养时在培养基中添加5、25、125和625 mg/L的黄腐酸诱导油脂的合成。结果表明,80 mg/L的黄腐酸对细胞生长的促进作用最显著,细胞量可达6.4 g/L,为对照组的1.5倍。黄腐酸的浓度增加至160 mg/L,藻细胞的生长受到明显的抑制。自养培养阶段,添加25 mg/L的黄腐酸能显著地提高藻细胞的油脂含量,其油脂含量从30.78%增加至54.65%。黄腐酸对于单针藻的生长和油脂合成具有明显的促进作用,黄腐酸与两步法联用在提高微藻细胞量和油脂含量方面具有较好的应用前景。