多核苷酸合成的研究 Ⅳ.UpCpCpA的合成

用化学合成或化学与酶促合成相结合的方法均能制备得到UpCpCpA(图1)。化学合成包括“2+2”和“1+3”两条路线。参考Mackey和Gilham方法,在PNPase催化下,引物UpCpC与2’(3’)-O-甲氧乙基ADP反应进行单一加成可产生30%的UpCpCpA。为了获得纯的产品,采用了二次柱层析法(图2)。文中讨论了PNPase连接的转核苷酸作用问题。     

多核苷酸合成的研究——Ⅲ.CpUpCpG>p的合成

本文报道用PNPase和RNase N_1相结合的方法合成了CpUpCpG>p。选择适当的反应条件,包括1.CpUpC:GDP=1:5(克分子比),2.RNase N_1:PNPase=4:1(活力单位比),3.反应pH为7.6,4.37°反应10小时,CpUpCpG>p产率可达64%。另有18%开环产物CpUpCpGp。后者又可用氯甲酸乙酯进行环化得到60%产率的CpUpCpG>p。     

多核苷酸合成的研究 Ⅲ.CpUpCpG>p的合成

本文报道用PNPase和RNase N_1相结合的方法合成了CpUpCpG>p。选择适当的反应条件,包括1.CpUpC∶GDP=1∶5(克分子比),2.RNase N_1:PNPase=4∶1(活力单位比),3.反应pH为7.6,4.37°反应10小时,CpUpCp@>p产率可达64%。另有18%开环产物CpUpCpGp。后者又可用氯甲酸乙酯进行环化得到60%产率的CpUpCpG>p。     

合成利巴韦林的关键酶瞟呤核苷磷酸化酶的原核表达及活性分析

目的：在枯草芽孢杆菌中表达嘌呤核苷磷酸化酶（PNPase）并分析其活性。方法：将PNPase的编码基因deoD克隆入pDG148表达载体,构建原核穿梭型表达载体pDG148-deoD,采用电转化方法将表达载体转入枯草芽孢杆菌WB600后诱导表达重组PNPase;研究重组PNPase的活性。结果与结论：获得的重组PNPase活性较对照提高了193．9％,其最适催化条件为65℃、pH7．5、500μmol／L底物浓度和1％1,2,4-三氮唑-3-羧甲酰胺;对重组菌的发酵条件进行了初步优化,IPTG诱导6h后在发酵液中添加0．5％的Tween-80能大幅度提高重组PNPase的酶活力。     

核糖核酸一级结构微量分析方法的研究 Ⅲ.萤光标记法测定寡核糖核苷酸3′端及核苷酸顺序

本文报导了一种新的萤光试剂DNS-Gly-NHNH_2在寡核糖核苷酸一级结构分析中的应用。寡核糖核苷酸3′端经高碘酸氧化后能与萤光试剂DNS-Gly-NHNH_2反应,经红酵母RNase酶解后得到DNS-Gly-核苷腙。通过聚酰胺薄板层析鉴定DNS-Gly-核苷腙,从而能测定寡核糖核苷酸3′端核苷。另外,运用β消去循环,对寡核糖核苷酸进行化学逐步降解,在此基础上结合上述萤光标记测定寡核糖核苷酸3′端技术,对化学合成片段UpCpCpA进行了顺序分析。片段用量为0.16A_(260)单位。这一方法较紫外吸收法灵敏,易在一般实验室中使用。     

核糖核酸一级结构微量分析方法的研究 Ⅲ.萤光标记法测定寡核糖核苷酸3′端及核苷酸顺序

本文报导了一种新的萤光试剂DNS-GIy-NHNH_2在寡核糖核苷酸一级结构分析中的应用。寡核糖核苷酸3′端经高碘酸氧化后能与萤光试剂DNS-Gly-NHNH_2反应,经红酵母RNase 酶解后得到DNS-Gly-核苷腙。通过聚酰胺薄板层析鉴定DNS-Gly-核苷腙,从而能测定寡核糖核苷酸3′端核苷。另外,运用β消去循环,对寡核糖核苷酸进行化学逐步降解,在此基础上结合上述萤光标记测定寡核糖核苷酸3′端技术,对化学合成片段UpCpCpA 进行了顺序分析。片段用量为0.16A~(260)单位。这一方法较紫外吸收法灵敏,易在一般实验室中使用。     

多核苷酸磷酸化酶及其应用(下)——关于应用的研究

人们对于多核苷酸磷酸化酶(PNPase)的巨大兴趣,并非由于它在体内的生理意义(这方面还不清楚),而在于它的广泛应用及其所作出贡献。例如Nirenberg和Ochoa等应用PNPase研究遗传密码及其阅读方向,因此获得诺贝尔奖金。仅此即足以说明PNPase在应用方面的卓越贡献。这些细节过去已有报道,不拟赘述。近十年来PNPase又对核酸人工合成、RNA结构分析、以及合成具有生物功能的polyN等方面作出了重大的贡献,现就这几方面作些介绍。一、PNPase用于核酸的人工合成     

多核苷酸合成的研究——Ⅰ.酶促合成酵母丙氨酸转移核糖核酸3′-端接受茎区八核苷七磷酸CpUpCpGpUpCpCpA

本文报道了用RNase N_1(核糖核酸酶、鸟嘌呤核苷酸-2′-移换酶,Neurospora Crassa,E.C.2·7·7·26)连接CpUpCpG>p与UpCpCpA合成酵母丙氨酸转移核糖核酸3′-端接受茎区八核苷七磷酸CpUpCpGpUpCpCpA。反应条件包括:供体(CpUpCpG>p),0.07～0.09M;受体(UpCpCpA)浓度为供体浓度的三至七倍;RNase N_1,每毫升250单位;pH7.5磷酸缓冲液,0.1M;0°±2℃反应48小时。在这一反应中,CpUpCpGpUpCpCpA的产率随着受体与供体的克分子比例的增大而升高,当这一比例超过6,产率超过30%。本方法一次可得到纯的CpUpCpGpUpCpCpA数毫克。关于从最终产物中除去RNaseN_1的问题,我们发现在pH3.5条件下进行DEAMSephadexA-25(Cl~-型)柱层析或用pH2.7条件下的纸电泳法均可得到较满意的效果。当把反应物在6M NH_4OH,0.04M DTP,37℃保温15分钟,或者在pH7.4 Tris-HCl缓冲液和0.04M DTPJ 0℃保温7小时以后,RNase N_1即完全失活。可是,一旦除去上述DTP等抑制条件以后,失活后的RNase N_1在空气中可以逐步恢复其大部分活力。在我们的实验中没有向反应物中加入0.1%的明胶蛋白,很可能底物本身对RNase N_1具有一定的保护作用。在合成CpUpCpGpUpCpCpA的同时,我们还用RNase N_1合成了GpC,GpΨ,GpU,GpUp,GpUpCpC及CpUp(UpGpUpCpC等寡核苷酸,并且都得到了较好的产率。对RNase N_1酶促合成CpUpCpGpUpCpCpA反应中产生的几个付产物进行了分离纯化和初步鉴定。     

多核苷酸合成的研究 Ⅸ 在多核苷酸磷酸化酶(PNPase)的单一加成反应中引物和保护底物的特异性问题

在PNPase 利用2′(3′)-o-α甲氧乙基保护的NDP 作为底物的单一加成反应中,CpUpC+ppU~(Me),37℃,7小时,CpUpCpU~(Me)的产率在50%以上,而CpUpC+ppG~(Me)在同一反应条件下,CpUpCpG~(ME)的产率仅10%以下。若提高反应温度、pH 和底物的浓度等,可增加CpUpCpG~(Me)的产率至50～70%。GpCpm′I+PP(?)~(Me)在上述反应条件下,没有获得所希望的反应产物(GpCpm'Ip(?)~(Me),而UpCpC+pp(?)~(Me)时,则有UpCpCp(?)~(Me)的生成。GpCpm'I+pp(?)时,有少量GpCpm'Ip(?)合成。这些结果说明,在PNPase 的单一加成反应中,存在着底物和引物的特异性问题,因而对不同的底物或引物的最适反应条件是有差别的。     

多核苷酸合成的研究——Ⅰ.酶促合成酵母丙氨酸转移核糖核酸3′-端接受茎区八核苷七磷酸CpUpCpGpUpCpCpA

本文报道了用RNase N_1(核糖核酸酶、鸟嘌呤核苷酸-2’-移换酶,Neurospora Crassa,E.C.2.7.7.26)连接CpUpCpG>p与UpCpCpA合成酵母丙氨酸转移核糖核酸3’-端接受茎区八核苷七磷酸GpUpCpGpupCpCpA。反应条件包括:供体(CpUpCpG>p),0.07～0.09M;受体(UpCpCpA)浓度为供体浓度的三至七倍;RNase N_1,每毫升250单位;pH7.5磷酸缓冲液,0.1M;0°±2℃反应48小时。在这一反应中,CpUpCpGpUpCpCpA的产率随着受体与供体的克分子比例的增大而升高,当这一比例超过6,产率超过30%。本方法一次可得到纯的CpUpCpGpUpCpCpA数毫克。关于从最终产物中除去RNase N_1的问题,我们发现在pH3.5条件下进行DEAESephadexA-25(Cl~-型)柱层析或用pH2.7条件下的纸电泳法均可得到较满意的效果。当把反应物在6M NH_4OH,0.04M DTP,37℃保温15分钟,或者在pH7.4 Tris-HCl缓冲液和0.04MDTP,0℃保温7小时以后,RNase N_1即完全失活。可是,一旦除去上述DTP等抑制条件以后,失活后的RNase N_1在空气中可以逐步恢复其大部分活力。在我们的实验中没有向反应物中加入0.1%的明胶蛋白,很可能底物本身对RNase N_1具有一定的保护作用。在合成CpUpCpGpUpCpCpA的同时,我们还用RNase N_1合成了GpC,GpΨ,GpU,GpUp,GpUpCpC及CpUpCpGpUpCpC等寡核苷酸,并且都得到了较好的产率。对RNase N_1酶促合成CpUpCpGpUpCpCpA反应中产生的几个付产物进行了分离纯化和初步鉴定。     

微生物多核苷酸磷酸化酶的研究

采用聚丙烯酰胺凝皎电泳柃测不同来源细菌、酵母菌和真菌中的多核苷酸磷酸化酶相似文献   

限制性核酸内切酶BamH1的识别顺序 dG_pG_pA_pT_pC_pC 的化学合成

本文报道用硅胶柱层析分离二酯法合成产物的新方法及限制性核酸内切酶BamH 1接头dG_pG_pA_pT_pC_pC 的化学合成。其合成路线是:(1)以溶剂抽提法制备MMTrG_p~(Bz)G_p~(Bz)A~(Bz)-OH,其3'-OH 以磷酸氰乙酯和MSCl 反应磷酸化得到MMTrG_p~(Bz)G_p~(Bz)A_p~(Bz)(Ⅰ);(2)用硅胶分离法制备MMTrT_pC_p~(An)C~(An)-OAC,脱去5'-MMTr 保护基后得HO-T_pC_p~(An)-OAC(Ⅱ);(3)Ⅰ与Ⅱ缩合,脱去保护基后制得dG_pG_pA_pT_pC_pC(图2)。硅胶层析法与抽提法比较,前者有较高的分离效力和速度,并且产品中所含色素较少。硅胶层析法和3'-OH 磷酸化方法的应用,加快了DNA 短片段的合成。     

限制性核酸内切酶BamH1真的识别顺序dG_pG_pA_pT_pC_pC的化学合成

本文报道用硅胶柱层析分离二酯法合成产物的新方法及限制性核酸内切酶BamH1接头dG_pG_pA_pT_pC_pC的化学合成。其合成路线是:(1)以溶剂抽提法制备MMTrG_p~(Bz)G_p~(Bz)A~(Bz)-OH,其3'-OH以磷酸氰乙酯和MSCl反应磷酸化得到MMTrG_p~(Bz)G_p~(Bz)A_p~(Bz)(Ⅰ);(2)用硅胶分离法制备MMTrT_pC_p~(An)C~(An)-OAC,脱去5'-MMTr保护基后得HO-T_pC_p~(An)C~(An)-OAC(Ⅱ);(3)Ⅰ与Ⅱ缩合,脱去保护基后制得dG_pG_pA_pT_pC_pC(图2)。硅胶层析法与抽提法比较,前者有较高的分离效力和速度,并且产品中所含色素较少。硅胶层析法和3'-OH磷酸化方法的应用,加快了DNA短片段的合成。     

多核苷酸合成的研究——Ⅸ 在多核苷酸磷酸化酶(PNPase)的单一加成反应中引物和保护底物的特异性问题

在PNPase利用2′(3′)-o-α甲氧乙基保护的NDP作为底物的单一加成反应中,CpUpC+ppU~(Me),37℃,7小时,CpUpCpU~(Me)的产率在50%以上,而CpUpC+ppG~(Me)在同一反应条件下,CpUpCpG~(Me)的产率仅10%以下。若提高反应温度、pH和底物的浓度等,可增加CpUpCpG~(Me)的产率至50～70%。GpCpm′I+ppψ~(Me)在上述反应条件下,没有获得所希望的反应产物(GpCpm′Ipψ~(Me)),而UpCpC+ppψ~(Me)时,则有UpCpCpψ~(Me)的生成。GpCpm′I+ppψ时,有少量GpCpm′Ipψ合成。这些结果说明,在PNPase的单一加成反应中,存在着底物和引物的特异性问题,因而对不同的底物或引物的最适反应条件是有差别的。     

合成编码蛋白质基因的设计

 本文以牛生长激素基因为例,对合成编码蛋白质基因的微机设计原理进行了探讨。微机程序的编制采用高级BASIC语言,在IBM-PC微机上完成。设计合成编码蛋白质基因的要点为:(1)按照宿主系统中高表达蛋白质基因对密码子的使用频率选用氨基酸密码子,以期合成基因得到高效表达;(2)对较大的合成基因设计有能够进行分段克隆的酶切位点,从而将一个大的基因分解成为多个基因片段的合成,减少了酶促连接化学合成DNA片段的步骤;(3)对于酶促连接化学合成DNA片段有干扰的重复顺序和互补顺序,则利用变换简并密码子的办法予以消除。     

多核苷酸合成的研究——ⅩⅢ.酵母丙氨酸转移核糖核酸3′端半分子中Cpm~1IpψpG的酶促合成

本文报道了酵母丙氨酸转移核糖核酸3′端半分子反密码区的四核苷酸片段Cpm~1IpψpG的合成。先以Cpm~1Ipψ为引物,GDP为底物,在PNPase和RNase T_1两个酶的协同作用下,生成Cpm~1IpψpGp,对应用这两个酶进行合成的规律作了摸索与归纳,使合成Cpm~1IpψpGp的产率达到90%以上,它再经固定化碱性磷酸单酯酶脱磷得到Cpm~1IpψpG,脱磷率达到98%,此工作通过合成方法旁证了RNase T_1不水解m~Ip-N键。     

β-内酰胺的合成方法

本方法是以(R)-3-羟基丁酸甲酯为初始原料,合成β-内酰胺(简写4-AA)的一条路线,它的优点是:其初始原料(R)-3-羟基丁酸乙酯是通过生物发酵生产的具有天然手性的P3hb通过高温高压裂解得来的。去除了以往纯化学合成手性拆分的麻烦,大大缩短了合成路线,而且此路线成本较低,有利于工业化。     

多核苷酸合成的研究——ⅩⅢ.酵母丙氨酸转移核糖核酸3′端半分子中Cpm~1IpψpG的酶促合成

本文报道了酵母丙氯酸转移核糖核酸3’端半分子反密码区的四核苷酸片段Cpm~1IpΨFpG的合成。先以Cpm~1pΨ为引物,GDP 为底物,在PNPase 和RNase T_1两个酶的协同作用下,生成Cpm~1lpΨpGp,对应用这两个酶进行合成的规律作了摸索与归纳,使合成Cpm~1IpΨpGp的产率达到90%以上,它再经固定化碱性磷酸单酯酶脱磷得到Cpm~1IpΨpG,脱磷率达到98%,此工作通过合成方法旁证了RNase T_1不水解m~1Ip-N 键。     

青霉素及头孢菌素的生物合成

引言一、青霉素G及青霉素V 第二次世界大战期间,由于英美工作者的巨大努力,取得了大量青霉素,确定了结构,并在可能情况下进行化学合成,用P.notatum及P.chrysogenum发酵得到的英国青霉素和美国青霉素不同,前者(青霉素F,2戊烯基青霉素)具有已烯酰侧链(图1中R=CH_3CH_2CH=CHCH_2),后者(青霉素G,苄青霉素)具有苯乙酰侧链([1]中R=C_6H_5CH_2),这种差别可     

利用太阳能电牧栏放养梅花鹿的试验初报

1979年3—12月在吉林省特产研究所茸鹿试验场,进行了利用太阳能电牧栏放养梅花鹿的试验。现将试验的有关情况报告如下。 材料与方法 (一)材料 1.太阳能供电器(见图1);DMQ-3-5型电牧器(见图2);DML-3型电牧器。 2.澳大利亚.BEV11型太阳能电牧器和交流电牧器(见图3)