N-甲基-N'-硝基－N－亚硝基孤对阴沟肠杆菌诱变作用的研究

营养缺陷型无论在微生物遗传学的研究或 诱变育种方面皆有着广泛的用途。由于亚硝基 孤(NTG）是一种诱变作用特别强的诱变剂, 所以应用也较为广泛,对于细菌的诱变作用的 研究已有不少报道［[1181,而对阴沟肠杆菌的诱变 作用尚未见到。本文以该菌为材料,对NTG 诱变剂的使用浓度与处理时间的选择,及应用 青霉素浓缩法与上述两因素的联合作用,以及 三者之间的关系作了研究。我们采用3个因素 （诱变剂浓度、处理时间、浓缩法的青霉素浓 度）,4个水平,16个组合的正交设计[21,研究 了最大限度地获得营养缺陷型的最适条件,对 所获得的营养缺陷型进行了鉴定,对其固氮活 性进行了分析,结果报道如下。     

血红铆钉菇氨基酸缺陷型菌株的紫外诱变选育

通过原生质体去细胞壁技术,以血红铆钉菇原生质体为材料,利用紫外线对其进行诱变处理,筛选出6株氨基酸营养缺陷型突变株,经稳定性试验确认1株突变株性状可以稳定遗传,利用生长谱法对缺陷型进行了鉴定、分析。结果表明,该菌株为L-半胱氨酸缺陷型菌株,为营养缺陷型突变株的筛选奠定了基础。     

嘧啶核苷类物质乳清酸产生菌的选育

以谷氨酸棒杆菌JSIM-201菌株为出发菌株,通过紫外线和甲基磺酸乙酯诱变处理,得到了一株尿嘧啶营养缺陷型突变体U-12菌株,能以葡萄糖为碳源,硫酸铵为氮源,在发酵液中积累一种紫外吸收物质。对U-12菌株的发酵液分离提取结晶,经物理、化学分析鉴定,证明是乳清酸物质。发酵液中积累乳清酸8．6g/L。     

细菌感受态细胞摄取和分泌DNA的相关性研究I.含有质粒的枯草芽孢杆菌自然感受态缺陷突变株的诱变和分离

以携带ｐＵＢ１１０质粒的枯草芽孢杆菌ＢＲ１５１菌株为出发菌株,利用亚硝基胍作诱变剂,直接在ＬＢ平板上进行诱变。从２９４９个菌落中筛选出一个转化频率低于出发菌株２～３个数量级的突变株,并对其营养缺陷型、ＵＶ的敏感性及Ｋｍ抗性和质粒进行了检测,确证其转化能力降低为自然感受态缺陷而非营养缺陷型的改变或重组缺陷所致     

紫外诱变筛选海洋红酵母S8的尿嘧啶缺陷型菌株

本课题组从海南天然海域筛选到一株高产类胡萝卜素的海洋红酵母菌株S8,该菌株对鱼无毒害,并与鱼共生,欲将其应用于盐诱导表达外源蛋白的海洋红酵母工程菌的构建。本研究利用紫外诱变筛选的方法处理S8菌株,通过统计其UV致死率、5-氟乳清酸致死率等筛选S8的尿嘧啶营养缺陷型突变株。研究结果表明,供试菌株通过紫外线诱变、5-氟乳清酸致死和回复突变率的实验筛选,共获得16株稳定的尿嘧啶缺陷型突变株,突变菌株在基本培养基中培养了8d仍不能生长。选择了其中的一株ST5进行了产胡萝卜素能力的测定,结果表明,在同样的培养条件下,野生型S8菌株细胞生物产量可达87.55g/L,类胡萝卜素含量可达520μg/g,突变株ST5的细胞生物产量为85.45g/L,类胡萝卜素含量为512μg/g;ST5的产胡萝卜素能力方面与野生型S8无明显差异。因此,尿嘧啶缺陷型菌株ST5可为下一步海洋红酵母工程菌的构建提供受体菌。     

常压室温等离子体诱变选育花脸香蘑新菌株

花脸香蘑作为一种营养丰富、菇型美观的珍稀食用菌,具有良好的开发利用价值。利用常压室温等离子体（ARTP）技术对野生花脸香蘑菌株610双核菌丝片段进行了诱变处理。利用拮抗试验进行了诱变菌株初筛。通过连续传代培养,自然淘汰劣势菌株并获得诱变效应稳定的48个菌株。综合平板培养和基于ISSR和SSR联合遗传多样性分析的结果,筛选出7个诱变菌株与出发菌株共同进行出菇比较试验。出菇试验及子实体蛋白和氨基酸营养分析的结果显示：诱变菌株Ls2和Ls3为筛选出的花脸香蘑优质高产新菌株。诱变菌株较出发菌株生物学效率分别提高10.27%和14.75%,总氨基酸含量、必需氨基酸含量以及氨基酸评分等指标也均显著高于出发菌株,品质提升效果极显著。     

植物乳杆菌荚膜缺陷型菌株的诱变选育

以自主分离和鉴定的产荚膜多糖植物乳杆菌C88为出发菌株,采用亚硝基胍诱变、墨汁负染和显微镜观察筛选获得一株荚膜缺陷型突变株,命名为植物乳杆菌C88M3,经多次传代突变菌株具有良好的遗传稳定性。通过16SrDNA序列分析、菌株生长曲线和RAPD分析比较了野生型菌株和荚膜缺陷型菌株在遗传特性和产荚膜情况方面的差异。通过化学诱变方法获得了乳杆菌荚膜缺陷型菌株,对进一步研究荚膜多糖在乳杆菌益生性中的功能和作用机制具有重要意义。     

里氏木霉RutC30常温常压等离子体（ARTP）诱变筛选pyr4基因缺陷型菌株及转化系统的建立

以里氏木霉Trichoderma reesei重要工业生产菌RutC30为出发菌株,通过等离子体（ARTP）诱变筛选,以5-氟乳清酸（5-FOA）和尿苷（Uridine）进行筛选,获得一株pyr4基因缺陷株RutC30ΔU3。用含有野生型里氏木霉pyr4基因的互补质粒转化突变株,可回复野生性状。经测序发现其pyr4基因在核酸序列多个位点发生突变,其中包括两个错义突变和一个移码突变,从而导致乳清酸核苷-5′-磷酸脱羧酶失活。经遗传稳定性研究分析,传代5次后仍保持良好的尿苷依赖性、去葡萄糖阻遏以及高产纤维素酶特性。经实验筛选获得了pyr4基因缺陷菌株可作为基因表达系统的受体菌株,建立了以尿苷营养缺陷为筛选标记的木霉转化系统。     

啤酒酵母呼吸缺陷型诱变形成机制初探

本文以两株不同的啤酒酵母(S.cerevisiae)作出发菌株,用溴化乙锭(10—100μg/ml)作诱变剂,诱变呼吸缺陷型。发现在非生长条件下,EB诱变呼吸缺陷型过程中出现回复现象。这一现象可被咖啡碱有一定程度的抑制,而在生长条件下EB诱变过程中未发现此现象。但当用KCN处理时,则得到了类似于非生长条件下的诱变结果。因而,推测呼吸缺陷型形成过程中可能存在一中间态过程[ρ~-]~*。呼吸缺陷型的形成过程可用ρ~ [ρ~-]~*→ρ~-表示。这是一动态过程。加入一定量的放线菌酮、氯霉素处理时,对诱变动力学曲线没有发现有影响,但培养酵母所用葡萄糖浓度不同时,对其诱变结果有一定的影响。     

双向复合磁场在诱变育种中增变作用的研究

Norcardiasp HD9611经双向复合磁场 +UV复合诱变处理 ,与单纯UV处理的结果相比 ,其诱变致死率和营养缺陷型突变率均有明显提高 ,并且经双向复合磁场 +UV复合诱变处理所筛选出的菌株酶活比单纯UV处理的对照菌株平均酶活相对提高17.2 %。     

放线菌的种间基因重组初步报告

金霉素、土霉素、红霉素和新生霉素的生产菌种,分别经过诱变因素处理后,获得了各种营养缺陷型,将配对两营养缺陷型混合接种在液体基本培养基后,能迅速和清楚地看到异核菌丝体的形成,从而可以更简便和确切地测定种间异核现象的适合性和种间杂种的获得。种间原养型菌株经传代分离后,很少发现选择性标雷己基因的分离现象。从金霉菌与杠霉菌重组所得的原养型菌株的形态特征和抗菌活性的初步分析结果来看,发现它们在分生孢子,浸没菌丝和斜面培养特征上表现为中间型。抗菌素柢上层析生物显影赭果观察到有类似两野生型的两种抗菌物质,井有包括野生型的和鞍野生型为广的抗菌谱,因而基本上证明了种间原养型菌株,在这些遗传性状方面发生了基因重组,至于新抗菌素的理化性状,尚待进一步研究。     

赖氨酸高产菌株选育的基础研究

以本实验室提供的谷氨酸棒状杆菌为出发菌株,经紫外线或硫酸二乙酯(DES)诱变处理,共检出营养缺陷型12株,并进行鉴定,从中筛选出赖氨酸的高产菌株,且对其进行发酵产酸试验。本文研究旨在选育赖氨酸的高产菌株,并研究适宜的发酵工艺,以提高产酸率,降低生产成本。     

肌苷菌核酸代谢关键酶缺失和形成选育腺苷菌的研究

以肌苷产生菌Bacillus Subtilis JSIM-1019为出发菌株,根据B.subtilis核酸代谢理论设计不同筛选模型,用物理、化学诱变剂对亲株进行诱变处理,先后有序地获得不同关键酶的缺失或回复即特殊的营养缺陷型以及抗某些代谢类似物的突变株,解除终产物对代谢物的抑制和阻遏,获得了几株黄嘌呤营养缺陷型并对8氮鸟嘌呤具有抗性的突变株X-13等,获得的突变株经单菌分离后得到X-13-4,36℃培养72h在培养基中最高积累12．43g／L腺苷。     

D-核糖生产菌的原生质体诱变及其发酵培养

目的:筛选出莽草酸、转酮醇酶双重营养缺陷型的D-核糖生产菌枯草芽胞杆菌,以提高D-核糖的产量。方法:采用化学诱变剂乙基磺酸甲烷(EMS)对野生型D-核糖生产菌的原生质体进行诱变,并从D-核糖合成途径对发酵培养基进行优化设计。结果:摇瓶发酵D-核糖平均产量为52.2g/L;获得的B.sems-10菌株具有良好的遗传稳定性,D-核糖产量高达67.5g/L。结论:通过对D-核糖生产菌原生质体的EMS诱变,筛选出了高产、遗传性状稳定的营养缺陷型B.sems-10菌株,为进一步提高产量奠定了基础。     

枯草杆菌JSIM-1018糖代谢突变株积累D-核糖研究

从收集的Bacillus,Brevibacterum,Corynebacterium,Pseudomonas,Arthrobacter等属菌种中进行D-核糖产生菌的筛选,对其中BacillusSM-18菌株用紫外线和甲基磺酸乙酯诱变,选育到莽草酸营养缺陷型突变株JSIM-1018．发酵产物经物理、化学鉴定为D-核糖．某些有机氮源如酵母粉、玉米浆、牛肉膏、蛋白陈以及某些芳香族氨基酸对突变株积累D-核糖有促进作用。在以葡萄糖为碳源的培养液中,摇瓶发酵D-核糖最高可达929／L,3000L发酵罐中     

米曲霉尿嘧啶营养缺陷型突变体筛选及转化体系建立

米曲霉(Aspergillus oryzae)是一种十分重要的工业微生物，但由于其菌丝体和孢子均含有多个细胞核，并且对多种抗性药物具有抗性，导致其遗传转化和分子生物学研究较其他模式丝状真菌困难。目前米曲霉遗传转化主要采用营养缺陷型作为筛选标记。尿嘧啶营养缺陷型是米曲霉转化中最常用的一种营养缺陷型标记，其筛选标记基因pyrG编码乳清酸核苷-5′-磷酸脱羧酶为尿嘧啶的前体尿苷合成所必需。本研究以米曲霉3.042为背景，利用紫外线诱变和5-氟乳清酸(5-FOA)胁迫筛选获得5株尿嘧啶营养缺陷型菌株，经DNA测序5株菌株均为pyrG基因不同位点突变，确定为尿嘧啶营养缺陷型。以筛选到的尿嘧啶营养缺陷型菌株为背景，利用农杆菌介导的米曲霉转化系统，成功构建了米曲霉尿嘧啶营养缺陷型为筛选标记的农杆菌转化体系。     

等离子体诱变灵芝选育高产纳米硒菌株

本研究应用介质阻挡放电（DBD）等离子体对一种富硒灵芝的原生质体进行诱变,并筛选出高产纳米硒菌株。通过实验,得到优化的等离子体放电条件,如：电压15.6kV、电流1.8mA、放电频率1.8kHz、处理2.5min等,在此条件进行诱变处理,通过随机扩增多态性DNA标记（RAPD）法鉴定,筛选出6株突变菌株。对突变菌株进行传代培养,富硒培养测定菌丝体中硒含量发现突变菌株（H10）与出发菌株相比,菌丝体中纳米硒含量提高了大约30%,从而得到富硒的优良突变菌株。本研究为灵芝提供了一种方便可行的诱变方法,并为灵芝纳米硒相关产品的开发和应用提供了优良菌株。     

费氏丙酸菌维生素B_1营养缺陷型菌株的诱变选育

在丙酸发酵过程中,乙酸为主要副产物,维生素B1与乙酸合成途径相关,筛选维生素B1营养缺陷型突变株有助于降低乙酸的合成,提高丙酸的产量。以费氏丙酸菌IFFI.10019作为出发菌株,经过紫外线诱变处理,筛选育种获得维生素B1营养缺陷型费氏丙酸菌二株,其中Pf007菌株的丙酸产量由原来的1.1 g/L提高到2.1 g/L,提高率达到91%。     

肌苷菌核酸代谢关键酶缺失和形成选育腺苷菌的研究*

以肌苷产生菌BacillusSubtilis JSIM 1 0 1 9为出发菌株 ,根据B. subtilis核酸代谢理论设计不同筛选模型 ,用物理、化学诱变剂对亲株进行诱变处理 ,先后有序地获得不同关键酶的缺失或回复即特殊的营养缺陷型以及抗某些代谢类似物的突变株 ,解除终产物对代谢物的抑制和阻遏 ,获得了几株黄嘌呤营养缺陷型并对 8氮鸟嘌呤具有抗性的突变株X 1 3等 ,获得的突变株经单菌分离后得到X 1 3 4 ,36℃培养 72h在培养基中最高积累 1 2 4 3g/L腺     

枯草杆菌JSIM—1018糖代谢突变株积累D—核糖研究

从收集的Bacillus,Brevibacterum,Corynebacterium,Pseudomonas,Arthrobacter等属菌种中进行D-核糖产生菌的筛选,对其中BacillusSM-18菌株用紫外线和甲基磺酸乙酯诱变,选育到莽草酸营养缺陷型突变株JSIM-1018．发酵产物经物理、化学鉴定为D-核糖．某些有机氮源如酵母粉、玉米浆、牛肉膏、蛋白陈以及某些芳香族氨基酸对突变株积累D-核糖有促进作用。在以葡萄糖为碳源的培养液中,摇瓶发酵D-核糖最高可达929／L,3000L发酵罐中试D-核糖最高可达81．759／L,平均在64g／L以上,葡萄糖基本耗尽。