牛α—S1—酪蛋白—乙肝病毒表面抗原融合基因在转基因羊中的表达

利用ＤＮＡ重组技术,将牛α－Ｓ１酪蛋白调控区基因（１６ｋｂ的片段）与乙肝表面抗原基因拼接,构建了融合基因表达构件：λ１０６。构件经转基因技术转入山羊受精卵。待受精卵发育至成熟个体并分娩、泌乳,ＥＬＩＳＡ检测其乳汁中的ＨＢｓＡｇ,证明所构建的牛α－Ｓ１酪蛋白基因表达构件是可以在羊乳腺中表达乙肝表面抗原基因,并将其表达产物分泌到乳汁中。     

外源基因在转基因小鼠中遗传和表达的稳定性

通过显微注射将外源构件λ１０６（年α－Ｓ１酪蛋白基因调控区指导的乙肝病毒表面抗原基因表达构件）导入小鼠受精卵中,用ＰＣＲ－Ｓｏｕｔｈｅｍ方法进行外源基因的整合检测、ＥＬＩＳＡ法进行外源基因的表达检测,对４代转基因小鼠进行了跟踪测定,结果表明：的代转基因小鼠的整合率为５６％,原代雌鼠乳汁中转基因产物的表达率为１００％;传代跟踪基因的整合率不符合“单一位点随机整合”的假说,家系分析推测外源基因在受精卵     

牛α—sl酪蛋白基因序列指导htPA突变体小基因在小鼠乳腺中的表达

将包括α－sl酪蛋白基因的启动子、LAtPA小基因、α－sl酪蛋白基因下游调控序列的融合基因经显微注射至小鼠的受精卵中,获得了5只转基因阳性鼠,其中1只转基因阳性雌鼠乳清中LAtPA的含量为0．18αg/ml,说明构建的LAtPA小基因能够正确表达出有生物活性的LAtPA, 在酪蛋白基因调控序列的指导下在小鼠乳汁中表达。     

小鼠β-酪蛋白基因序列调控人t-PA突变体基因在小鼠乳腺的表达

为验证克隆的小鼠β－酪蛋白基因序列调控外源基因表达的能力,将人人t-PA突变体基因的信号肽－前肽编码序列用小鼠β－酪蛋白的信号肽编码序列替换,人t-PA突变体成熟肽cDNA融合到小鼠β－酪蛋白基因的第2外显子中,从而构建成旨在应用小鼠β－酪蛋白基因序列调控人t-PA突变体基因在小鼠乳腺中表达的载体。融合基因经显微注射到小鼠的受精卵中,285枚注射的受精卵移植到13只受体小鼠,经PCR和Southern杂交鉴定,42只出生小鼠中有12只为转基因阳性鼠。7只转基因阳性鼠乳汁中表达人t-PA突变体,最高表达水平为3．6593μg/ml,证明小鼠β－酪蛋白基因序列能够调控人t-PA突变体基因在转基因小鼠的乳汁中表达出具有生物活性的人t-PA突变体,为进一步制备了人t-PA突变体基因敲入小鼠模型提供了理论和实验依据。     

牛α-sl酪蛋白基因序列指导htPA突变体小基因在小鼠乳腺中的表达

将包括α－ｓｌ酪蛋白基因的启动子、ＬＡｔＰＡ小基因、α－ｓｌ酪蛋白基因下游调控序列的融合基 因经显微注射至小鼠的受精卵中,获得了５只转基因阳性鼠,其中１只转基因阳性雌鼠乳清中 ＬＡｔＰＡ的含量为０．１８μｇ／ｍｌ,说明构建的ＬＡｔＰＡ小基因能够正确表达出有生物活性的ＬＡｔＰＡ, 并且可在酪蛋白基因调控序列的指导下在小鼠的乳汁中表达。     

两种新型HBsAg基因的毕赤酵母表达载体构建及其表达

目的：从乙肝患者血清中发现2个有突变的乙型肝炎病毒株,从中扩增出HBsAg(乙肝表面抗原)基因,构建酵母表达载体,并在巴斯德毕赤酵母中表达,以鉴定这2个基因表达产物的活性。方法：利用PCR技术从乙肝患者血清中扩增出乙肝表面抗原基因．并将其连接到pPIC3．5K中,转化毕赤酵母,通过甲醇诱导,利用SDS-PAGE和ELISA检测表达的蛋白。结果：通过序列测定结果表明成功地构建了毕赤酵母表达载体,聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS—PAGE)和ELISA证明这2个基因在毕赤酵母中能有效表达。且表达产物均具有生物活性。结论：从实验结果发现乙肝表面抗原决定簇以外的少数氨基酸变化不影响其活性。因此可以利用这2个基因对乙肝表面抗原进行表达。     

连续3步基因抓捕构建牛αS1酪蛋白-人tPA杂合基因座

目的:构建一个利用牛αS1酪蛋白基因座完整的上下游调控序列指导人组织型纤溶酶原激活剂(tPA)基因组序列在乳腺特异性高效表达的牛αS1酪蛋白-人tPA杂合基因座。方法:采用连续3步基因抓捕的方法。首先,以pBR322载体作为骨架,插入预先无痕连接在一起的6个同源臂,构成能连续进行3次基因抓捕的抓捕载体;然后,在大肠杆菌内利用Red同源重组系统介导的缺口修复技术,第一步从含牛αS1酪蛋白基因座的细菌人工染色体(BAC)上亚克隆9 kb的牛αS1酪蛋白基因3'端侧翼序列到抓捕载体上,第二步从人tPA BAC上亚克隆17 kb的从起始密码子(ATG)到终止密码子(TGA)的人tPA基因组序列,第三步从牛αS1酪蛋白BAC上亚克隆20 kb的牛αS1酪蛋白基因5'端完整侧翼序列,并使这3个基因片段在抓捕载体上自动无痕地连接在一起,形成一个长约46kb的牛αS1酪蛋白-人tPA杂合基因座。结果:经过PCR扩增、限制性内切酶消化和序列测定验证,构建的杂合基因座中,原牛αS1酪蛋白基因组编码序列从起始密码子到终止密码子被人tPA基因组序列精确置换。结论:连续三步基因抓捕构建杂合基因座乳腺表达载体的技术,为乳腺生物反应器高效表达大载体的制备提供了探索性研究。     

牛αS1-酪蛋白5′调控序列驱动人α-LA基因与LacZ基因在牛乳腺上皮细胞中的表达

将牛αS1-酪蛋白5′调控序列约1.2 kb的片段,连接到含SV40启动子调控下β-半乳糖苷酶基因(LacZ)的PSV载体上,做为启动子,在其后连接0.76 kb的人α-乳白蛋白基因(α-LA),构建真核表达载体 αS1-LA-psv．采用组织块接种法,培养奶牛乳腺上皮细胞,经传代纯化后,对细胞接种存活率、群体倍增时间、生长曲线、形态学等生物学性状进行检测,用免疫荧光细胞染色法对培养的奶牛乳腺上皮细胞进行角蛋白18鉴定,结果表明,成功建立奶牛乳腺上皮细胞系,细胞传至20代以上时仍保持旺盛的增殖活力．将构建的真核表达载体 αS1-LA-psv 转染奶牛乳腺上皮细胞,培养24～120 h均检测到了β-半乳糖苷酶的表达;培养72 h检测到细胞中人α-乳白蛋白的表达,表达量约为0.64 g/L．实验结果表明,建立的奶牛乳腺上皮细胞系具有外源基因表达活性,得到的牛αS1-酪蛋白5′调控序列能作为启动子指导外源基因的表达,构建的真核表达载体能在体外培养的牛乳腺上皮细胞中同时表达人α-乳白蛋白和β-半乳糖苷酶．     

牛αS1-酪蛋白5＇调控序列驱动人α-LA基因与LacZ基因在牛乳腺上皮细胞中的表达

将牛αS1-酪蛋白5＇调控序列约1．2kb的片段,连接到含SV40启动子调控下β-半乳糖苷酶基因（LacZ）的PSV载体上,做为启动子,在其后连接0．76kb的人α-乳白蛋白基因（α-LA）,构建真核表达载体αS1-LA-psv．采用组织块接种法,培养奶牛乳腺上皮细胞,经传代纯化后,对细胞接种存活率、群体倍增时间、生长曲线、形态学等生物学性状进行检测,用免疫荧光细胞染色法对培养的奶牛乳腺上皮细胞进行角蛋白18鉴定,结果表明,成功建立奶牛乳腺上皮细胞系,细胞传至20代以上时仍保持旺盛的增殖活力．将构建的真核表达载体αS1-LA-psv转染奶牛乳腺上皮细胞,培养24～120h均检测到了β-半乳糖苷酶的表达;培养72h检测到细胞中人α-乳白蛋白的表达,表达量约为0．64g／L．实验结果表明,建立的奶牛乳腺上皮细胞系具有外源基因表达活性,得到的牛αS1-酪蛋白5＇调控序列能作为启动子指导外源基因的表达,构建的真核表达载体能在体外培养的牛乳腺上皮细胞中同时表达人α-乳白蛋白和β-半乳糖苷酶．     

牛β-酪蛋白基因控制的人凝血Ⅸ因子基因在小鼠乳腺组织中的表达调控

构建牛β 酪蛋白基因控制的人凝血Ⅸ因子 (hFⅨ )乳腺组织特异性表达载体pCⅨm,pCiⅨ ,pCⅨ和报告基因 (LacZ)乳腺表达载体 pCiLacZ ,pCLacZ ,利用Stearylamine(SA)阳离子脂质体包埋 5种载体 ,通过尾静脉注射的方法直接转染哺乳期母鼠的活体组织 .在DNA ,mRNA以及蛋白质水平对实验小鼠的检测结果表明 :转染处理后hFⅨ基因和LacZ基因在小鼠乳腺获得表达 ,hFⅨ蛋白在乳汁中的最高分泌表达量为 80 .2 8ng/mL ,其中 85 %以上已经羧基化并具有生物学活性 ;对 5种载体表达调控的研究证实牛β_酪蛋白基因 5′端 2 .0kb的片段能够驱动人凝血Ⅸ因子基因在小鼠乳腺组织中分泌表达 ,β_酪蛋白基因内含子 1能够提高Ⅸ因子基因在乳腺组织中的表达水平 ,并能影响该基因表达的组织特异性 ;和hFⅨcDNA相比 ,hFⅨ基因自身的内含子 1能够提高该基因在活体乳腺组织中的表达水平 3倍以上     

牛αS1-酪蛋白5'调控序列驱动人α-LA基因与LacZ基因在牛乳腺上皮细胞中的表达

将牛αS1-酪蛋白5′调控序列约1.2 kb的片段,连接到含SV40启动子调控下β-半乳糖苷酶基因(LaeZ)的PSV载体上,做为肩动子,在其后连接0.76kb的人仅α-乳白蛋白基凼(α-LA),构建真核表达载体αS1-LA-psv.采用组织块接种法,培养奶牛乳腺上皮细胞,经传代纯化后,对细胞接种存活率、群体倍增时间、生长曲线、形态学等生物学性状进行检测,用免疫荧光细胞染色法对培养的奶牛乳腺上皮细胞进行角蛋白18鉴定,结果表明,成功建立奶牛乳腺上皮细胞系,细胞传至20代以上时仍保持旺盛的增殖活力.将构建的真核表达载体αS1-LA-psv转染奶牛乳腺上皮细胞,培养24～120h均检测到了β-半乳糖苷酶的表达;培养72 h检测到细胞中人α-乳白蛋白的表达,表达量约为0.64 g/L.实验结果表明,建它的奶牛乳腺上皮细胞系具有外源基因表达活性,得到的牛αS1-酪蛋白5′调控序列能作为启动子指导外源基因的表达,构建的真核表达载体能在体外培养的牛乳腺上皮细胞中同时表达人α-乳白蛋白和β-半乳糖苷酶.     

牛aS1-酪蛋白基因5’-调节区的分子克隆

用牛αsl－酪蛋白cDNA作探针,从牛基因组文库中筛选出一段αsl－酪蛋白基因序列。由限制内切酶图谱和souther印迹分析可以确定其中含有完整的αs1-酪蛋白基因的5’调节区。     

利用TALE-TFs在小鼠成纤维细胞中激活β-酪蛋白基因启动子表达载体

目的利用TALE-TFs,在小鼠成纤维细胞中激活β-酪蛋白基因启动子,为检测β-酪蛋白基因启动子—目的基因表达框的表达结果,提供一种检测途径。方法将构建的TALE-TFs和β-酪蛋白基因启动子—Red报告基因质粒电转染进入小鼠成纤维细胞,通过荧光显微镜直接观察报告基因表达情况。结果与结论利用TALE人工转录因子,在小鼠成纤维细胞中能够激活β-酪蛋白基因启动子表达框,为替代乳腺上皮细胞表达验证系统提供了新的途径。     

牛αS1酪蛋白5′调控序列驱动报告基因 LacZ 在奶山羊乳腺上皮细胞中的表达

αS1酪蛋白是牛乳中含量最高的酪蛋白.本研究克隆了牛αS1酪蛋白5′调控序列约1.2 kb的片段,应用基因重组技术将其插入 lacZ 基因上游,构建真核表达载体gαs1p psv.胶原酶消化法对奶山羊乳腺上皮细胞进行了分离培养,并用免疫荧光法鉴定了乳腺上皮细胞. 将重组载体转染奶山羊乳腺上皮细胞,在细胞培养液中,转染后24 h可以检测到 lacZ 基因的表达,之后表达水平有逐渐升高的趋势,72 h开始降低,144 h降到最低;在细胞破碎液中,转染后24 h表达水平最高,之后表达水平有逐渐降低的趋势,144 h降到最低.转染细胞的第1代表达水平最高,随细胞传代表达水平降低,传到第3代时基本检测不到表达产物. 对转染后的细胞进行了β 半乳糖苷酶原位细胞染色. 实验证明,得到的牛αS1酪蛋白5′调控序列能指导外源基因在奶山羊乳腺上皮细胞中表达.     

牛αS1酪蛋白5′调控序列驱动报告基因LacZ在奶山羊乳腺上皮细胞中的表达

αS1酪蛋白是牛乳中含量最高的酪蛋白.本研究克隆了牛αS1酪蛋白5′调控序列约1.2kb的片段,应用基因重组技术将其插入lacZ基因上游,构建真核表达载体gαs1p-psv.胶原酶消化法对奶山羊乳腺上皮细胞进行了分离培养,并用免疫荧光法鉴定了乳腺上皮细胞.将重组载体转染奶山羊乳腺上皮细胞,在细胞培养液中,转染后24h可以检测到lacZ基因的表达,之后表达水平有逐渐升高的趋势,72h开始降低,144h降到最低;在细胞破碎液中,转染后24h表达水平最高,之后表达水平有逐渐降低的趋势,144h降到最低.转染细胞的第1代表达水平最高,随细胞传代表达水平降低,传到第3代时基本检测不到表达产物.对转染后的细胞进行了β-半乳糖苷酶原位细胞染色.实验证明,得到的牛αS1酪蛋白5′调控序列能指导外源基因在奶山羊乳腺上皮细胞中表达.     

牛αS1酪蛋白基因启动区的克隆和序列分析

牛αＳ１酪蛋白是牛奶蛋白的最主要成份。本研究利用λＥＭＢＬ３载体构建了牛基因组文库,并且从文库中分离克隆了牛αＳ１酪蛋白基因的启动区。利用自动测序仪,对牛αＳ１酪蛋白基因５′侧翼＋２９８～－１０８２的核苷酸顺序作了测定。经过与牛和其他物种的奶蛋白基因序列比较,推断了牛αＳ１酪蛋白基因的乳腺组织特异性转录因子和一般性核转录因子的结合位点。此外,本文还讨论了牛αＳ１酪蛋白基因启动区的利用前景。     

山羊β-酪蛋白基因启动子指导的转基因小鼠乳汁高效表达人凝血因子IX

为探讨应用转基因动物乳腺生物反应器高效表达人凝血因子IX(human clotting factor IX,hFIX)的可行性,构建了包括山羊β-酪蛋白基因启动子和外显子l、内含子1、外显子2共约6.7kb片段以及hFIX全长cDNA序列和部分经改造的内含子l的乳腺表达载体,通过转基因技术获得12个原代转基因小鼠(9♀,3♂),整合率为11.2%.经EuSA和western b1ot鉴定8只转基因母鼠乳汁中有hFIX的表达并拥有很高的凝血活性,其中一只的表达量高达52.9mg/L,其凝血活性亦高达279.2%.FISH实验表明不同的转基因小鼠外源基因整合于小鼠的不同染色体上.结果证明所构建的山羊β-酪蛋白基因启动子乳腺表达载体能有效指导hFIX基因在小鼠乳腺中高效表达,并能保持hFIX的生物活性.     

乳腺注射法表达人组织型纤溶酶原激活剂的研究

目的 :构建tPA乳腺定位表达载体 ,使其在牛乳汁中高效表达 ,观察目的基因表达的规律及其影响因素 ,为建立新型牛乳腺生物反应器提供理论基础。方法 :RT-PCR法克隆目的基因 ,通过酶切、连接、分离、纯化等方法构建含tPA-cDNA的乳腺定位表达载体 ;采用乳腺注射法将融合基因转入小鼠及牛的乳腺组织中。结果 :乳腺注射外源基因后 ,tPA可在小鼠和牛的乳汁中表达。结论 :乳腺注射法可使目的基因在乳腺组织中稳定地表达较长的时间 ,其表达量与显微注射法没有明显的差异 ,表明外源基因的表达不受转基因方法的影响。但tPA在牛乳汁中的表达量明显高于小鼠的表达量 ,提示不同动物的乳蛋白调控系统有一定的差异 ,可能受着不同的因素或调控系统的影响。     

尖体注射导入的人生长激素融合基因在小鼠乳腺中的暂态表达

以牛asl－酪蛋白基因的5′端及上游区3．4kb和3′端及下游区3．5kb作为调控元件,以人生长激素基因作为报告基因构建了融合基因,通过乳腺,心脏注射到小鼠体内,利用放射免疫分析方法（RIA）在泌小鼠的乳汁中检测到了表达的人生长激素,表明融合基因的构建是正确的。并由此建立了通过靶组织注射结合心脏注射对融合基因的构建无地自容伯快速简便方法,其中通过心脏注射而于乳腺获得特异性表达的实验结果尚未见报道。     

山羊与牛乳腺差异表达基因的筛选及半定量RT-PCR分析

山羊和奶牛具有非常相似的泌乳过程,但在产乳量和乳成分(脂肪和蛋白含量)之间存在很大的差异,而且山羊奶还具有特殊的膻味。本研究根据山羊和牛在基因编码序列上具有非常高的保守性原理,利用抑制消减杂交技术对3只西农萨能奶山羊和3头荷斯坦奶牛泌乳末期的乳腺组织进行差异表达基因分析。分别提取山羊和牛乳腺组织总RNA,分离mRNA并合成cDNA,以山羊乳腺组织cDNA作为测试,牛的乳腺组织cDNA作为对照。cDNA经RsaⅠ酶切后将测试组cDNA分成两组,分别衔接两种不同接头,再与对照组cDNA进行两次消减杂交及两次PCR反应,产物与T/A克隆载体连接,构建cDNA消减文库,并转染大肠杆菌进行文库扩增。随机挑选克隆经PCR鉴定发现有150个克隆具有200bp-1000bp插入片段,挑选50个差异片段不等的克隆进行测序及同源性分析,结果得到5个已知乳蛋白(αs2酪蛋白、β酪蛋白、К酪蛋白、α乳清白蛋白和β乳球蛋白)基因的编码序列和6个新的EST序列,EST序列已登录GenBank,登录号分别为EG588067、EG588068、EG588069、EG588070、EG588071和EG588072。通过半定量RT-PCR分析,发现β酪蛋白基因mRNA表达量在山羊乳腺中显著高于其在牛乳腺中的表达量,К酪蛋白在乳腺中的mRNA含量与其所表达的蛋白质在乳中含量存在很大差异,表明К酪蛋白虽然和其他酪蛋白具有相同的调控机制,但其在分泌和运输机制上与其他酪蛋白不同。