差示扫描量热法直接测定抗冻蛋白质溶液的热滞效应

文献上一直用显微镜观察法等测定抗冻蛋白的热滞效应,其冰晶量是靠观察晶核体积估算得得的,人为性很大,用并示扫描量热法直接测定沙冬青抗冻蛋白质溶液的热滞效应,通过熔融焓和冻结焓值准确地测定了冰晶含有量和热滞温度。同文献比较,沙冬青ＡＦＰ具有极高的抗冻活性,而且开创了一个新的有效的测量抗冻蛋白抗冻活性的途径。     

江浙蝮蛇毒酸性与碱性磷脂酶A_2溶液构象变化的差示扫描量热法研究

运用差示扫描量热法,在不同ｐＨ值的缓冲溶液内和各种浓度的碱土族氯化物溶液内,研究了来自江浙蝮蛇（ＡｇｋｉｓｔｒｏｄｏｎｈａｌｙｓＰａｌｌａｓ）毒的酸性与碱性磷脂酶外Ａ２（ＰＬＡ２）的热变性过程。得到表征这两种酶溶液构象变化的热力学参数。依据这些参数研究了两者的溶液构象及其变化。在ｐＨ４．５以下,分子净荷正电的这两种酶在溶液中不形成可热致伸展的有序构象;ｐＨ高于４．５时,Ａｓｐ和Ｇｌｕ的侧链羧基以负离子形式存在有利于有序构象的稳定。Ｈｉｓ是决定ＰＬＡ２活力和热稳定性的重要残基。磷酸根离子和这两种酶有结合作用而降低有序构象的热稳定性。碱土族阳离子除和这两种酶结合外,还以依赖于离子强度的方式复杂地影响酶的溶液构象,但其作用不完全是静电性的,是或多或少地随离子的不同而不同的。计算给出酸性ＰＬＡ２的△Ｈｃｄ．     

抗冻蛋白活性的差示扫描量热测定及其吸附-抑制机制

用差示扫描量热技术(DSC)测定了从黄粉虫(Tenebrio molitor)幼虫体内提取的抗冻蛋白(AFP)的活性,结果表明AFP活性随其浓度的增加及初始冰晶量的减少而增大,这与AFP对冰晶的吸附-抑制机制相一致。     

应用差示扫描量热法检测昆虫总蛋白的热滞活性

产生抗冻蛋白是寒带昆虫抵御低温的重要机制之一, 但检测其活性仍存在一些困难, 尤其对于个体较小的昆虫样品。为了探索差示扫描量热法是否适于检测昆虫总蛋白的热滞活性, 本研究利用差示扫描量热法对黄粉虫Tenebrio molitor幼虫的总蛋白和血淋巴分别进行了热滞活性检测。结果表明： 黄粉虫总蛋白的热滞活性（0.49~0.98℃）要低于血淋巴（2.54~4.34℃）。通过这种方法, 进一步检测了3种在内蒙古大兴安岭林区采集到的越冬昆虫： 稠李巢蛾Yponomeuta evonymallus幼虫、 舞毒蛾Lymantria dispar卵和落叶松八齿小蠹Ips subelongatus成虫。结果发现, 它们都存在热滞活性, 其中稠李巢蛾的热滞活性为0.34~0.43℃, 舞毒蛾的热滞活性为0.35~0.42℃, 落叶松八齿小蠹的热滞活性为0.37~0.40℃, 说明这3种昆虫能以产生抗冻蛋白的方式作为越冬策略之一。本研究表明通过差示扫描量热法检测昆虫总蛋白是否存在热滞活性来判断抗冻蛋白的存在是可行的。     

无机离子和有机溶质对α-淀粉酶热稳定性的影响

长期以来,如何提高酶蛋白的热稳定性是分子生物学、生物工程学、化学工业等所关注的重要研究课题之一。分析了多种无机离子、糖和氨基酸对枯草杆菌液化型α-淀粉酶热稳定性的影响以及它们的共存效应,获取了一些对相关研究领域具有理论参考和实际应用价值的实验结果。在无机盐中,1mmol/L的钙离子或50mmol/L的钠离子能显著地提高该酶的热稳定性;酸性氨基酸和碱性氨基酸表现出相反的结果：酸性氨基酸具有明显的增强作用,碱性氨基酸却使之降低;随着糖浓度的增加（0～1000mmol/L）,该淀粉酶的热稳定性呈线性增高;当钠离子或钾离子与某些氨基酸或糖类共同存在时,对该淀粉酶的热稳定性表现出了明显的协同作用。试图通过检测酶蛋白分子荧光强度改变来反映该酶的热稳定性变化,其结果是：随着温度的改变,酶蛋白的荧光强度的衰减与残余酶活性之间显示了良好的相关性。从而说明热环境使酶蛋白分子的螺旋结构发生变化而失活,某些溶质的存在可能是通过作用于蛋白质分子的立体结构而影响该酶的热稳定性。     

南极细菌胞外多糖溶液冻结特性的差示扫描量热研究

采用差示扫描量热法,测定几种南极细菌胞外多糖(简称,EPSs)溶液的结晶、熔融、焓转变以及水合性质等冻结特性,分析了EPSs的浓度和分子量与其抗冻活性的关系.结果表明,在溶液冻结过程中,仅0.25%的Pseudoalteromonas sp.S-15-13 EPSs(分子量,6.2×104Da)可抑制冰核形成,溶液冻结温度较纯水的降低(1.07±0.62)℃;溶液的冻结焓降低说明冰核生长变缓,冰晶形成细小,0.125%的Shewanella sp.5-1-11-4 EPSs(分子量,1.2×103Da)和Moritella sp.2-5-10-1 EPSs(分子量,3.0×103Da)冻结焓分别较纯水的降低17.15%和29.13%,S-15-13 EPSs在0.125%～0.5%的范围内可降低冻结焓,0.125%时冻结焓较纯水的低30%,其不冻水含量为(0.292 ±0.05) g/g.在冰晶熔化过程中,几种EPSs均可降低溶液熔融温度和熔融焓,促进冰晶熔化,使冰晶细小;4.0%的5-1-11-4 EPSs、2-5-10-1 EPSs和0.5% S-15-13 EPSs的熔融温度较纯水的分别降低(2.70±0.15)℃、(2.30±0.39)℃和(4.66±0.42)℃.研究结果阐明EPSs可以通过改变菌体周围水的冻结特性,以抵御冰晶对微生物的损伤,大分子量EPSs对冰晶的抑制作用强于低分子量的.     

米根霉α-淀粉酶热稳定性的理性设计

真菌α-淀粉酶被广泛应用于麦芽糖浆生产工业,但其热稳定性普遍较差,在制糖工艺中增加了由于酶活力损失而引起的追加生产成本。在充分研究了热稳定性对于真菌α-淀粉酶应用于工业生产的重要性的基础上,为提高米根霉α-淀粉酶(ROAmy)的热稳定性,基于酶蛋白B-factor分析和分子动力学模拟,利用重叠PCR技术分别对ROAmy中的3个氨基酸残基G128、K269和G393进行了单点突变及组合突变。结果表明,所获得的7个突变体均比原酶具有更好的热稳定性,其中效果最好的为组合突变体G128L/K269L/G393P,其在55℃下的热失活半衰期(t_(1/2))约为原酶的5.63倍。同时,该突变体的最适温度由50℃提高到了65℃,最大反应速率(V_(max))和催化效率(k_(cat)/K_m)分别提高了65.38%和99.86%。通过蛋白结构功能比较分析,发现氢键数目的增多或脯氨酸在特殊位置中的引入可能是突变体热稳定性得到提高的主要因素。     

使用差示扫描量热仪测定抗冻蛋白热滞活性方法的研究

抗冻蛋白因具有独特的抗冻活性而被研究者广泛关注。但是,目前抗冻活性的检测没有一个标准的、统一的检测方法,这严重制约了该方面的研究进展。作者详细研究了采用差示扫描量热仪测定样品热滞活性的方法,并对该方法的稳定性、专一性和精密度进行评价。结果显示,采用差示扫描量热仪测定样品的热滞活性具有较高的稳定性、重复性和精密度。因此,差示扫描量热仪法可以作为一种通用的方法进行抗冻蛋白热滞活性的检测。     

喜树碱对胰α-淀粉酶部分性质的影响

喜树碱对胰α-淀粉酶有明显的抑制作用,其抑制类型为反竞争性抑制。利用紫外差光谱,研究发现喜树碱能改变胰α-淀粉酶的空间结构;利用荧光光谱研究了喜树碱与胰α-淀粉酶的相互作用,计算了二者的结合常数KA=2.78×106(mol/L)-1和结合位点数n=1.2477。其结果对喜树碱的进一步开发具有一定的指导意义。     

Pb2+、Cd2+和Ce3+对猪胰α-淀粉酶活性的影响

分别研究了Pb2+、Cd2+和Ce3+对Ca(Ⅱ) α-淀粉酶活性影响及对其Ca2+的竞争作用.结果表明三种金属离子低浓度情况下(0.5～5 mmol/L)对α-淀粉酶具有激活现象,而较高浓度则抑制酶活力.Pb2+、Cd2+和Ce3+竞争置换α-淀粉酶中Ca2+能力的大小是:Pb2+＞Cd2+＞Ce3+,其抑制酶活作用大小:Pb2+＞Cd2+＞Ce3+.     

金属离子对重组深渊滕黄单胞菌低温α-淀粉酶LamA的活性和稳定性影响

【背景】深渊藤黄单胞菌XH031 (Luteimonas abyssi XH031)是从深海分离到的一株具有很强淀粉降解能力的细菌,前期实验显示其α-淀粉酶LamA在低温环境下仍能保持较高酶活力。若能够提升其热稳定性,会有更好的应用前景。【目的】分析钙离子的存在对LamA热稳定性的影响,并通过钙离子结合位点的关键氨基酸的定点突变,初步明确其作用机制。【方法】在不同的离子条件下检测LamA的热稳定性,利用生物信息学方法预测可能影响钙离子结合及耐热性的氨基酸位点,对目的氨基酸进行定点突变,表达和纯化突变蛋白,并进行功能鉴定。【结果】钙离子明显提高了LamA的热稳定性:在未添加钙离子时,于65°C处理30 min已完全失活;而在5 mmol/L钙离子条件下,于65°C处理30 min后仍具有36%的酶活力。对预测位点进行定点突变后,突变蛋白D200R和H233D/M234C完全失活;N120D、Q185E和T224D活性降低。在未添加钙离子时,突变蛋白稳定性受高温影响程度与野生型差别不大;而在钙离子条件下,N120D在65°C时的酶活力仅为野生型的27.8%,推测位点Asn120与钙离子的结合能够稳定低温酶LamA在较高温度下的结构。【结论】初步明确了钙离子可提升低温α-淀粉酶LamA的热稳定性,为今后相关酶类的工程改造提供理论基础。     

Pb2+、Cd2+和Ce3+对猪胰α-淀粉酶活性的影响

分别研究了Pb²⁺、Cd²⁺和Ce³⁺对Ca(Ⅱ) α-淀粉酶活性影响及对其Ca²⁺的竞争作用.结果表明三种金属离子低浓度情况下（0.5～5 mmol/L）对α-淀粉酶具有激活现象,而较高浓度则抑制酶活力.Pb²⁺、Cd²⁺和Ce³⁺竞争置换α-淀粉酶中Ca²⁺能力的大小是：Pb²⁺＞Cd²⁺＞Ce³⁺,其抑制酶活作用大小：Pb²⁺＞Cd²⁺＞Ce³⁺.     

聚乙烯醇与聚丙烯酸对中温α-淀粉酶的影响

研究了聚乙烯醇（ PVA）和聚丙烯酸（ PAA）对α-淀粉酶活性的影响,并采用荧光光谱法和圆二色谱法分析了PVA和PAA对α-淀粉酶内源性荧光和二级结构的影响。结果表明,PVA和PAA均能使α-淀粉酶的活性降低,并能改变α-淀粉酶的内源性荧光和二级结构,且PVA和PAA的浓度越高,α-淀粉酶活性降低越大,酶的内源性荧光和二级结构的变化也越大。     

Sul folobus sol fataticus P2嗜热嗜酸α-淀粉酶在大肠杆菌和毕赤酵母中的表达

通过PCR方法从Sulfolobus solfataticus P2中扩增到2．6kb的α-淀粉酶基因（SS01172）,将其分别克隆到表达载体pET32a（＋）和pPICZaA,并在E．coliRosetta和Pichia pastoris GS115中进行表达。结果表明α-淀粉酶基因在Rosetta中得到了高效表达,酶活为143．466U／mL;而在GS115中表达量稍低,发酵液酶活力为98．102U／mL。     

α-淀粉酶AmyP对有机溶剂和表面活性剂的耐受性

AmyP是一个来自海洋宏基因组文库的α-淀粉酶。AmyP不仅对log Pow值从4．5到-0．24的各种有机溶剂均具有良好的耐受性,而且能被正辛醇、正辛烷和甲苯提高活性为139％、118％和119％。正辛醇影响AmyP的淀粉水解产物、葡萄糖的含量增加、麦芽三糖的含量降低。非离子型的表面活性剂Tween-20、Tween-80和Triton X-100存在条件下,AmyP的活性反而有不同程度的提高。但是,AmyP对阴离子型的SDS和阳离子型CTAB的耐受性稍差。结果表明AmyP是一个同时具有有机溶剂和表面活性剂耐受性的新型α-淀粉酶。     

黄原胶对α-淀粉酶耐热性及其在热变性过程中构象变化的影响

黄原胶（ＸＧ）对α－淀粉酶（ＢＦ－７６５８）具有较好的热稳定作用,０．２％黄原胶α－淀粉酶液７５℃处理７分钟残余酶活为２５．８％,而对照酶液几乎完全失活。酶分子立体构象的变化与其相应的生物活力有着一定的联系。加胶酶在相同条件的部分热变性过程中,酶活损失较少,其分子构象的变化程序也较弱。     

地衣形芽孢杆菌热稳定α-淀粉酶基因的分子克隆及其在枯草杆菌中的表达

以E.coli噬菌体λ EMBL 3为载体,用鸟枪法将地衣形芽孢杆菌的热稳定α-淀粉酶基因克隆到λ噬菌体的基因组中。携带α-淀粉酶基因的杂种噬菌体λ pAmy_αL16的DNA,经限制性内切酶HindⅢ水解后,被亚克隆到枯草杆菌的质粒pNQ 122上,并得到了表达。通过重转化作用和物理图谱分析,证明α-淀粉酶基因位于3.9 kb的Hin dⅢ DNA限制片段上。 转化子枯草杆菌(pAmy_αL41)产生的α-淀粉酶的热稳定性、最适反应温度等与亲本菌株一致。α-淀粉酶的分子量和等电点也与原菌株相同。