PT8A的粘膜免疫佐剂活性初步研究

本研究发现位于大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位(heat-labile enterotxin B subunit,LTB)的8肽(octapetptide,PT8A)具有一定的佐剂活性。我们用PT8A联合人手足口病病毒的VP1(EVP1)鼻腔免疫Balb/c小鼠,通过间接ELISA法检测小鼠血清中的特异性EVP1抗体滴度,检测结果显示PT8A+EVP1组相比PBS组和EVP1组有明显佐剂活性,初步验证了PT8A的佐剂活性。对PT8A和LTB蛋白的佐剂活性进行比较研究,结果显示,PT8A的佐剂活性明显弱于LTB,有待进一步提高。通过对PT8A免疫原性进行检测分析发现,PT8A的免疫原性明显减弱,初步确定PT8A在保留佐剂活性的同时自身免疫原性明显减弱,具有进一步开发为粘膜免疫佐剂候选分子的潜力。     

柯萨奇病毒A组16型衣壳蛋白VP1的原核表达及初步活性测定

目的:原核表达柯萨奇病毒A组16型(CVA16)衣壳蛋白VP1,以便于研制血清学检测试剂。方法:在基因库中钓取CVA16-VP1的全长序列,采用PCR逐步合成法合成其全长基因,测序正确后克隆到表达载体pET28a(+)中,构建重组表达质粒pET28a(+)/VP1,转化大肠杆菌BL21,IPTG诱导表达,利用Ni2+亲和层析柱对重组蛋白进行纯化;建立捕获免疫酶联法检测IgM抗体,检测20份手足口病阳性血清和30份阴性血清,评价重组抗原的灵敏度和特异性;采用CVA16全病毒免疫的抗小鼠血清进行Western印迹。结果:重组CVA16-VP1蛋白在大肠杆菌中获得高效表达;用重组蛋白抗原检测,20份手足口病患儿阳性血清中有4份阳性,其中1份同时为肠道病毒71型(EV71)VP1阳性,30份阴性血清无反应。结论:实现了CVA16-VP1的高效表达,初步结果显示重组蛋白具有较好的抗原性,为柯萨奇病毒A组16型诊断试剂的研究奠定了基础。     

淋球菌nspA和大肠杆菌ltB融合基因的构建、表达及鉴定

通过基因工程的方法构建奈瑟氏淋球菌表面蛋白A(Neisseria gonorrhoeae surface protein A,nspA)和大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位(B subunit of Escherichia coli heat-labile enterotoxin,ltB)融合基因的原核表达载体,对其进行表达与鉴定,为后续融合蛋白LTB-NspA的生物活性分析及其作为淋球菌粘膜免疫疫苗的研究奠定基础.用PCR法从标准菌株分别扩增出nspA、ltB基因,用重组PCR法通过接头将ltB与nspA融合,将其插入pET-30a中,转入BL21中表达.经测序、SDS-PAGE和Western blot分析,证实成功构建了1tB-nspA融合基因的原核表达载体,并在BL21中表达.ltB-nspA融合基因的成功表达,为进一步研究其生物活性及淋球菌粘膜免疫疫苗的研究奠定了一定基础.     

重组大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位基因表达系统构建

从E .coli 4 4 815株基因组DNA中扩增不耐热肠毒素B亚单位 (LTB)基因并分析了核苷酸序列 ,构建pET32a的LTB表达载体 ,在E .coliBL2 1DE3宿主菌中用不同浓度的IPTG诱导表达 ,采用SDS PAGE鉴定表达产物。克隆的LTB基因与报道的核苷酸和氨基酸序列同源性分别为 99.12 %～ 99.71%和 97.5 8%～ 99.19% ,pET32a LTB BL2 1DE3系统表达的rLTB量约占细菌总蛋白的 30 %。     

猪细小病毒VP2与大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位在干酪乳杆菌表面共表达

将分别编码猪细小病毒(PPV)主要免疫保护性抗原VP2蛋白与大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位(LTB)基因插入乳酸杆菌细胞表面表达载体pPG中, 成功构建了重组表达载体pPG-VP2-LTB, 将其电转化干酪乳杆菌Lactobacillus casei 393, 获得了表达猪细小病毒VP2-LTB融合蛋白的重组乳酸菌表达系统, 经2%乳糖诱导, SDS-PAGE和Western-blot检测表明, 有大小约78 kD的蛋白得到了表达, 具有与天然病毒蛋白一样的抗原特异性, 全细胞ELISA结果表明, LTB同     

大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位的克隆、表达及初步纯化

为研究大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位（LTB）的佐剂活性。从大肠杆菌中调出LTB的原始基因,将该基因克隆、构建pET21b—LTB表达载体、转化大肠杆菌B121（DE3）进行表达,并对表达产物进行初步纯化;经DNA测序、SDS—PAGE、ELISA检测,结果表明成功构建了能够稳定表达可溶性LTB的菌株,并获得初步纯化LTB的方法。为今后LTB的研究及应用奠定了基础。     

柯萨奇病毒A组16型灭活抗原对小鼠免疫保护作用的研究

为了研究柯萨奇病毒A组16型(Coxsackievirus A16,CVA16)灭活抗原在小鼠体内所产生免疫保护作用效果,我们选用CVA16临床分离株521-01T,在Vero细胞中进行大量培养,并对培养产物进行甲醛灭活及超速离心纯化。SDS-PAGE和Western blot对纯化的灭活病毒纯度及性质进行初步分析。Al(OH)3+CVA16及单独CVA16抗原,分别经皮下注射免疫雌性ICR小鼠;相同免疫途径、剂量于第14和28d加强免疫2次。ELISA法检测CVA16特异性血清IgG抗体滴度;微量中和试验法鉴定血清中和抗体滴度;酶联免疫斑点试验(ELISPOT)检测特异性T淋巴细胞的活化。对Al(OH)3+CVA16抗原免疫组母鼠所产仔鼠进行脑腔攻毒,检测母传抗体对新生乳鼠的保护作用。结果显示,Al(OH)3+CVA16灭活抗原在小鼠体内能诱生高滴度的特异性抗体,3次免疫后产生的特异性血清IgG抗体滴度最高可达1∶1×105(P=0.000),中和滴度高于1∶256。同时,该抗原还可以诱导特异性T淋巴细胞的活化。以1 000LD50的病毒量脑腔接种48h内新生乳鼠的病毒攻击实验显示,该母传抗体对新生乳鼠具有100%的保护。这一结果表明该灭活CVA16病毒抗原具有较好的免疫原性及保护性,为CVA16灭活疫苗的研究及评价体系提供了参考。     

川金丝猴柯萨奇病毒的分离鉴定

利用细胞培养方法从长春某动物园送检的死亡川金丝猴心脏中分离获得1株柯萨奇病毒,经系统的形态学、理化学、动物回归试验和RT-PCR扩增,符合柯萨奇B型病毒特征;进而对其VP1基因部分序列和特异性血清抗体分析,证明所分离的病毒为柯萨奇B3型病毒.这是国内外首次从金丝猴分离到该病毒,暂命名为CVB/SGM-05.     

柯萨奇病毒B3型3D蛋白抗体的制备

肠道病毒3D蛋白是其RNA聚合酶。柯萨奇病毒B3型(coxsackievirus B3,CVB3)主要感染心脏,其3D蛋白在心肌表达中的时序和分布尚不清楚。本研究将通过聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)获得的CVB 3D片段插入pET28a(＋)的表达框,获得pET28a(＋)-3D重组质粒。异丙基 β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside,IPTG)诱导pET28a(＋)-3D表达3D-His蛋白,十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)后,切胶,获得3D-His蛋白。3D-His蛋白加佐剂免疫新西兰大白兔制备3D蛋白多克隆抗体,蛋白免疫印迹法检测抗体效价及特异性。结果显示,本研究获得了高效价且特异性好的抗CVB3 3D蛋白抗体,可用于CVB3 3D蛋白功能的后续研究。     

大肠杆菌不耐热肠毒素的表达及其纯化保存策略

编码完整大肠杆菌不耐热肠毒素(LT)的基因被引入pET11c形成pET11-LT,该质粒在E.coli BL21(DE3)中得到较高效率的表达,约46mg/L。用D(+)Immobilized galactose柱可以在很宽的pH范围(pH7.3～10.4)内用多种方法对LT进行纯化且保持其结构完整。溶于TEAN(pH7.3)或碳酸盐缓冲液(pH10.4)的LT,冻干后保存于4℃,可长久保持其完整结构,此为保存LT的较好策略。与GM1结合实验、CHO细胞及Patentmouse毒性检测实验证明纯化的LT具有生物学活性。     

肠道病毒71型外壳蛋白VP1在Pichia pastoris酵母中的表达

利用逆转录聚合酶链式反应(RT PCR)扩增肠道病毒71型(EV71)外壳蛋白VP1基因,经序列测定证实后,构建重组表达质粒pPIC9K/VP1,转化Pichiapastoris酵母宿主菌GS115,甲醇诱导表达。SDS PAGE分析显示:表达产物的分子量约为34kD,与天然VP1大小一致。凝胶薄层扫描分析显示:目的蛋白表达量占培养上清总蛋白的60%以上。ELISA实验表明,重组蛋白VP1具有较好的抗原性。使用饱和硫酸铵分级沉淀法初步纯化的表达产物,能够较特异性地与EV71感染者血清中的抗体产生反应,而且与抗柯萨奇病毒A16特异性抗体不产生反应。通过利用表达产物作为抗原,对156份血清的检测初步证实,重组蛋白VP1可以作为检测EV71感染的的检测用抗原。     

大肠杆菌 LT B亚基基因表达载体对犬细小病毒VP2 DNA疫苗免疫应答的增强作用

【目的】通过融合基因表达载体和共免疫基因表达载体研究大肠杆菌不耐热肠毒素(LT)B亚基基因对犬细小病毒VP2DNA疫苗免疫应答的影响。【方法】提取大肠杆菌44815菌株基因组DNA,通过PCR方法从基因组DNA中扩增LTB基因,同时采用PCR方法从含有犬细小病毒VP2基因的质粒中扩增VP2的主要抗原表位基因(VP2-70,编码70个氨基酸)。将上述基因分别连接到含有人CD5信号肽序列的载体pcDNA-CD5sp上,分别构建成它们的分泌型真核表达载体,pcDNA-CD5sp-LTB和pcDNA-CD5sp-VP2-70。再利用酶切连接的方法构建LTB与VP2-70融合的真核表达载体pcDNACD5sp-LTB-VP2-70。然后用pcDNACD5sp-VP2-70(VP2-70组)、pcDNACD5sp-LTB-VP2-70(VP2-LTB融合组)、pcDNA-CD5sp-LTB/pcDNACD5sp-VP2-70(VP2-LTB共免疫组)和pcDNA3.1A(空载体对照组)分别免疫小鼠。免疫后用间接ELISA检测不同时间小鼠血清的抗体水平,用MTT方法检测小鼠免疫5周后脾脏淋巴细胞的增殖活性。【结果】经过测序表明本研究扩增的LTB和VP2基因序列和构建的相关表达载体结构正确。通过Western-blot检测证明构建的表达载体均能介导相应基因在真核细胞进行分泌表达。ELISA检测结果表明,3组实验组小鼠接受VP2DNA疫苗免疫后均能产生特异的体液免疫应答反应,特别是VP2-LTB基因融合组小鼠的抗体水平在第5周时高达1:5120,明显高于其它两组(P<0.01)。3组免疫小鼠抗体的亚型均表现IgG1抗体水平明显高于IgG2a抗体水平(P<0.01)。淋巴细胞增殖实验结果表明,在ConA的刺激下,3组免疫小鼠的淋巴细胞刺激指数均明显高于对照组(P<0.01),说明VP2DNA疫苗能够引起淋巴细胞的增殖。但3组免疫小鼠之间的刺激指数没有明显差异(P>0.05)。【结论】在小鼠体内,LTB基因表达载体可明显提高CPVVP2DNA疫苗的体液免疫应答水平。     

2013年大连市手足口病病原监测结果分析

目的通过对2013年大连市手足口病（HFMD）的病原进行鉴定,以了解其型别分布。方法采用realtime-PCR方法对754份标本进行肠道病毒（EV）通用引物和肠道病毒71型（EV71）、柯萨奇病毒A组16型（CVA16）、柯萨奇病毒A组6型（CVA6）型特异性引物检测,对EV通用引物检测结果为阳性,但EV71、CVA16和CVA6检测结果均为阴性的标本采用巢氏PCR进行肠道病毒VP1基因部分序列的扩增、测序和生物信息学分析以鉴定其型别。结果 2013年引起大连市HFMD的主要病原CVA6占44.30%（334/754）、CVA16占19.12%（114/754）、EV71占11.54%（87/754）,另有少数病例由CVA2、4、5、8型,CVB2、4型,ECHO9型及EV的其他型别引起。结论 CVA6取代EV71和CVA16成为2013年大连市HFMD病原的主要流行型别,后续应加强对HFMD病原的监测,全面了解其型别分布及毒株变异情况以更有效地控制疾病流行。     

A型塞内卡病毒的病毒样颗粒的制备及其免疫原性分析

为了研制A型塞内卡病毒 (Senecavirus A,SVA) 的病毒样颗粒 (Virus-like particles,VLPs) 疫苗,以SVA田间流行毒株CH-FJ-2017结构蛋白基因序列为研究对象,构建了能够同时表达SVA的3种结构蛋白VP0、VP1和VP3的单个原核重组表达质粒pET28a-SVA-VP031。通过大肠杆菌Escherichia coli表达、亲和层析纯化和体外自组装,获得SVA VLPs。透射电子显微镜鉴定显示,SVA的3种结构蛋白在体外能够自组装成直径约25–30 nm的VLPs,并且动物免疫试验结果表明,该VLPs能够有效刺激豚鼠产生高水平的抗原特异性中和抗体。上述研究结果为SVA VLPs疫苗的研制奠定了基础。     

Removal of antibiotic resistance of live vaccine strain Escherichia coli MM-3 and evaluation of the immunogenicity of the new strain

MM-3 was a live vaccine strain candidate for protecting neonatal piglets from diarrhea.Designed in the 1980s,a high degree of protection from colibacillosis was afforded to piglets in a challengestudy and field trials.However MM-3 had a drawback of carrying the antibiotic resistance gene (chloramphenicolacetyltransferase gene,cat).The introduction of a host-plasmid balanced lethal system into the vaccine wasa good idea to solve the problem.The λ-Red recombination system was adopted in this study to realize thereplacement of cat by aspartate-semialdehyde dehydrogenase gene (asd) in the plasmid pMM085.The newplasmid named pMMASD was introduced into an Escherichia coli strain χ6097 and Salmonella typhimuriumχ4072 where the asd gene had been knocked out in their chromosomes.Cultured in an Erlenmeyer flask,expression levels of two antigens K88ac fimbriae and heat-labile enterotoxin B subunit (LTB) in cell lysatewere similar among MM-3,χ4072(pMMASD) and χ6097(pMMASD).However,χ4072(pMMASD) possessedthe more effective secretion mechanism to transport LTB enterotoxin into culture liquid.The relatively higherstability of pMMASD in Salmonella typhimurium χ4072 than that of pMM085 in MM-3 was determined bothin vitro in the absence of selective pressure,and in vivo following oral inoculation.Oral immunization ofBALB/c mice with χ4072(pMMASD) or χ6097(pMMASD) was sufficient to elicit IgA responses in mucosaltissues as well as systemic IgG antibody responses to the K88 fimbriae,while MM-3 failed to elicit specificantibody responses to K88 fimbriae in mucosal tissues.Among three live strains,only χ4072(pMMASD)could develop strong humoral responses against LTB enterotoxin.The results suggest that χ4072(pMMASD)is expected to be a promising live vaccine strain.     

凋亡素蛋白多克隆抗体的制备及免疫学评价

凋亡素由鸡贫血病毒中的VP3基因编码,能诱导多种肿瘤细胞发生凋亡。以真核表达载体pcDNA3.0-VP3为模板构建原核表达载体pET8a-VP3,经NdeⅠ/BamHⅠ双酶切鉴定和基因测序无误后,在IPGT诱导下表达VP3蛋白并对其进行纯化,将纯化后的VP3蛋白与弗氏完全佐剂或不完全佐剂乳化后,分别对两只新西兰大耳白兔进行皮下多点注射,间接ELISA检测免疫后血清效价,效价达到指标后第2天以心脏穿刺的方法采全血后分离抗血清。抗血清效价高的兔子进一步采用Protein A纯化总IgG,最终纯化后的抗体效价可以达到1 ∶ 243 000。用重组腺相关病毒rAAV-VP3感染细胞后对抗体的特异性进行免疫学评价。首先利用免疫荧光技术检测VP3基因在人膀胱癌细胞株T24、EJ细胞以及Vero细胞中的表达情况,观察到凋亡素在T24、EJ细胞中主要定位于细胞核,而在Vero细胞中则定位于细胞质。其次通过Western blotting检测纯化后的抗体能与细胞内腺相关病毒介导表达的凋亡素蛋白特异性结合。实验证明了制备的凋亡素蛋白多克隆抗体的有效性和特异性,为进一步阐明凋亡素抗肿瘤效应的分子机制及生物学特性奠定了基础。     

柯萨奇病毒A16的β-丙内酯灭活可引起病毒衣壳的结构变化和表面修饰

正β-丙内酯(BPL)是广泛应用于疫苗产业的灭活剂。然而,其对疫苗蛋白抗原的作用及其作用机制仍然知之甚少。在这里,作者分别提供BPL处理的柯萨奇病毒A16(CVA16)成熟病毒粒子和前衣壳在分辨率为0.39 nm和0.65 nm的冰冻电子显微镜(cryo-EM)结构。值得注意的是发现这两种颗粒采用扩展的类似于135-S样无包被中间体的构象,具有包括开放的2倍通道、VP1衣壳蛋白的N末端的     

2014年安徽省柯萨奇病毒A组16型分离株VP1基因特征研究

研究2014年安徽省手足口病(Hand,foot and mouth disease,HFMD)患儿中分离的柯萨奇病毒A组16型(Coxsachivirus A 16,CVA16)毒株VP1区基因特征。收集安徽省2014年1月至11月期间413份HFMD患儿咽拭子标本接种敏感细胞分离肠道病毒,用荧光定量RT-PCR鉴定细胞培养物,对CVA16阳性培养物进行毒株VP1区RT-PCR扩增及核苷酸序列测定和基因特征分析,并与国内外参考序列构建基因亲缘性关系树。共分离鉴定出肠道病毒阳性培养物97份,其中CVA16病毒分离株17株,人肠道病毒71型(Human enterovirus 71,HEV71)分离株76株,其它肠道病毒分离株4株,总体病毒分离率为23.49%(97/413)。CVA16基因亲缘性关系分析显示:安徽省2014分离的17株CVA16毒株都属于B1基因型B1b一个分支,它们之间在核苷酸和氨基酸水平上的同源性分布为分别为95.30%~100%和98.70%~100%,但在B1b分支内形成几个传播链。17株CVA16毒株VP1区核苷酸序列与国内云南、湖南、广东、西藏和江苏地区病毒分离株同源性较高,亲缘性关系近,其中与湖南2013年和广东深圳2014年CVA16病毒分离株同源性最高,为96.40%~99.70%。2014年安徽省分离的CVA16病毒分离株属于B1基因型B1b亚型,为优势流行株;在B1b分支内形成多个小的病毒传播链共同流行。     

婴幼儿人群中CVA16中和抗体与CVA16手足口病的相关性研究

目的分析婴幼儿中柯萨奇病毒A组16型(coxsackievirus A16,CVA16)中和抗体对CVA16手足口病(hand-foot-mouth disease,HFMD)的预防作用。方法随访2012年1月—2014年1月期间江苏省180名婴幼儿人群(6~<36月龄),主动监测CVA16-HFMD,分别采集0 d、2个月、8个月和24个月的系列血样,并检测其CVA16中和抗体。结果该人群在随访93.9~141 d期间发生了1起CVA16流行,共报告10例CVA16引起的HFMD。中和抗体结果显示,在CVA16流行前(2个月)CVA16中和抗体阴性的153例中,共有10例确诊为CVA16-HFMD(6.5%),49例在流行后(8个月)出现中和抗体阳转(阳转率为32.0%)。而在流行前CVA16中和抗体阳性的27例中,无1例患CVA16-HFMD,8例流行后呈中和抗体4倍及以上升高,占31.7%。10例CVA16-HFMD患者在流行后中和抗体均出现明显升高,较流行前平均升高51.71倍。结论婴幼儿人群中的CVA16中和抗体,可预防CVA16感染导致的HFMD。     

GeXP多重基因表达遗传分析系统在手足口病病原分型检测中的应用

利用GeXP多重基因表达遗传分析系统,建立一种多重逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)方法,同时检测引起手足口病的9种常见的人肠道病毒—人肠道病毒71型(HEV71)、柯萨奇病毒A组(CVA)16、4、5、9、10型和柯萨奇病毒B组(CVB)1、3、5型。优化多重反应体系中针对5’UTR区的肠道病毒通用引物和11对针对9种血清型人肠道病毒VP1区的特异性引物的浓度比例,分别以病毒细胞培养物和阳性粪便标本来验证多重反应体系的特异性,以TCID50定量的细胞培养物和克隆质粒体外转录的RNA梯度稀释液来检测多重检测体系的灵敏度。结果表明,优化后的多重检测体系,可扩增出人肠道病毒共有的保守片段的和型特异性片段,HEV71和CVA16细胞培养物的检测下限为100.5TCID50/μL,并可在103copies/μL水平同时、特异地检测出9种病毒RNA。该方法灵敏度高、特异性强,可快速对大量临床样本进行高通量检测,用于手足口病的分子流行病学调查。