OsbHLH1基因过表达载体构建及转化水稻研究

OsbHLH1基因编码bHLH类转录因子,与水稻耐寒性相关.以pCAMBIA3300为母体,利用玉米泛素(Ubiquitin)启动子构建了能使OsbHLH1基因过表达且含有Bar基因的植物表达载体p3300-Ubi-Ω- OsbHLH1.利用基因枪法将其转化到粳稻品种东稻3号中,获得再生苗47株.选取其中9株进行PCR、Southern检测,结果表明目的基因已经整合到水稻基因组中;草铵膦叶片涂布试验结果表明,Bar基因在水稻植株中正常表达;低温处理后,除45号植株外,其余8株光合速率的变化率显著低于非转基因对照,初步证明OsbHLH1基因在水稻中过表达显著提高了水稻的耐低温能力.     

AGPase基因植物表达载体的构建及对烟草的转化

将大肠杆菌BL21的AGPase基因定向连接在受体质粒pCAMBIA2301载体上,从而构建植物表达载体,转化烟草获得了转基因植株。经GUS组织化学染色、PCR、Southern blot以及RT-PCR鉴定证实,该基因已导入烟草基因组中。淀粉含量测定结果显示,转基因植株比非转基因植株淀粉含量平均增加了13.1%,由此验证了该载体构建的成功与可用性,为下一阶段用该载体转化木薯主栽品种提高块根淀粉含量的研究奠定了基础。     

小麦TaEDR1基因dsRNAi表达载体的构建及遗传转化

从抗白粉病小麦(TriticumaestivumL.)品系99/2439中分离到一个编码促分裂原蛋白激酶激酶激酶的新基因TaEDR1。为了研究TaEDR1基因在小麦抗白粉菌(Blumeriagraminis(DC.)E.O.Speerf.sp.triticiEm.Marchal)反应中的作用,以单子叶植物高效表达载体pAHC25为基础载体,选择TaEDR1基因编码胞外结构域的、保守性低的cDNA区域作为RNA干扰的目标区段,将这个区段连接成一个反向重复序列(3′→5′//5′←3′),插入到玉米泛素高效启动子Ubi1的下游,构建成双链RNA干扰表达载体pAH-R-TER。利用花粉管通道技术,以高产小麦新品种“周麦18”为受体进行了遗传转化。T0代植株经PPT抗性鉴定、PCR扩增检测,获得了7个转基因植株,为研究小麦TaEDR1基因的功能奠定了基础。     

甘蔗黄叶病毒CP蛋白基因ihpRNA表达载体构建及烟草转化

为提高甘蔗抗病性,本研究根据甘蔗黄叶病毒海南分离物ScYLV-CHN-HN1全基因组序列(GenBank no. HQ342888),利用病毒CP蛋白介导的RNAi技术,针对病毒外壳蛋白CP,设计两对含有酶切位点的特异性引物,CPsf1/CPsr1和CPasf1/CPasr1,以构建好的pMD19-T/CP质粒为模板,pRNAi1017为中间载体,分别合成构建干扰载体的正反向片段pRNAi-CP-F-R,将CP正反向片段分别插入表达载体pCAMBIA2300的相应位置,构建含有发卡结构的RNAi载体p2300-CP-F-R,经过PstⅠ酶切鉴定,证明载体构建成功。通过农杆菌介导的方法,以干扰表达载体p2300-CP-F-R转化烟草,经过PCR检测,得到12株阳性转基因植株,Southern blot杂交和半定量RT-PCR对其检测,证明干扰片段已经整合烟草基因组中并进行了转录,该结果为RNAi介导抗病毒甘蔗育种研究奠定基础。     

中间载体pBz6102的构建及CAT基因在转化烟草中的表达

来源于细菌的新霉素磷酸转移酶基因(NPT),氯霉素乙酰转移酶基因(CAT)以及来源于昆虫的荧光素酶基因等都是用于研究根癌农杆菌转化植物的良好标记。我们利用氯霉素乙酰转移酶嵌合基因和来源于Ti质粒T-区DNA的tmr基因,构建了中间载体pBZ 6102,并通过植物基因工程载体pGV 3850,将氯霉素乙酰转移酶嵌合基因和tmr基因引入了植物细胞,并测到了表达,在抗氯霉素植物中测到了氯霉素乙酰转移酶活性。中间裁体pBZ 6102上还有Pst Ⅰ,Xba Ⅰ等单一的限制性内切酶位点,外源基因极易插入。转化植物F_1代的种子抗性分析表明,80%左右的种子都能在含氯霉素的培养基上正常萌发,它们的幼苗中都有氯霉素乙酰转移酶活性,证明CAT基因通过了减数分裂稳定地保留在植物细胞的基因组内。     

NtSKP1基因的反义载体构建及转基因烟草的产生

根据枯斑三生烟SKP1基因(NtSKP1)的序列,设计一对分别含有特定酶切位点的特异引物,以重组质粒pMD18-SKP1为模板,扩增目的基因(约473bp)片段。将反向目的片段插入中间载体pHANNIBAL的内含子右侧,再经NotⅠ酶切回收约3443bp的目的片段,插入到双元载体质粒pART27中,成功构建了含NtSKP1基因片段反向序列的植物表达载体pART27-skp1a,其转录产物能减弱目的基因的表达。将pART27-skp1a质粒导人根癌农杆菌LBA4404中并转化烟草叶片细胞,经选择分化培养,获得转基因烟草。     

红豆越桔VviDREB1基因转化烟草的研究

通过构建pVB4215植物双元表达载体,采用农杆菌介导法转化烟草,研究VviDREB1在植物体中的异源表达特性.结果显示,实验获得了25个Hyg抗性株系,经过PCR、RT-PCR和GUS组织化学染色检测及Hyg基因的PCR复检等多点验证,证实表达载体边界内序列完整地整合到2个烟草株系的基因组中.转基因烟草株系在4℃低温处理20 h后,恢复生长5 h,叶片光系统PSⅡ抗寒性分析结果表明,转基因植株的叶片快速叶绿素荧光曲线OJIP各点数值高于对照植株,VviDREB1基因能够显著提高烟草的荧光产量,最大光化学效率Fv/Fm和以吸收光能为基础的性能指数PIABS较对照高,说明VviDREB1对保护植物组织细胞内光合系统PSⅡ有明显的作用,转VviDREB1基因烟草对低温有一定的忍耐能力.     

梅PGIP基因超表达载体的构建及遗传转化

运用已克隆的梅PGIP基因构建植物超表达载体,将PGIP插入带有启动子super-promoter和终止子nos的中间载体P-Super1300 中,酶切鉴定表明,目的基因已正确地插入载体中.用根癌农杆菌介导法将其转入烟草中,共获得25株潮霉素抗性苗,对其中的13株进行PCR检测,有12株扩增出了目的条带;进一步对其中的7株进行Southern杂交检测和RT-PCR检测,发现7个株系均有杂交带出现,且均发生了基因转录,说明已成功获得了能够表达PGIP基因的转基因烟草.     

烟草NtCBL1基因的克隆、表达载体构建及表达分析

CBL是一类Ca²⁺感受蛋白,在植物适应或抵制逆境胁迫的过程中发挥重要的作用。从烟草品种K326中克隆到了一个CBL1的同源基因,该序列包含了一个642 bp的开放阅读框,编码一个由213个氨基酸残基组成的蛋白,预测分子量为24.5 kDa,等电点为5.03。同源性分析结果显示,该基因与林烟草CBL1、甜辣椒CBL1等具有较高的同源性,故命名为NtCBL1。生物信息学分析表明,NtCBL1具有CBL家族保守的EF-hand钙结合结构域。组织表达分析发现该基因在成熟期的根、茎、叶、花中均有表达,在根中的表达量最高。逆境胁迫实验表明,该基因表达受低钾、高盐、干旱、ABA和低温诱导调控,参与烟草生物与非生物逆境胁迫的响应。并成功构建了NtCBL1-pBI121过表达载体。研究结果为解析NtCBL1在响应逆境胁迫的功能奠定一定理论基础。     

水稻高叶绿素含量基因DET1 cDNA的克隆、生物信息学分析及超表达载体的构建

提高水稻叶片中叶绿素含量可以提高光合作用效率。以水稻高叶绿素含量突变体为材料,在前期精细定位的基础上,克隆了高叶绿素含量基因DET1（DE-ETIOLATED 1）cDNA。测序结果显示：DET1基因全长cDNA为1536 bp,由11个外显子组成,编码512个氨基酸。与野生型珍汕97B相比,DET1基因在第7个外显子上有T-C的转换,该转换引入了一个EcoR I酶切位点,并导致第328位的亮氨酸（L）改变为丝氨酸（S）,且突变位点处于高度保守区域内。DET1基因的氨基酸序列与玉米等其它高等植物的氨基酸序列同源性高达62%以上。利用生物信息学方法对DET1基因的序列、进化树、理化性质及亲疏水性等进行分析,并构建了水稻超表达载体pCUPHN-DET1,为水稻高叶绿素含量突变基因DET1的功能验证奠定基础。     

牡丹病程相关蛋白1表达载体的构建及遗传转化

为了对牡丹病程相关蛋白1（PsPRI）基因功能进行研究,构建了PsPRI基因超表达载体pBI121-PsPRI,通过农杆菌介导法将PsPR1基因转入普通烟草NC89中。经过抗性筛选和RT-PCR分子检测,获得含风PR1转基因植株。对转化烟草的T0代植株进行抗病性鉴定,发现转APRIJ基因烟草能轻微增强对烟草黑胫病的抗性,说明PsPRI基因具有抗烟草黑胫病原菌（Phytophthoraparasiticavar．nicotianae）的功能。     

芍药的访花昆虫和传粉昆虫

20 0 0～ 2 0 0 2年对内蒙古赤峰市高格斯台罕乌拉自然保护区内野生芍药 (PaeonialactifloraPall.)和内蒙古农校芍药园内栽培品种芍药的访花昆虫进行调查 ,经整理鉴定有 2 9种 ,自然保护区内芍药的访花昆虫种类有 1 7种 ,芍药园内的访花昆虫有 1 7种。根据传粉行为和数量的比较确定了自然保护区内主要传粉昆虫为丽斑芫菁、黄胫宽花天牛、黑胫宽花天牛、短毛斑金龟、饥星花金龟、白星花金龟和大淡脉隧蜂 ;芍药园内的主要传粉昆虫为意大利蜜蜂、棕边管食蚜蝇、长尾管食蚜蝇、大淡脉隧蜂、灰带管食蚜蝇和小淡脉隧蜂。     

黄牡丹与芍药组间杂交花粉与柱头识别的解剖学研究

分别用TTC染色法和培养液培养法测定黄牡丹花粉的生活力和萌发率;并分别以5个芍药品种为母本,黄牡丹为父本进行人工杂交,用苯胺蓝染色法,在荧光显微镜下观察黄牡丹花粉在母本('墨玉双辉'、'奇花露霜'、'手扶银须'、'金凤'和'美菊')柱头上的黏附、萌发以及花粉管在柱头和花柱中的动态变化.结果显示:(1)黄牡丹离体花粉生活力达64.9%、萌发率达68.7%.(2)授粉后24 h,黄牡丹花粉在'奇花露霜'、'手扶银须'和'金凤'柱头上的黏附数最多分别为134.5、80.9和100.5个,萌发花粉数也达到最多,分别为46.3、69.7和86.6,说明花粉与母本柱头的黏附性较好.(3)授粉后黄牡丹花粉黏附在柱头处及其附近的柱头乳突细胞内产生大量胼胝质;花粉管生长迟缓,且有扭曲、肿胀、结合、分枝等现象发生;少数花粉管能穿过柱头进入花柱,但常有胼胝质沉积其中.从黄牡丹花粉与5个芍药品种柱头的识别作用来看,受精前障碍是影响黄牡丹与芍药组间杂交的主要原因之一.     

芍药雄配子体发育的超微结构研究

用透射电镜对芍药（Paeonia lactiflora Pall)雄配子体发育进行了研究。结果表明,芍药的小孢子母细胞在减数分裂末期Ⅰ时不形成细胞板,在减数分裂前期Ⅱ形成细胞器带,胞质分裂为同时型,生殖细胞刚形成时有呈PAS正反应的拱形壁,当生殖细胞还未完全脱离花粉内壁时,质膜间的壁物质消失,营养细胞中的脂体沿双质膜规律分布形成一单行的脂体带,在二胞花粉晚期,脂体带包围生殖细胞,形成脂体冠,花粉成熟时,包围生殖细胞的脂体消失,生殖细胞与营养核贴近,构成雄性生殖单位,成熟花粉为二细胞型。     

芍药花粉活力和柱头可授性的研究

用TTC法测定了芍药花粉的活力和寿命,用联苯胺—过氧化氢法测定了其柱头的可授期。结果表明,栽培芍药单瓣花植株的花粉活力和重瓣花植株的花粉活力在开花初期(1～2d)无明显差别,但重瓣花植株的花粉活力比单瓣花植株的花粉活力下降快;通常情况下,花粉寿命约为7d。栽培品种的柱头有个体差异,单瓣花植株有的开花后2h即可分泌粘液,而重瓣花植株的柱头在开花后,有的一直不分泌粘液,有的在开花后两天才分泌粘液;单瓣花植株的柱头可授性比重瓣花植株的强,一般分别在开花后6d和3d之内具可授性。移栽的野生芍药植株的花粉活力比栽培品种下降的慢,其寿命也较长,一般为15d;柱头的可授性和粘液分泌比栽培植株强。     

Studies on the Isolation,Identification and Bioactivities of Daucosterol in the Roots ot Paeonia lactiflora

A white crystalline powder substance (m.p. 290–292℃; [a]23D=-48.3˚) was iso- lated from the roots of Paeonia lactiflora. It was identified by chemical and spectral analysis as β-sitosterol-D-glucoside, i.e. daucosterol. It amounts to 4×10-5 of the dry material Bioassays showed that daucosterol increased the fresh weight of cucumber cotyledons, promoted the elongation of wheat coleoptiles, and delayed the destruction of chlorophyll. Daucosterol also induced the initiation of root and leaf of isolated cucumber cotyledons. These phenomena showed that daucosterol was an active phytosetroid and exhibited both auxin-like and kinetin-like activities.     

芍药花药愈伤组织诱导及体细胞胚发生

以芍药(Paeonia lactiflora)品种粉玉奴花药为外植体,研究不同浓度2,4-D对愈伤组织诱导、体胚发生及植株再生的影响,采用组织细胞学方法观察愈伤组织以及体细胞胚发育过程,采用根尖染色体法鉴定再生植株倍性。结果表明,芍药花药愈伤组织诱导的最适培养基为MS+1 mg·L–1 2,4-D+1 mg·L–1 N...     

遮荫处理对芍药幼苗生长和矿质营养积累的影响

遮荫是保护芍药幼苗生长的重要措施。本试验研究了不同遮荫处理对多伦芍药幼苗生长特性和矿质营养积累的影响,以便为多伦芍药幼苗栽培提供指导。采用盆栽试验,研究不遮荫(CK)、出苗一周后20%遮荫、40%遮荫、60%遮荫和80%遮荫5个处理的多伦芍药幼苗生长和矿质营养积累的变化。结果表明:与CK相比,遮荫处理显著提高了幼苗株高,增幅分别为19.9%、31.1%、52.9%、63.7%;显著降低了根生物量比和根冠比,降幅分别为21.5%、23.6%、29.2%、41.8%和40.6%、44.0%、50.9%、63.2%。40%遮荫、60%遮荫和80%遮荫显著提高了比叶面积,增幅分别为77.0%、84.1%、65.2%,显著增加了叶绿素和类胡萝卜素含量,增幅分别为92.3%、128.7%、98.1%和86.9%、113.1%、90.5%,显著降低了根生物量,降幅分别为61.4%、74.3%、78.6%。与CK、20%遮荫、40%遮荫和80%遮荫处理相比,60%遮荫显著提高了根中磷含量,增幅分别为245.7%、65.9%、40.5%、10.3%;60%遮荫处理的根中钾和镁含量显著高于其他处理,比CK、20%遮荫、40%遮荫和80%遮荫处理分别高102.9%、131.7%、57.0%、63.3%和131.3%、55.1%、40.4%、7.7%。本试验条件下,60%遮荫是多伦芍药幼苗生长适宜的光照条件。     

芍药花瓣总RNA的提取

用TRIzol法和改良的热硼酸盐法从芍药幼嫩花瓣中提取总RNA,总RNA的D260nm／D280nm值分别为1．803、1．974。琼脂糖电泳表明,用TRIzol法提取的RNA只有28S、18S2条带,带的亮度差,说明RNA有些降解;而用改良的热硼酸盐法提取的总RNA有28S、18S、5S3条带,带的亮度强,且28S是18S宽度的2倍左右,说明提取的RNA完整、未降解,可用于后续实验。改良的热硼酸盐法更适于从芍药花瓣中提取总RNA。