VIGS技术在植物基因功能研究中的应用

文章就病毒载体选择、目标基因插入片段设计、病毒嫁接技术、环境条件控制、沉默植株检测等方面对应用病毒诱导的基因沉默(VIGS)技术研究植物基因功能应遵循的基本原则进行介绍,并讨论了其在应用中存在的一些问题。     

黑籽南瓜NBS类基因CfRFN2的克隆及VIGS验证

黑籽南瓜(Cucurbita ficifolia)是云南特有的具有高抗枯萎病遗传性状的瓜类种质资源。为鉴定黑籽南瓜中NBS-LRR类基因的抗病功能,该研究从其叶片中克隆了NBS类基因CfRFN2 (GenBank ID:MK618462),测序全长为4 303 bp,完整的编码框长度为4 092 bp,编码1 363个氨基酸残基,该基因注释为拟南芥抗病蛋白At4g27190类转录体X1的同源基因,含有1个NB-ARC和2个LRR结构域,属于具有信号肽的可溶性蛋白。核苷酸相似性分析显示,CfRFN2与其他瓜类NBS类基因相似性在87%～98%之间;系统进化树分析表明,CfRFN2蛋白和瓜类的其他NBS类抗病蛋白聚为一个分支,其中CfRFN2蛋白与中国南瓜和美洲南瓜的RPS2、印度南瓜的RPS2-like亲缘关系最近,其次是黄瓜的At4g27190和苦瓜的At4g27220,与甜瓜的Atg27190亲缘关系相对较远;组织表达特性分析表明,CfRFN2基因在黑籽南瓜叶片中表达量最高,其次是茎,而在果皮和根中表达量较低。该研究采用烟草脆裂病毒载体系统,构建了黑籽南瓜VIGS沉默载体pTRV2-CfRFN2,含沉默载体的农杆菌侵染黑籽南瓜幼苗后接种枯萎病菌,qRT-PCR检测表明,接种后2 d和4 d的转pTRV2-CfRFN2沉默组植株的CfRFN2基因表达量比接种后同时期的野生型植株显著降低(分别下降34.75%和98.27%),病情指数增加为野生型的1.32倍,初步证明黑籽南瓜CfRFN2基因具有抗枯萎病的功能,推测该基因可能在黑籽南瓜抗枯萎病防御过程中发挥着重要作用。该研究中NBS类基因CfRFN2的克隆和VIGS验证为黑籽南瓜更多优异基因的克隆和功能验证奠定了前期基础,也为发掘黑籽南瓜优异抗病基因和开展瓜类分子育种提供新信息。     

VIGS技术在昆虫基因功能研究中的应用

RNAi作为一种基因沉默的分子生物学技术,广泛应用于生物基因功能研究.在昆虫RNAi研究中,病毒诱导的基因沉默(Virus-induced gene silencing,VIGS)技术是一种将dsRNA导入昆虫体内的独特策略.目前,这种方法在半翅目和鳞翅目昆虫的研究中有诸多报道.通过携带靶标昆虫基因片段的重组病毒载体侵染寄主植物,病毒在复制过程中形成dsRNA.实验昆虫取食被侵染的寄主植物后会摄入大量的dsRNA,从而达到dsRNA导入的目的.与其它dsRNA导入方法相比,VIGS技术具有高效、高通量、昆虫接受度高等优势.本文综合分析了 VIGS技术的作用机理、应用研究、影响效率的因素及其优缺点,将来应围绕这些问题进一步深化该技术在昆虫学研究中的应用.     

病毒诱导的基因沉默及其在植物基因功能研究中的应用

RNA介导的基因沉默是近年来在生物体中发现的一种基于核酸水平高度保守的特异性降解机制.病毒诱导的基因沉默（virus induced gene silencing, VIGS）是指携带植物功能基因cDNA的病毒在侵染植物体后,可诱导植物发生基因沉默而出现表型突变,进而可以研究该目的基因功能.至今,已经建立了以RNA病毒、DNA病毒、卫星病毒和DNA卫星分子为载体的VIGS体系,这些病毒载体能在多种寄主植物（包括拟南芥、番茄和大麦）上有效抑制功能基因的表达.VIGS已开始应用于N基因和Pto基因介导的抗性信号途径中关键基因的功能研究、抗病毒相关的寄主因子研究以及植物代谢和发育调控研究.在当前植物基因组或EST序列大量测定的情况下,VIGS为植物基因功能鉴定提供了有效的技术平台.     

植物VIGS技术及其在林业科学中的研究进展

随着基因组序列信息的激增,生物科学研究进入大数据时代,但如何对基因组信息进行功能注释成为了一个重要的研究目标.病毒诱导的基因沉默(virus-induced gene silencing,VIGS)技术作为一种强大的工具,可以针对缺乏稳定遗传转化体系的林木物种进行基因功能分析,已经被用来研究了多个植物生长发育过程中的关...     

植物病毒诱导的基因沉默在基因功能研究中的应用

传统的植物遗传转化方法周期长、工作量大、过程繁琐,不利于基因功能的快速高通量鉴定．近年来随着基因沉默机制研究的深入和不断发展,利用病毒诱导的基因沉默(Virus induced gene silencing,VIGS)进行植物功能基因组研究作为一种快速、高通量的反向遗传学工具已被广泛应用在烟草、马铃薯、番茄等植物中, 在大规模的植物基因组功能鉴定中展示了广阔的应用前景．综述了 VIGS 的作用机制、植物病毒栽体、转化方法以及在植物基因功能研究等方面的应用及前景．     

病毒诱导的基因沉默技术用于植物色素代谢机制的研究进展

色彩是评价园艺植物观赏性状的重要指标,而植物色素是影响植物色彩表型的关键因子。植物色素及其代谢产物在植物观赏器官颜色形成、植株生长发育调节及对逆境胁迫的响应等方面发挥着重要的作用,是植物研究领域长期关注的热点问题。病毒诱导基因沉默(virus-induced gene silencing,VIGS)是利用植物同源依赖性防御机制,特异性降低宿主内源性基因表达的一种重要基因组学工具,能够通过快速诱导植物基因沉默表型的产生,表征基因的功能,为缺乏遗传转化体系的植物的基因功能鉴定提供高效可行的替代方案。本文综述了VIGS技术在植物色素的生物合成、降解和调控机制上的应用现状,并探讨了VIGS技术在探究色素调控机制上的潜力和未来前景,以期进一步完善对不同植物色素的代谢过程和调控机制的理解,为改良植物色彩性状提供参考依据。     

VIGS技术在甜菜上的应用

病毒诱导基因沉默(VIGS)是一种应用于研究植物基因功能的反向遗传学手段。相对于基因敲除及转基因等方法,它具有时间短、成本低、高通量等优点。随着甜菜全基因组的测序完成,为尽早对大量序列信息进行注释和功能鉴定,急需建立甜菜VIGS体系。本文采用目前应用最广泛的烟草脆裂病毒载体在农杆菌的介导下侵染甜菜幼苗叶片,同时设立对照。提取甜菜幼苗叶片总RNA,并反转录成c DNA,设计特异引物进行RT-PCR检测。结果表明:在侵染植株上检测到了烟草脆裂病毒特异条带,证明该病毒可以对甜菜进行侵染,这一结果为下一步建立甜菜VIGS体系奠定了基础。     

烟草脆裂病毒诱导的基因沉默在植物基因功能研究中的应用

烟草脆裂病毒(tobaccorattlevirus,TRV)是一类应用比较广泛而且效率和持久性较好的病毒载体,能够介导基因沉默同时不会带来病毒诱导的症状。改造后的病毒能够促进非病毒序列的插入以及对植物的后续感染,也可以鉴定宿主植物生长点的基因,因此TRV在植物基因功能鉴定中具有广泛的应用。该文介绍TRV沉默载体的构建、诱导基因沉默原理、在植物基因功能研究中的应用以及优缺点。     

植物基因功能鉴定新工具--病毒诱导基因沉默技术的研究进展

病毒诱导基因沉默（Virus—induced gene silencing,VIGS）技术是指带一段靶基因序列的VIGS重组病毒侵染植物、引起植物同源基因沉默与表型变异,进而通过表型变异进行基因功能分析的方法,是近年发展起来的从反向遗传学方向快速鉴定植物基因功能的技术,是转录后基因沉默机制的一种表现。①VIGS的分子机制,涉厦基因沉默的起始、维持和信号放大、传播共3个阶段;②VIGS技术、栽体与方法学的发展;③VIGS作为基因功能研究的优越性,如不必进行转基因、操作方法简便、获得结果快速等;④应用VIGS对植物抗病途径、代谢与发育调控中参与基因功能进行研究的概况。同时。展望了VIGS技术作为植物功能基因组学功能分析的高通量技术平台的美好前景。     

中国番茄黄化曲叶病毒利用根吸收法诱导基因沉默(VIGS)的初步研究

以含硫黄素酶Su基因的中国番茄黄化曲叶病毒卫星DNA作为载体,通过冻融法将其转化到农杆菌中,利用根部吸收法进行农杆菌侵染,对农杆菌介导的病毒诱导基因沉默体系进行了优化,探讨对病毒诱导基因沉默效率的影响。结果显示以OD600值为1.5的含质粒pBinPLUS-2mβ-Su,pBinPLUS-1.7A的农杆菌菌液1∶1混合进行根部吸收法侵染22-25 d的番茄幼苗,目的基因Su沉默导致番茄幼苗出现光漂白现象,半定量RT-PCR检测目的基因Su mRNA被显著降解,该体系的建立有利于对植物基因进行高通量功能分析。     

病毒诱导的基因沉默及其在植物功能基因组研究中的应用

病毒诱导的基因沉默已成为研究植物功能基因组的重要工具. VIGS 体系因其方法简便、周期性短以及避免植物转化等诸多优点, 已在利用正向遗传学和反向遗传学寻找和鉴定基因功能方面发挥了日益重要的作用. 越来越多的植物病毒被改造成为VIGS 载体, 并已在植物发育、生物逆境、非生物逆境、细胞代谢、信号传导等基因功能研究方面得到了应用. 本文围绕VIGS的发展以及在植物功能基因鉴定中的应用及前景提出了展望.     

病毒诱导的基因沉默技术及其在植物中的研究进展

病毒诱导的基因沉默(virus-induced gene silencing,VIGS)是近年来发现的一种转录后基因沉默现象,是植物抵抗病毒侵染的一种自然机制。现已被开发为快速鉴定植物基因功能的一种反向遗传学新技术。与传统的植物转基因技术相比,VIGS无需构建转基因植株,而且具有操作简便、获得表型快速等优点,目前已广泛应用于与植物抗病、逆境胁迫、细胞信号转导以及生长发育等相关基因功能的研究。该文就VIGS技术的作用机理、主要操作规程、在植物基因功能研究方面的应用以及存在的问题进行综述。     

RNA干涉及其在棉花研究中的应用

RNA干涉(TNA interference,RNAi)技术是一门新兴的基因阻断技术,可通过将外源双链RNA导入细胞介导同源靶基因mRNA序列的降解,使靶基因表达沉默,是一种转录后的基因沉默现象.目前,RNA干涉技术在植物研究中已经得到广泛应用.本文简介了植物的RNA干涉研究及RNAi表达载体的构建,综述了RNAi在棉花基因功能和功能基因组学研究、棉花品质性状的遗传改良和棉花的抗虫抗病研究中的应用进展及其在棉花研究中存在的主要问题和应用前景.     

用卫星DNA沉默载体研究植物矿质营养相关的基因：以沉默番茄的高铁还原酶基因FR01为例

病毒诱导的基因沉默（VIGS）是近年来发展的一种研究植物基因功能的新技术．至今尚不明确这种新技术是否能够有效地沉默植物根系中与矿质营养相关的基因．本研究中,以根系高铁还原酶基因FR01为例,探讨了一种改进的卫星DNA沉默载体（DNAmβ）在研究与根系矿质营养相关的基因功能中的适用性．将番茄的铁还原酶基因FRO1的cDNA片段插入到DNAmβ载体中,构建了FRO1基因的沉默载体,并利用农杆菌介导法和辅助病毒中国番茄黄化曲叶病毒一起接种番茄．结果表明,缺铁番茄根系的FROImRNA水平显著降低,同时,铁还原酶活性也明显降低,上述结果证明了VIGS技术可以用来研究植物根系中与矿质营养相关的基因功能。     

陆地棉小GTP结合蛋白基因GhROP4在棉花抗旱中的功能分析

干旱是影响新疆棉花产量及品质的首要非生物因素,ROP(Rho-realted GTPases from plants)蛋白是一类植物特有的Rho类小G蛋白,在植物体内起着调控生长发育及多种抗逆反应的作用.本研究利用实时荧光定量PCR(qRT-PCR,real-time quantitative polymerase c...     

植物瞬间表达系统与功能基因组学研究

结构基因组学和功能基因组学的发展使特定植物基因组和转录组序列的获取更为方便和快捷。随之而来的是对各种基因和调控序列的功能注释,探索植物生长和发育的遗传机理。表达和调控表达是遗传物质的自身语言和动态属性,因此通过植物细胞内表达来分析目标基因和序列的表达和调控行为是功能分析的主要立足点。除创造转基因植株外,近几年来植物细胞瞬间表达系统得到了广泛的使用,与基因重排、病毒诱导基因沉默和RNA干扰等新兴技术的结合使其在植物功能基因组研究中扮演了越来越重要的角色。     

RNAi技术及其在真菌基因功能研究中的应用

<正>近年来,随着分子生物学技术的不断发展,真菌基因组的研究进展迅速。随着稻瘟病菌Magnaporthe oryzae等多种真菌的基因组测序计划的完成,GenBank中积累了大量功能未知的真菌