纳豆激酶的液体发酵条件优化

以纳豆素中分离的纳豆芽孢杆菌进行纳豆激酶发酵试验,考察装液量、接种量、摇床转速等因素对生物量和纳豆激酶纤溶活性的影响,揭示产酶规律并确定最优产酶条件。发酵培养基配方为2%葡萄糖、2%蛋白胨、0.05%Mg SO4、0.01%Ca Cl2、0.6%Na2HPO4、0.4%Na H2PO4。最终确定的发酵条件为:p H 6.9,2%接种量,45 m L/250 m L的装液量,33.5℃,摇床转速为165 r/min,在此条件下发酵33~34 h为产酶高峰期,纳豆激酶的纤溶活性达到1 004 U/m L,结果也表明纳豆激酶是一种生长关联型代谢产物,纤溶活性与生物量变化趋势高度一致。     

液态发酵豆粕制备纳豆激酶方法的优化

纳豆激酶是一种丝氨酸蛋白酶,具有很强的纤溶活性,由于具有安全性好、作用迅速持久、成本低等优点,适合用于开发新一代的溶栓剂或保健食品,具有广阔的市场前景。本研究探讨了以豆粕为原料液态发酵豆粕生产纳豆激酶的发酵方法。首先通过单因素实验发现影响产酶的主要因素有接菌量、发酵时间、培养基pH及豆粕含量,再由正交实验得到最优组合为接菌量1%,豆粕含量2%,pH为7.0,发酵时间48h,该条件下发酵酶活力最高达到4 429.6U/mL。本研究确定了以豆粕为原料制备纳豆激酶的最佳条件,为豆粕的合理使用和纳豆激酶的工业化生产提供了实验依据。     

纳豆激酶的研究与应用

纳豆激酶是一种枯草芽孢杆菌产生的丝氨酸蛋白酶 ,具有强烈的纤溶活性 ,有望开发成为新型口服溶栓药。综述了纳豆激酶的生化特性、生物学活性、结构与功能及开发应用前景等。     

纳豆激酶基因工程研究进展

纳豆是日本的民间传统食品,1987年日本学者须见洋行从纳豆中分离提取和纯化出一种具有纤溶活性的蛋白激酶,称之为纳豆激酶(Nattokinase,NK)。它是由枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)经发酵产生的一种丝氨酸蛋白酶,该酶能显著溶解体内外血栓,明显缩短优球蛋白的溶解时间,并能激活静脉内皮细胞产生纤维蛋白溶酶原激活剂(Sumi H,1987年)。     

纳豆激酶基因工程研究进展

纳豆激酶是由纳豆芽孢杆菌(Bacillussubtillisnatto)分泌的一种具有纤溶作用的碱性丝氨酸蛋白酶。对纳豆激酶基因的克隆与表达,基因与蛋白质结构以及基因工程纳豆激酶的特性和功能进行了综述。     

一株高产纳豆激酶菌株的鉴定与分析

鉴定高产纳豆激酶菌株Td,分析纳豆激酶的分子特征。利用菌体形态、生理生化特征、以及分子生物学方法对菌株Td进行鉴定;并采用MALDI-TOF质谱测定与分析、SDS-PAGE和纤溶活性测定等方法检测纳豆激酶特性,利用PCR方法扩增纳豆激酶的基因全长。结合菌体形态、生理生化特征和16S r DNA、gyr A基因序列、DNA-DNA杂交率等实验结果,鉴定菌株Td为枯草芽孢杆菌枯草亚种(Bacillus subtilis subsp.subtilis);菌株Td发酵产生的纳豆激酶产量可达300 mg/L以上,占发酵液总蛋白的40%以上;纤溶活性达230 U/m L以上;氨基酸序列与subtilisin E的序列相似性最高;基因全长序列为1 143 bp。枯草芽孢杆菌枯草亚种Td是一株高产、高活性纳豆激酶的产生菌,具有优良的工业化开发价值。     

纳豆激酶基因的克隆及其在毕赤酵母中的表达

纳豆激酶纳是从日本传统食品纳豆中发现的一类具有溶栓效果的蛋白酶,由于其具有安全,高效,作用时间长,易吸收,廉价等优点,现在正成为一个开发治疗血栓类疾病药物的研究热点。从本实验室保存的一株高溶栓的纳豆杆菌N07出发,提取总基因组DNA,利用PCR手段扩增获得了纳豆激酶长为825bp的成熟肽基因片段。构建重组表达质粒pPICZaA-NK,经EcoR I、Xba I双酶切、PCR、测序验证得出重组表达质粒上的外源基因即为825bp的目的片段;将重组质粒pPICZaA-NK用内切酶Sac I线性化后电击导入毕赤酵母X33,通过含Zeocin的YPDS平板筛选获得重组酵母。重组酵母在BMMY培养基中发酵培养,用1%甲醇诱导目的蛋白表达。用纤维蛋白平板法检测发现发酵上清具有纤溶活性,经硫酸铵盐析、透析、Sephadex-G50过柱等步骤分离得到纳豆激酶蛋白,进行SDS-PAGE鉴定表明,表达的纳豆激酶蛋白分子量为27KD。以尿激酶为标准,实验所得纳豆激酶发酵上清液溶栓活性约为195U/mL。成功的将纳豆激酶成熟肽基因在毕赤酵母X33中表达,为纳豆激酶基因工程进一步研究奠定基础。     

纳豆激酶固态发酵的参数优化

方法:在对实验室分离的纳豆激酶产生菌进行菌株鉴定及其酶学性质研究的基础上,对影响菌株固态发酵产酶的工艺参数进行了优化研究.结果:发酵温度、发酵时间及培养基碳氮比、料水比、pH对纳豆激酶的产生都有较大影响,而接种量对纳豆激酶影响较小;在优化条件下,纳豆激酶固态发酵酶活可达到8 300U/g,为已知最高纳豆激酶单位酶活.     

纳豆激酶

纳豆激酶 (ｎａｔｔｏｋｉｎａｓｅ)是一种枯草杆菌蛋白激酶 ,是在纳豆发酵过程中由纳豆枯草杆菌 (Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ/ｎａｔｔｏ)产生的一种丝氨酸蛋白酶。 1 987年由日本的须见洋行等首先发现[1～ 3] 。研究发现 ,纳豆激酶具有纤溶活性 ,可治疗和预防血栓病 ,它还可激活体内的纤溶酶原 ,从而增加内源性纤溶酶的量与作用[4] 。目前常用的及一些还在开发的治疗心脑血管栓塞疾病的药品 ,如链激酶 (ｓｔｒｅｐ ｔｏｋｉｎａｓｅ ,ＳＫ)、尿激酶 (ｕｒｏｋｉｎａｓｅ ,ＵＫ)、重组组织型纤溶酶原激活剂 (ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ…     

纳豆激酶生产菌的筛选及发酵纳豆特性研究

为开发具有特定生理活性的新型纳豆保健品,从发酵豆制品中分离筛选得到一株纳豆激酶高产菌株。利用该菌株以及市售的3种纳豆中的纳豆菌进行纳豆发酵,比较了4株纳豆菌发酵纳豆的特性,并对纳豆激酶活性进行分析。结果表明5号菌株发酵生产纳豆周期短,颜色金黄,具有酱香味,拉丝长度最佳。同时,对产纳豆激酶的最佳发酵时间进行研究,结果表明发酵至17 h纳豆激酶活性达到最大值。     

药食两用纳豆激酶的研究进展

本文从血栓栓塞疾病的形成机制为依据,综述了纳豆激酶的药理作用。介绍了国内外产纤溶酶菌株的筛选方法,纳豆激酶的分离、纯化常用技术,纳豆激酶的生理生化特性、活性测定方法。并说明了影响纳豆激酶稳定的4个因素,和增加纳豆激酶产量的有效方法。通过药食两用纳豆激酶的研究进展,希望对纳豆激酶的研究提供理论基础。     

纳豆激酶的研究进展

纳豆激酶是一种由纳豆芽孢杆菌产生的具有强溶纤作用的碱性丝氨酸蛋白酶,具有安全性好、半衰期长、口服有效等优点.就纳豆激酶的结构、理化性质、功能、溶栓机制、酶活性测定、分离纯化以及纳豆激酶的应用现状及发展前景等方面进行了综述.     

产纳豆激酶枯草芽孢杆菌种子液培养条件的优化

利用Plackett-Burman法(PB法),以紫外分光光度法作为测量方法对产纳豆激酶枯草芽孢杆菌种子液培养条件进行了优化。确定了产纳豆激酶枯草芽孢杆菌种子液的最佳氮源是大豆蛋白胨,优化出最佳种子液培养条件为牛肉膏0.5 g/100 mL、大豆蛋白胨1 g/100 mL、NaCl 0.75 g/100 mL、pH 7、培养温度37℃、培养时间8.5 h、接种量为3 mL/100 mL、装液量100 mL/250 mL。     

高产纳豆激酶液态发酵工艺的优化

通过用纳豆杆菌进行液态发酵生产纳豆激酶的培养基的优化实验,确定最佳产酶培养基组成为麦芽糖2%,酵母膏4%,CaCl20.03%,pH 7.0。在此基础上,设计发酵条件的优化实验,实验结果表明,在接种量为1%,装液量为100mL/500mL挡板瓶,200 r/min的条件下,34℃培养48 h达到产酶高峰,产酶活力可达4300U/mL发酵液。在此基础上,通过Luedking-Piret模型来描述纳豆激酶的生成,确定纳豆激酶的液态发酵属于部分生长偶联型。     

纳豆激酶的分离纯化研究

从实验室保存的一株高产纳豆激酶菌株出发,进行发酵产酶,确立具有纤溶活力的纳豆激酶的分离纯化工艺,主要通过硫酸铵分级盐析法和Phenyl Sepharose疏水柱层析进行分离纯化,用纤维蛋白平板法测定酶活力,用SDS-PAGE电泳验证为电泳纯,分子量为28kD。其有望开发为新型的口服溶栓药物。     

纳豆激酶基因在E.coli HB101中的初步表达研究

利用PCR技术以纳豆杆菌染色体DNA为模板扩增纳豆激酶基因,将该基因克隆到温度诱导型表达形体pVB220上,转化E．coliHB101,获得转豆激酶基因重组菌。在确定了其最佳培养时间与诱导时间后,SDS－PAGE分析结果表明基因表达产物为分泌型,蛋白表达量占菌体蛋白的12％左右,液体发酵后纳豆激酶产量可达120U／ml菌液,对重组菌中重组质粒的稳定性进行研究,结果表明该质粒在宿主菌中具有良好的分离稳定性,而结构稳定性较差。     

纳豆激酶液态发酵条件的研究

考察纳豆杆菌在7.5 L发酵罐中分批发酵产纳豆激酶的条件,纳豆激酶酶活采用四肽底物测定。结果表明:纳豆杆菌生长和产酶的适宜条件不一致。发酵过程中发酵罐搅拌转速控制为500 r/min不变,0～12 h时控制pH为8.0、温度为37℃;12～36 h调整pH为7.0、温度为30℃;16 h时补加外源C源,连续发酵36 h。该过程中发酵液中比酶活最高达到3 232 U/mL,与摇瓶发酵相比,比酶活提高了58%。     

产纳豆激酶菌株Bacillus sp.ZLK08的分离及酶纯化

获得稳定产纳豆激酶菌株,为高酶活纳豆激酶产生菌的改造奠定基础.取各来源纳豆,用平板梯度稀释法分离菌株,测定菌株酶活,利用16S rDNA鉴定产酶菌株,凝胶过滤法纯化纳豆激酶并SDS-PAGE检测分析.成功获得稳定产酶芽胞杆菌Bacillus sp.ZLK08,16S rDNA分析表明其与GenBank中序列同源率达到99％,液体发酵表明酶活达到2.5 FU/mL,经纯化,SDS-PAGE表明纳豆激酶分子量为28.46 ku.分离出的Bacillus sp.ZLK08菌株能稳定产纳豆激酶且具有较高酶活.     

纳豆激酶基因在E.coli HB101中的初步表达研究*

利用PCR技术以纳豆杆菌染色体DNA为模板扩增纳豆激酶基因 ,将该基因克隆到温度诱导型表达载体pBV2 2 0上 ,转化_{E .coli}HB1 0 1 ,获得转纳豆激酶基因重组菌。在确定了其最佳培养时间与诱导时间后 ,SDS PAGE分析结果表明基因表达产物为分泌型 ,蛋白表达量占菌体蛋白的12%左右 ,液体发酵后纳豆激酶产量可达 120U/mL菌液。对重组菌中重组质粒的稳定性进行研究 ,结果表明该质粒在宿主菌中具有良好的分离稳定性 ,而结构稳定性较差。     

纳豆激酶的研究进展

纳豆激酶是一种由纳豆菌产生的具有强烈纤溶作用的丝氨酸蛋白酶,与传统的一些溶栓剂相比,其具有安全性好、成本低、口服有效等优点。就纳豆激酶的理化性质、制备过程、生物学功能、酶活测定方法及分子生物学研究等进行了综述。