肺表面活性物质相关蛋白的特性研究

肺表面活性物质相关蛋白的特性研究谢尔凡（第三军医大学烧伤研究所,重庆６３００３８）关键词肺表面活性物质,表面活性物质相关蛋白肺表面活性物质是由脂质和蛋白质组成的复合物,其主要生理功能是降低肺泡表面张力,维持肺泡结构相对稳定。近年来,特异性的肺表面活性...     

肺表面活性物质的防御保护功能

肺表面活性物质（ＰＳ）除能降低表面张力外,还具有抗氧化、抗感染、促进肺内异物颗粒的排出,减轻变态反应性及弹性蛋白酶所致的肺损伤等多方面的防御保护功能。ＰＳ是肺内特有的生理性抗损伤因子。     

表面活性物质相关蛋白表达的调控研究进展

特异性的肺表面活性物质相关蛋白（SP）包括亲水性的SP－A、SP－D和疏水性的SP－B、SP－C。它们的表达与合成受众多生理、病理因素影响。本文综述了该领域的研究进展。1．SP表达的组织细胞特异性调控：只有肺内某些细胞（肺泡11型细胞、Clara细胞等）能合分泌SP,这可能是由SP基因中特定序列决定的,如SP－B基因的细胞特异性表达的调控成分。2．SP表达的发育期调控：SP基因属发育控制基因家族。在人类妊娠前3mon胎肺中,SP基本不表达：妊娠15－18wk时,气管、支气管上皮细胞即可见SP－B、SP－CmRNAs和表达蛋白,它们可能比SP－A出现早：妊娠19－20wk时可见SP－AmRNA和表达蛋白,胎肺组织在体外无激素条件下培养可很快诱导SP表达,在妊娠后3mon内,各SPmRNAs及表达蛋白水平与磷脂水平平行升高,也与SP降低表面张力的特性逐渐增强相关,羊水中可检出这些蛋白,板层体的出现与SP－B的表达密切相关,而比SP－A的表达早,胎肺发育过程中SPmRNAs增加至少部分是由于其基因转录率升高,可能同时也与翻译增加有关。3．糖皮质激素对SP表达的调控：糖皮质激素对SP－A表达的调控极复杂,且与剂量、发育期、作用时间及动物种属有关,总的来讲,在胎肺移植培养中,激素浓度≤10nmol/L时,能刺激SP－AmRNA和蛋白表达增强;浓度≥1μmol／L,则抑制其表达,在成人肺腺癌细胞系H820中也有这种对糖皮质激素的双相反应。地塞米松能刺激人胎肺移植培养和H820、H441细胞系中SP－B和SP－CmRNAs表达增强。给孕26d母兔倍他米松,可使胎兔肺内SP－BmRNA水平升高接近成年兔水平,但SP－CmRNA则明显降低。4．其它调控SP表达的因素：在人和兔胎肺移植培养中,cAMP及其类似物二丁酰基cAMP、8－溴cAMP和2－溴cAMP均可刺激SP－AmRNA和蛋白表达增加。ATP和cAMP均能刺激离体灌注大翻译效率或翻译后因素的改变可能参与了ATP和cAMP所致SP－A合成的增加。表皮生长因子和干扰素γ可使人胎肺移植培养中SP－AmRNA和蛋白水平呈剂量依赖性增加。角化细胞生长因子能促进培养的成年大鼠11型细胞中SP－A和SP－BmRNAs表达。转化生长因子能抑制人胎肺移植培养中SP－AmRNA和蛋白的表达,下调培养11型细胞中SP－CmRNA表达。胰岛素可使人胎肺移植培养中SP－A蛋白水平呈剂量依赖性下降,肿瘤坏死因子α可降低人肺腺癌细胞系中SP－A和SP－BmRNAs水平,且有剂量依赖关系。性激素不影响SP表达。总之,SP表达的调控可能是许多因素在不同水平综合作用的结果。     

缺氧对家兔肺泡表面活性物质中各磷脂组分的影响

肺泡表面活性物质中各磷脂组分对缺氧的反应是不同的。急性缺氧时,肺泡冲洗液中溶血卵磷脂、神经鞘磷脂、磷脂酰乙醇胺及磷脂酰甘油均下降(p<0.05);间断适应性缺氧后,基本回复到缺氧前水平。而急性缺氧时,肺组织中除磷脂酰乙醇胺变化不明显外,其它各成分均有明显增加(p<0.05)。间断缺氧时,肺组织中各脂质成分持续下降。该变化可能与肺组织中ATP等能量物质在缺氧时代谢异常有关。从肺泡冲洗液的脂质分析结果来看,适当地以间断减压作缺氧适应,能有效地解除急性缺氧对肺泡表面磷脂含量的抑制作用。     

肺表面活性物质相关蛋白A与肺部免疫防御研究进展

肺表面活性物质相关蛋白A（SP—A）是一种高度保守的亲水性糖蛋白,属于C-型凝素家族成员,相对分子质量为29～36kDa。SP—A是肺部重要的天然免疫防御分子,在肺的局部防御和天然免疫反应中起着十分重要的作用。它不仅可调节局部免疫和炎症反应、调理吞噬作用,还可凝集病原微生物、影响趋化作用及促进杀菌作用等。     

表皮生长因子对大鼠肺表面活性物质合成的调控及机制

目的和方法：采用无血清成年大鼠肺组织培养,用液体闪烁计数器测定＾３Ｈ－胆碱掺入磷脂酰胆碱量,消化定磷法测总磷脂,薄层层析及薄层扫描测磷脂各组分含量变化,观察生理浓度表皮生长因子对成年大鼠肺表面活性物质合成的调控。结果：①１０＾－９ｍｏｌ／Ｌ ＥＧＦ作用８ｈ后,ＰＣ合成量显著增加,１６ｈ达高峰;②ＥＧＦ可显著增加总磷脂、ＰＳ特征性成分ＰＣ、ＰＧ合成（Ｐ〈０．０１）。而细胞膜特征性组分ＰＥ、ＰＳｅ、Ｓ     

分枝杆菌T7SS(ESX)分泌系统功能研究进展

分枝杆菌感染宿主后能够通过分泌至胞外的效应蛋白去影响宿主的免疫功能,其中ESX(或Ⅶ型)系统在效应蛋白分泌方面发挥了重要作用。ESX分泌系统是分枝杆菌和许多放线菌中的蛋白质输出系统,但目前ESX系统如何将底物运输穿过外膜的分子机制以及调控机制尚不清楚。本文对ESX系统的组成、功能、分类以及将底物运输至周质空间的相关研究进展展开了综述,并探讨了ESX系统在抗生素耐药、持留及与宿主-噬菌体相互作用中的功能,以及作为新药物靶标的潜力,以期为结核病新药物和疫苗抗原的发现提供新的见解。     

鸟分枝杆菌PhoP功能分析及其基因突变株的构建

【目的】对鸟分枝杆菌PhoP的功能进行分析及构建PhoP基因突变株,为深入研究PhoP的调控机制打下基础。【方法】利用PCR扩增出鸟分枝杆菌PhoP DNA结合区(PhoPC)编码序列,与表达载体p GEX-4T-3连接后,转化入大肠杆菌BL21(DE3)中表达GST-PhoPC融合蛋白。用凝血酶去除GST标签,制备PhoPC蛋白;利用PCR扩增出鸟分枝杆菌PhoP基因及其下游基因MAV0127、PhoU和Amt的启动子片段,采用凝胶迁移率移动试验(EMSA)分别检测PhoPC与PhoP、MAV0127、PhoU和Amt的启动子结合的情况。通过PCR扩增PhoP基因上、下游片段,构建PhoP基因缺失性同源核苷酸片段,与自杀质粒p GMB151连接后,通过电转化导入鸟分枝杆菌进行同源交换,利用PCR筛选出PhoP基因缺失突变株。【结果】EMSA结果显示,鸟分枝杆菌PhoP能与PhoP、MAV0127及Amt基因启动子结合,不能与PhoU结合。通过PCR和序列分析证实基因突变株的PhoP基因缺失了309个碱基。【结论】PhoP不仅可调控其下游基因MAV0127和Amt的转录水平,还可调控其自身基因的转录,但不参与调节PhoU二元调控系统。构建了PhoP基因缺失突变株,为进一步研究其在鸟分枝杆菌的调控功能奠定了基础。     

雌二醇对成年大鼠肺表面活性物质分泌的影响

采用离体非灌流肺模型,观察了雌二醇(E_2)对成年大鼠肺表面活性物质(PS)分泌的影响,并探讨了前列腺素(PG)在其中的作用。结果显示:E_2(10~(-6)mol/L)可使肺磷脂释放指数和肺磷脂释放量增多,分别为对照组的150.0％(P<0.05)及160.7％(P<0.01),表明E_2可促进成年大鼠PS的分泌;PG合成抑制剂消炎痛(10~(-5)mol/L)可以抑制E_2促进肺磷脂释放的效应,表明PG在E_2促进PS分泌中起介导作用。以上结果提示E_2可能参与成年动物PS分泌的调控。     

蔗梢氨基酸合成表面活性物质及其结构的测定

本文报导由蔗梢提取的混合氨基酸与高级酯肪酸酰氯合成一种应用广泛的离子型表面活性物质的实验方法、产量及其结构测定数据。实验表明,蔗梢游离氨基酸、结合蛋白氨基酸的提取液与硬脂酸酰氯的缩合产量为15克(按硬脂酸14.5克投料经两步反应后计算)。溶解性能试验、红外光谱测定表明,产物的结构为CH_3-(CH_2)_(18)-CONH-R-CONH-R’COOH类型。     

结核分枝杆菌生物膜形成相关基因的筛选与鉴定

目的:通过菌落表型变化并结合生物膜生长缺陷筛选并鉴定可能与生物膜形成相关基因.方法:利用带有Himarl转座子的MycoMarT7转座子系统建立结核分枝杆菌H37Ra随机插入突变库;筛选细菌表面结构发生变化和生物膜形成有变化的突变菌株;运用T-A克隆法并结合抗性标记挽救法获得突变菌株的随机插入基因侧翼序列从而鉴定突变基因,并运用生物信息学方法分析预测突变基因的功能.结果:通过菌落形态变化及生物膜缺陷表型筛选出39株突变株,成功鉴定其中16株突变株,涉及16个基因发生突变,其中5个与脂质代谢相关,4个与细胞壁合成相关、2个与中间代谢和呼吸作用相关、1个调节蛋白相关基因,1个毒力相关基因,1个PE/PPE家族基因,还有2个功能未知基因.结合生物膜形成缺陷分析,其中8个基因可能与H37Ra体外生物膜的形成相关.结论:成功构建库容量约为l×104结核分枝杆菌转座子随机插入突变文库,筛选获得生物膜生长受损突变株及可能与结核分枝杆菌生物膜形成相关的基因信息,为后续深入开展生物膜形成机制研究奠定基础.     

硫化氢对大鼠内毒素性急性肺损伤肺泡表面活性物质的影响

目的：观察脂多糖（LPS）所致内毒素性急性肺损伤（ALI）大鼠肺泡表面活性物质（PS）的变化及硫化氢（H2S）对PS的影响,探讨H2S对肺脏的作用机制。方法：雄性SD大鼠共48只,随机分为6组（n=8）：空白对照组、LPS组、LPS＋NaHS低、中、高剂量组、LPS＋PPG组。空白对照组给予生理盐水,LPS组给予LPS,LPS＋NaHS低、中、高剂量组和LPS＋PPG组分别在给予LPS3h时腹腔注射低、中、高剂量氢硫化钠（NariS）或炔丙基甘氨酸（PPG）。各组均于给予生理盐水或LPS6h时电镜下观察肺泡Ⅱ型上皮细胞（AEC-Ⅱ）的形态改变,检测血浆中H2S含量、肺组织中胱硫醚-γ-裂解酶（CSE）活性、肺泡灌洗液（BALF）中总蛋白（1P）和总磷脂（TPL）含量、及肺组织中肺泡表面活性蛋白A、B、C（SP-A、B、C）mRNA表达的变化。结果：①与空白对照组比较,LPS组AEC-Ⅱ超微结构明显受损,血浆中H2S含量、肺组织中CSE活性、BALF中TPL的含量、及肺组织中SP-A、B、CmRNA表达均明显降低（P〈0．05,P〈0．01）,BALF中TP的含量明显增加（P〈0．01）;②与LPS组比较,LPS＋NaHS低、中、高剂量组,AEC-Ⅱ超微结构均有所恢复,血浆中H2S含量、肺组织中CSE海性、SP-AmRNA表达均明显升高（P〈0．05,P〈0．01）;LPS＋NaHS中、高剂量组BALF中吼含量明显增高,SP-BmRNA表达升高（P〈0．05）;LPS＋NaHS高剂量组BALF中,IP含量明显降低（P〈0．05）;LPS＋NaHS各剂量组SP-CznRNA表达无明显变化;③与LPS组比较,LPS＋PPG组AEC-Ⅱ超微结构仍损伤严重,血浆中H2S含量、肺组织中CSE活性、BALF中TPL的含量、及肺组织中SP-A、B、CmRNA表达均明显降低（P〈0．05）,BALF中TP的含量明显升高（P〈0．05）。结论：PS降低是内毒素性ALI的重要病理生理过程,H2S对LPS诱导的ALI有保护性作用,其机制可能与H2S对PS的调节有关。     

抗结核分枝杆菌RpfB结构域单克隆抗体的制备及鉴定

目的:制备抗结核分枝杆菌Rpf B结构域单克隆抗体。方法:将p PRO-EXHT-Rpf B domain原核表达载体接种于大肠杆菌DH5中,用IPTG诱导表达Rpf B结构域蛋白,以纯化的Rpf B结构域蛋白作为免疫原,皮下包埋免疫小鼠3次,每次间隔2周;分离小鼠的脾细胞,与Sp2/0细胞融合,克隆化制备抗Rpf B结构域单抗,ELISA检测其效价,鉴定其特异性和相对亲和力,观察制备的抗Rpf B结构域单抗对Rpf家族其他蛋白的识别能力及其对结核分枝杆菌和藤黄微球菌的生长抑制作用。结果:制备了3株抗Rpf B结构域单抗,特异性高,亲和力较强,均能特异性识别Rpf B结构域。经小鼠腹腔注射制备腹水并纯化,获得了较高纯度的单抗,所制备的抗Rpf B结构域多肽的单克隆抗体可以识别多种Rpf样蛋白及其结构域蛋白。在抗体滴度为1∶1000时可有效抑制Rpf B结构域对结核分枝杆菌H37Ra和藤黄微球菌的生长促进作用,提示抗Rpf B结构域单抗可能会抑制进入机体内生长停滞或潜伏感染的结核分枝杆菌的再次激活,可能具有预防隐性感染复发的作用。结论:抗Rpf B结构域单抗的制备为进一步研究Rpf B结构域的生物学和免疫特性提供了实验工具。     

人肺表面活性相关蛋白Al在酿酒酵母中表达、纯化及活性分析

将编码正常人肺表面活性物质相关蛋白A1基因的cDNA克隆至酿酒酵母的分泌表达载体pVT102U/α中,构建了重组质粒pVT102U/α-SP-A1,转化酵母宿主菌S-78,通过改变培养基的pH值水平,经摇瓶培养,SDS-PAGE结果显示,培养上清中SP-A1表达量达400mg/L以上,表达产物分子量为62kD和32kD.分别以二聚体和单体形式出现.ELISA和Western blot实验表明表达产物能被抗体特异性识别.生物学活性检测证实其具有调理肺巨噬细胞吞噬E.coli的功能.     

分枝杆菌glpX基因的功能

【目的】构建耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis)glpX基因敲除株,研究其在生理代谢中的功能。【方法】利用分枝杆菌噬菌体Che9c重组系统构建耻垢分枝杆菌glpX基因敲除株;比较野生株及突变株在不同碳源培养条件下的生长差异;通过荧光实时定量PCR,比较野生株在以葡萄糖或油酸为唯一碳源培养下,glpX基因的表达水平。【结果】glpX突变株在以甘油或油酸为唯一碳源的培养基中无法生长;野生株在以油酸为唯一碳源培养下,glpX基因表达上调。【结论】glpX基因编码了分枝杆菌糖异生途径必需的和非冗余的果糖1,6-二磷酸酶(fructose 1,6-bisphosphatase,FBPase)。     

L-Arg对LPS诱导的急性肺损伤大鼠肺表面活性物质和肺泡巨噬细胞功能的影响

目的:探讨L-精氨酸(L-Arg)对脂多糖(LPS)诱导的急性肺损伤大鼠肺表面活性物质和肺泡巨噬细胞功能的影响。方法:舌下静脉注射脂多糖(LPS)复制肺损伤模型。健康雄性SD大鼠48只,随机分为对照组、模型组(LPS组)和L-Arg治疗组(L-Arg组)(n=16)。分别于给予LPS 3 h或6 h后给予生理盐水(对照组及LPS组,ip)和L-Arg(500 mg/kg ip)(L-Arg治疗组),治疗3 h。原位杂交法(ISH)检测肺组织中肺表面活性蛋白A(SP-A)mRNA的表达;测定肺泡灌洗液(BALF)中的总蛋白(TP)。体外分离培养大鼠肺泡巨噬细胞,以LPS(终浓度10 mg/L)处理巨噬细胞,观察L-Arg对肺泡巨噬细胞的影响。结果:与对照组比较,大鼠肺损伤后SP-A mRNA表达减弱,BALF中TP增多(P<0.01)。肺损伤3 h用L-Arg治疗3 h后,SP-A mRNA阳性细胞表达明显增强,BALF中TP较LPS组相同时间点明显降低(P<0.05,P<0.01),肺损伤减轻。体外实验中,与正常对照组相比,LPS组细胞培养上清中乳酸脱氢酶(LDH)、一氧化氮(NO)、肿瘤坏死因子-α(TNFα-)和白细胞介素-6(IL-6)浓度明显增高(P<0.01);L-Arg明显减少LPS所致的LDH的释放,降低TNFα-和IL-6浓度。结论:L-Arg可减轻内毒素性肺损伤,此机制可能与增强SP-AmRNA表达有关;LPS可刺激巨噬细胞分泌促炎因子和NO,L-Arg可抑制LPS对巨噬细胞的作用。     

肺表面活性物质治疗新生儿NRDS给药方法与体位的改进

新生儿呼吸窘迫综合征（NRDS）又称新生儿肺透明膜病,是发达国家和发展中国家儿科围生期患病率和病死率较高的疾病,多见于早产儿。由于早产儿肺发育不成熟,肺表面活性物质（PS）不足导致肺泡萎缩以及肺顺应性降低,多于生后24h内出现,以呼吸困难进行性加重为主要表现,是早产儿死亡的主要原因之一。     

高频振荡通气联合肺表面活性物质对NRDS患儿血流动力学、氧合功能及炎症因子水平的影响

目的:探讨高频振荡通气(HFOV)联合肺表面活性物质(PS)对新生儿呼吸窘迫综合征(NRDS)血流动力学、氧合功能及炎症因子水平的影响。方法:选取2016年6月~2019年4月期间我院接收的129例NRDS患儿,按照随机数字表法将患儿分为研究组(n=65)、对照组(n=64),均给予PS治疗,在此基础上,对照组患儿给予常频机械通气(CMV)治疗,研究组给予HFOV治疗,比较两组患儿疗效、血流动力学、氧合功能、炎症因子水平及并发症发生情况。结果:研究组治疗24h后的临床总有效率为89.23%(58/65),高于对照组的68.75%(44/64)(P<0.05)。两组患儿治疗24h后动脉血氧分压(PaO2)升高,且研究组高于对照组(P<0.05);心率(HR)、肺动脉压(PAP)、白介素-6(IL-6)、降钙素原(PCT)、超敏C反应蛋白(hs-CRP)、动脉二氧化碳分压(PaCO2)、氧合指数(OI)均下降,且研究组低于对照组(P<0.05)。两组并发症总发生率比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论:HFOV联合PS治疗NRDS可有效改善患儿血流动力学、氧合功能及炎症因子水平,且不增加并发症发生率,临床应用价值较高。     

人肺表面活性相关蛋白A1在酿酒酵母中表达、纯化及活性分析

将编码正常人肺表面活性物质相关蛋白A1基因的cDNA克隆至酿酒酵母的分泌表达载体pVT102U/α中,构建了重组质粒pVT102U/α-SP-A1,转化酵母宿主菌S-78,通过改变培养基的pH值水平,经摇瓶培养,SDS-PAGE结果显示,培养上清中SP-A1表达量达400mg/L以上,表达产物分子量为62kD和32kD。分别以二聚体和单体形式出现。ELISA和Western blot实验表明表达产物能被抗体特异性识别。生物学活性检测证实其具有调理肺巨噬细胞吞噬E.coli的功能。     

海分枝杆菌mas基因的功能研究

目的研究海分枝杆菌结核蜡酸合酶(mycocerosic acid synthase,mas)基因在致病中的机制。方法在海分枝杆菌转座子随机突变库中,以菌落形态和抗酸染色的索状形态为标志筛选出索状结构改变的突变株;检测细菌在巨噬细胞内的增殖能力以及斑马鱼感染后的生存率及病理改变。结果获得插入位点位于mas基因不同位置的3个索状结构突变株。海分枝杆菌mas突变株在巨噬细胞内增殖能力减弱;其对斑马鱼的致死能力急剧下降,在斑马鱼体内不能形成肉芽肿并很快被清除。结论海分枝杆菌mas基因与其索状结构形成密切相关,并且对其在巨噬细胞内及宿主体内的生存和繁殖十分重要。