VHA-c2&c4双基因沉默株系拟南芥对NaCl与ABA的响应

研究液泡H~+-ATPase c亚基基因(VHA-c2和VHA-c4)在植物生长发育及响应非生物胁迫过程中的功能,构建拟南芥VHA-c2c4的RNAi表达载体,通过浸花法转化野生型拟南芥。利用卡那霉素筛选纯合体株系,进行半定量PCR鉴定,并对其进行NaCl和ABA胁迫处理。获得7个T_2代双沉默基因纯合体株系,其VHA-c2和VHA-c4的mRNA表达水平均低于野生型。挑选沉默效率较高的3个株系进行NaCl和ABA处理,在NaCl处理下,它们的主根相对伸长量和种子萌发率均小于对照,表明VHAc2c4沉默株系对NaCl胁迫作用敏感。ABA处理下,子叶的展开程度和主根相对伸长量均比对照高,表明VHA-c2c4沉默株系对ABA抑制作用不敏感。NMT试验表明ABA促进了双沉默基因纯合体株系的H+内流能力。推测VHA-c2和VHA-c4的转录水平影响了植物对盐胁迫和ABA介导的信号转导途径的响应。     

过表达VHA-c3基因拟南芥对黑暗、ABA与糖的响应

为研究液泡H+-ATPase c亚基基因(VHA-c3)在植物生长发育及非生物胁迫应答过程中的作用,构建了VHA-c3过表达载体转化拟南芥,获得过表达VHA-c3的转基因纯合体植株,采用半定量RT-PCR技术分析了转基因拟南芥中VHA-c3的表达量,然后对转基因拟南芥进行暗培养、ABA和糖处理。结果获得6个T2代株系转基因纯合体株系,其m RNA表达量均高于对照;黑暗条件下,5个VHA-c3转基因株系的根长变短;在正常光照下,3个转基因株系主根伸长和子叶的展开以及5个转基因株系的种子萌发对ABA的抑制不敏感;分别有5个和6个转基因株系的种子萌发对葡萄糖和蔗糖的抑制不敏感。推测VHA-c3可能影响根细胞的扩展,并可能参与ABA和糖介导的信号转导途径。     

过表达VHA-c1基因对拟南芥根长及ABA与糖响应的影响

为初步探讨液泡H+-ATPase c亚基基因(VHA-c1)在植物生长发育及信号转导中的作用,该实验构建了拟南芥VHA-c1的过表达载体,转化并获得转基因拟南芥纯合株系,通过半定量RT-PCR技术分析了VHA-c1的表达量,然后对其进行暗培养、ABA和糖处理。结果显示:(1)该实验获得7个T2代转基因纯系,其mRNA表达水平均高于野生型,表明过表达载体的构建是有效的。(2)黑暗条件下,6个拟南芥VHA-c1过表达纯合株系的根长变短。(3)光照条件下,4个转基因株系主根伸长和子叶的展开以及7个转基因株系的种子萌发对ABA的抑制不敏感。(4)分别有5个和4个转基因株系的种子萌发对葡萄糖和蔗糖的抑制不敏感。推测VHA-c1可能参与了ABA和糖介导的信号转导途径,并可能影响了拟南芥根细胞的扩展。     

过表达VHA-c4和VHA-c5基因对拟南芥根长的影响

为研究液泡H+-ATPase c亚基VHA-c4和VHA-c5基因在植物生长发育过程中的作用,本研究构建了拟南芥VHA-c4和VHA-c5过表达载体并转化野生型拟南芥,分别获得9个和7个T2代转基因纯合体株系。采用半定量RT-PCR方法对过表达VHA-c4和VHA-c5的转基因纯合体进行阳性鉴定,发现其mRNA表达量均高于对照。对转基因纯合体进行暗培养和正常光照培养,结果显示,黑暗条件下,所有VHA-c4转基因株系的主根变短,而在正常光照下,所有VHA-c5转基因株系的主根变短,推测VHA-c4和VHA-c5分别在黑暗和光照条件下影响植物根的生长。用ABA和糖(葡萄糖和蔗糖)处理转基因纯合体,结果显示它们与野生型的表型无明显差异,表明VHA-c4和VHA-c5基因的过表达没有影响拟南芥对ABA和糖的响应。     

转CkLEA4基因拟南芥种子萌发期的抗逆性分析

该研究在实验室前期研究的基础上,将受脱水、盐胁迫和ABA诱导的柠条锦鸡儿CkLEA4基因转入野生型拟南芥,并利用实时荧光定量PCR从8株纯合体中筛选出3个表达量不同的株系,比较野生型和转CkLEA4基因过表达拟南芥种子在不同胁迫处理下的萌发率,以探讨CkLEA4基因在植物抵抗逆境胁迫中的功能。结果发现:(1)在不同浓度NaCl、甘露醇及ABA处理下,转CkLEA4基因过表达拟南芥种子的萌发率均高于野生型,随着NaCl、甘露醇及ABA浓度增加,各株系萌发率均降低,但野生型的萌发率下降幅度均高于3个过表达株系,并且在200mmol/L NaCl和400mmol/L甘露醇处理下,过表达株系子叶绿化率均显著高于野生型。(2)在低浓度ABA处理下,CkLEA4过表达植株子叶的绿化率也高于野生型。研究表明,柠条锦鸡儿CkLEA4基因提高了拟南芥种子萌发阶段对盐、ABA及渗透胁迫的耐受性。     

拟南芥prr5突变体对ABA的响应

以拟南芥为材料,统计PRRs （pseudo-response regulators）突变体 prr5及其野生型经ABA处理后的萌发率、根长和NaCl处理后的萌发率,并采用实时定量PCR方法,对不同浓度ABA处理的拟南芥幼苗中的PRR5基因表达进行分析.结果表明：prr5突变体对ABA弱敏感,其种子萌发率比野生型显著或极显著增高,主根比野生型长,且PRR5基因表达受ABA抑制.同时,NaCl处理后,prr5的萌发率比野生型极显著增高.因此,推测prr5可能为ABA信号通路相关基因.     

陆地棉GhPYR1基因的克隆和功能分析

植物激素脱落酸(Abscisic acid,ABA)在植物应对干旱、盐碱等逆境胁迫以及植物种子萌发、根伸长、芽休眠等阶段发挥重要作用。PYR/PYL/RCAR蛋白家族是ABA受体,与ABA结合后能够启动ABA信号传导通路,诱导ABA应答基因的表达。利用电子克隆和RT-PCR技术从陆地棉中克隆了Gh PYR1基因,其编码的Gh PYR1蛋白与拟南芥中At PYR1蛋白相似度为73%。将Gh PYR1蛋白序列与拟南芥14个PYR/PYL/RCAR家族成员蛋白序列进行比对并构建进化树,发现它与拟南芥PYR/PYL/RCAR蛋白亚家族III亲缘关系最近。过表达Gh PYR1基因的T3代拟南芥在外源ABA处理下,其种子萌发和初期根生长均滞后于野生型,表现出对ABA更加敏感;高盐和干旱胁迫对转基因种子的萌发抑制更强烈,但苗期胁迫处理下转基因拟南芥的长势却明显优于野生型;同时在外源ABA诱导条件下ABA应答基因RD29A、RAB18的表达量较野生型有明显提高。以上结果说明Gh PYR1基因编码的蛋白是ABA的受体,过表达该基因能够提高植物对ABA的敏感性和增强应对逆境胁迫的能力。     

小麦E3泛素连接酶基因TaAIRP2-1B克隆及功能分析

干旱等非生物胁迫严重影响农作物生产。本研究克隆了小麦(Triticum aestivum L.)TaAIRP2-1B基因,探讨其对非生物胁迫的响应机制,为促进小麦抗旱性的遗传改良提供基因资源。组织特异性表达模式分析显示,TaAIRP2-1B基因在小麦抽穗期的各个组织中均有表达,在茎组织中的表达水平较高,而根系中的表达水平较低。非生物胁迫表达模式分析显示,Ta AIRP2-1B受ABA、PEG及冷胁迫诱导表达。过表达TaAIRP2-1B拟南芥在0.4μmol/L的ABA处理条件下,种子发芽率显著低于野生型,表明TaAIRP2-1B提高了拟南芥种子萌发期对ABA的敏感性。ABA处理抑制转基因和野生型拟南芥幼苗的根系生长,但转基因拟南芥受抑制程度显著高于野生型,表明TaAIRP2-1B提高了拟南芥幼苗对ABA的敏感性。转基因结果表明超表达TaAIRP2-1B增强了拟南芥的抗旱性,并且转基因株系的保水率显著高于野生型。总之,本研究发现小麦基因Ta AIRP2-1B参与了植物对非生物胁迫的应答,可能是通过ABA途径正向调控植物的抗旱性。     

转ZjAPX基因拟南芥对NaCl、干旱胁迫的耐性研究

旨在探讨枣树抗坏血酸过氧化物酶基因ZjAPX在植物渗透胁迫中的作用。将ZjAPX基因转入到模式植物拟南芥,以野生型(WT)、转ZjAPX拟南芥株系T2为试材,进行不同浓度NaCl胁迫和干旱胁迫。结果表明,转基因株系的种子萌发、植株生长均优于野生型株系;荧光定量PCR检测转基因拟南芥植株在干旱和盐胁迫处理10 d后目的基因ZjAPX的表达量显著高于野生拟南芥,表明ZjAPX的高表达明显提高了植株的抗旱和耐盐性。     

拟南芥ABA敏感突变体asm1的分离与鉴定

以拟南芥(Arabidopsis thaliana)为研究材料,从T-DNA突变体库中筛选分离得到1株脱落酸(ABA)敏感突变体asm1(ABA sensitive mutant 1,asm1),在含有ABA的培养基中,与野生型相比,asm1突变体的根伸长明显受到抑制,且其种子萌发结果显示asm1对ABA同样表现出敏感特性。在生长发育方面,asm1突变体抽苔时间提前,植株矮化,并且荚果长度明显小于野生型。利用远红外成像系统分析发现,在干旱胁迫下asm1突变体叶面温度高于野生型;失水率分析显示突变体失水率降低以及水分散失减少。遗传学分析表明,asm1是单基因隐性突变且与一个T-DNA插入共分离;通过图位克隆成功获得候选基因ASM1。RT-PCR结果显示,在突变体中ASM1的表达受到抑制,并且能够调控多种ABA信号通路和胁迫应答基因的表达水平。研究结果表明,ASM1可能参与调控ABA信号转导并应答干旱胁迫。     

异源表达CkLEA1基因增强了拟南芥对非生物胁迫的耐受性

植物在生长过程中会受到各种非生物胁迫的伤害,导致生长发育和产量受到严重影响,胚胎晚期丰富蛋白（late embryogenesis abundant proteins,LEA蛋白）在植物抵抗非生物胁迫过程中起着重要的保护作用。在前期的研究基础上,将受多种胁迫诱导的柠条锦鸡儿CkLEA1（GenBank登录号KC309408）基因转入野生型拟南芥,通过实时荧光定量PCR从7株T₃代纯合体中筛选出3个转基因株系做进一步研究。种子萌发率实验发现,在200 mmol/L NaCl和400 mmol/L甘露醇处理下,转基因株系萌发率均高于野生型拟南芥。干旱处理2周大的幼苗后,转基因株系明显比野生型更抗旱,存活率高于野生型,并且失水率低于野生型。同时,转基因株系积累了较少的丙二醛（MDA）,超氧化物歧化酶（SOD）活性和谷胱甘肽（GSH）含量也高于野生型。这些结果表明,柠条锦鸡儿CkLEA1基因在种子萌发阶段提高了拟南芥对盐和渗透胁迫的耐受性,并且提高了转基因拟南芥幼苗生长阶段对干旱胁迫的抵抗能力。     

中间锦鸡儿WRKY75基因对拟南芥耐受盐和ABA能力的影响

该研究从旱生灌木中间锦鸡儿中克隆得到1个CiWRKY75基因。序列分析显示,CiWRKY75开放阅读框长570bp,编码189个氨基酸,含有1个WRKYGQK基序和1个C2H2型锌指结构,属于第二类WRKY转录因子。亚细胞定位显示,CiWRKY75定位于细胞核。实时荧光定量PCR检测表明,CiWRKY75基因的表达受盐胁迫和ABA诱导。在拟南芥中过量表达CiWRKY75后,与野生型拟南芥相比,转基因株系种子的萌发率在盐胁迫下降低,并且对盐胁迫的耐受能力明显减弱;ABA处理下,2个转基因株系的种子萌发率(10.3%、9.6%)较野生型(25.9%)明显降低。研究表明,CiWRKY75是中间锦鸡儿对盐和ABA响应的重要调控因子。     

J-蛋白AtJ8在拟南芥渗透胁迫适应方面的作用

At J8是拟南芥J-蛋白家族成员。已有报道,At J8定位于叶绿体中,参与光合作用的调节。该文主要研究At J8在适应盐和水分胁迫方面的作用。实时定量PCR结果表明,盐、水分胁迫及脱落酸(abscisic acid,ABA)诱导At J8基因的表达。反向遗传学研究显示,在正常生长条件下,At J8突变体(atj8-1)的种子萌发率及绿色子叶出现率与野生型(WT)和突变体恢复株系(R4-1)没有明显差别;在盐和水分胁迫条件下,atj8-1种子萌发延迟,绿色子叶出现率明显低于WT和R4-1株系,表明At J8可能在调节种子及幼苗对渗透胁迫的适应性方面发挥重要作用。此外,实时定量PCR结果显示,At J8基因突变改变了ABA反应基因ABI1、ABI2、RAB18、RD29A和RD29B的表达,说明At J8调节植物对渗透胁迫的适应性可能是通过影响ABA信号途径来完成的。     

钙传感蛋白互作激酶CIPK14参与拟南芥盐和ABA胁迫应答调节

钙和蛋白激酶在植物胁迫应答过程中起重要作用．本研究以拟南芥蛋白激酶CIPKl4的T—DNA插入突变体为材料,系统研究了CIPK14基因在不同组织与生长发育期的表达情况,和CIPKl4基因的钙调节属性及其在胁迫应答过程中的作用．研究发现CIPKl4基因在拟南芥根、茎、叶、花各组织器官中都有所表达,其中花器官和根部表达量较为显著;不同阶段比较发现CIPKl4在幼苗期具有较高的转录水平．研究同时发现,ABA和盐胁迫能激活CIPKl4基因的转录;CIPKl4T-DNA插入突变体中一系列胁迫应答基因的转录水平全都不同程度地降低或表达滞后,说明CIPKl4基因在胁迫应答中起作用．另外,CIPKl4突变体的种子萌发和根伸长对各种渗透胁迫敏感,并且ABA合成抑制剂哒草伏（Norflurazon）能部分恢复突变体对ABA,盐等的敏感表型．进一步证明CIPKl4是胁迫应答相关基因．研究还发现,CIPKl4的转录受到极端浓度下外源钙离子的激活,另外在一定胁迫条件下,突变体中RD29A基因的表达对外源钙离子浓度变化不敏感,说明CIPKl4基因功能缺失降低了受钙调节的胁迫相关基因对外源钙的敏感性．相应的表型分析发现,突变体种子萌发和根伸长与野生型相比对外源钙敏感性下降,进一步证明CIPKl4基因接受钙信号调节,并作用于拟南芥ABA和盐胁迫应答信号途径,激活胁迫相关转录因子．     

胡杨PeECT8基因的克隆及功能分析

ECT基因家族已在拟南芥中被发现并报道,然而它们是否参与植物在逆境胁迫下的响应过程却鲜有报道。为研究胡杨PeECT8基因的功能,从胡杨叶片cDNA中克隆出PeECT8基因,构建CaMV 35S::Pe ECT8植物表达载体,利用花序浸染法转化拟南芥,经GUS组织化学染色和PCR检测,获得转基因植株,进而测定不同浓度盐(Na Cl)和甘露醇胁迫下转基因拟南芥种子的萌发率、生长势和根长。测序结果表明,该基因编码区长度为1821 bp,可编码606个氨基酸。蛋白序列比对发现,PeECT8基因与毛果杨PtrECT8同源基因所编码的氨基酸一致性达93.42%,PeECT8蛋白包含一个YT521-B-like保守结构域。相比于野生型,过量表达PeECT8的拟南芥在不同浓度NaCl胁迫下萌发率降低,在D-甘露醇胁迫下萌发率没有明显变化。在NaCl和D-甘露醇胁迫下,转基因拟南芥根的伸长长度小于野生型。这表明PeECT8基因在盐胁迫和渗透胁迫下发挥负调控的作用。     

过量表达棉花GaSus3基因增强拟南芥的耐盐性

构建了植物过量表达载体p35S：：GaSus3,通过花序浸染法成功获得转GaSus3基因拟南芥植株。利用NaCl模拟盐胁迫处理,证实转基因拟南芥与野生型相比耐盐性明显增强。在盐胁迫下,转基因拟南芥受到的影响较小,而野生型则受盐害影响严重：转基因拟南芥具有更好的萌发率和主根长度,以保证植株正常生长;盐胁迫下转基因拟南芥能保持较多的绿色叶片,而野生型则过早黄化死亡。研究还发现,转基因拟南芥的过氧化氢酶活性在胁迫前后都高于野生型,这说明转GaSus3基因能够提高拟南芥抗氧化胁迫的能力。研究结果为进一步探讨GaSus3基因在棉花耐盐方面的功能奠定了基础。     

6-BA拮抗脱落酸缓解渗透胁迫对种子萌发的抑制

细胞分裂素促进细胞分裂、芽的分化,拮抗脱落酸抑制的种子萌发,而细胞分裂素合成基因Ipt84在种子萌发过程中发挥重要的作用。本文分别用120mmol·L-1 NaCl和240mmol·L-1 甘露醇模拟盐和干旱胁迫处理拟南芥种子,探讨6一BA拮抗ABA对其抑制种子萌发和萌发后生长的影响。结果表明,细胞分裂素合成相关突变体ipt6-1、ipt6-2、ipt8．1和ipt8-2的种子萌发和生长可被NaCl和甘露醇显著抑制;而ABA合成相关突变体aba2-1对相同浓度NaCl和甘露醇的处理表现相对不敏感。进一步研究发现添加外源6一BA可恢复ipt6-1、ipt6-2、ipt8-1和ipt8—2的相关敏感表型,并且随6-BA浓度的增加,恢复效果也愈趋明显。     

AtNHX5基因过量表达对拟南芥耐盐性的影响

为了研究AtNHX5基因在植物耐盐中的作用,构建了植物过量表达载体pROKⅡ-AtNHX5,并转化拟南芥。结果显示:(1)RT-PCR检测表明,转基因拟南芥中AtNHX5基因的表达大幅提高。(2)对转基因纯合株系进行耐盐性分析显示,AtNHX5过量表达提高了植株在种子萌发和苗期的耐盐性。(3)转基因植株在盐处理下的干重、鲜重以及地上部分Na+、K+含量均高于野生型对照。在200mmol/L NaCl处理下,以转基因株系a1-4为例,其地上部分单株鲜重、单株干重、K+含量分别是野生型的1.27、1.54、1.16倍,较野生型显著升高。研究表明,过量表达AtNHX5基因促进了盐胁迫下转基因植株对K+的吸收,转基因拟南芥的耐盐性明显提高。     

拟南芥高迁移率族蛋白B族基因表达模式分析

为了解高迁移率族蛋白B族(HMGB)基因在拟南芥中的表达模式及作用方式,该研究克隆了拟南芥中5个编码HMGB的基因:AtHMGB1、AtHMGB2、AtHMGB3、AtHMGB4、AtHMGB5,并运用荧光实时定量PCR方法检测野生型拟南芥中以上5种基因在不同器官中的表达及在外源植物激素(ABA、2,4-D)处理前后的表达差异,选取AtHMGB2、AtHMGB4和AtHMGB5分别转化拟南芥并筛选出超表达株系,随即检测ABA诱导下超表达AtHMGB的转基因拟南芥的表型。研究证实:在野生型拟南芥中AtHMGB2在拟南芥各个器官中的表达量远高于其它家族成员,AtHMGB4和AtHMGB5在花、果荚和根中的表达略高于茎和叶;在ABA处理前后AtHMGB家族成员的表达水平有显著差异,其中AtHMGB2的表达被ABA显著负调控;ABA诱导下超表达AtHMGB2的转基因拟南芥与野生型相比出现萌发及生长迟缓现象,但超表达AtHMGB4与AtHMGB5的转基因拟南芥在ABA诱导下的种子萌发和幼苗生长与野生型相比差异不大。研究发现,AtHMGB家族成员在转录水平上响应ABA的方式各有不同,对理解AtHMGB家族成员的生物学功能提供了新的基础。     

PLDα1介导ABA调控的拟南芥主根伸长并参与根毛生长

探讨了磷脂酶Dα1（PLDα1）在ABA抑制拟南芥主根伸长过程中的作用。PLOα1基因突变体pldα1主根伸长受ABA抑制小于野生型（WT）;根系PLDα1活性在ABA处理下升高;拟南芥根细胞原生质体中活性氧（ROS）含量在ABA处理下升高,但是pldα1升高小于WT;根系NADPH氧化酶活性在ABA处理下升高,pldα1升高小于WT,外源加入10μmol/L^-1 PA（磷脂酸,PLD水解产物）后,前者活性显著升高;外源加入H2O2可诱导WT和pldα1主根伸长都受到抑制,且二者差异不明显。结果表明,PLDα1产生的PA通过激活NADPH氧化酶产生ROS介导ABA调控的拟南芥主根伸长过程。此外,初步探讨了PLDα1在拟南芥根毛尖端生长中的作用：pldα1突变体根毛长度小于WT,根毛尖端ROS和Ca^2＋浓度低于WT。