cDNA捕捉法获得水稻杂种不育基因座位Sc区域的编码序列

摘要：cDNA捕获法足一种以表达为基础的基因分离技术,直接用目的区域的基因DNA捕捉该区域编码的cDNA,快速从大的基因组区域分离表达序列。本研究用一个水稻杂种不育基因座位Sc附近的大片段TAC基因组片段来捕捉该区域在水稻穗部表达的cDNA,共获得了6条不同的cDNA。将这些cDNA克隆进行测序分析,获得了该区域在水稻部表达的部分基因,其中1个是籼稻特有的基因。这些cDNA片段可成为新的标记用于目的基因的精细定位和候选基因序列分析。     

水稻的杂种不育研究进展

水稻亚种间杂种优势利用曾使水稻单产有了很大的提高,但水稻种间与亚种间的杂种不育性仍然普遍存在,从而影响了杂种优势的进一步利用。本研究对水稻产生杂种不育的细胞学水平原因进行了分类分析,对产生杂种不育的遗传学机理进行了探讨,对各种杂种不育基因座位的定位以及已克隆获得的基因进行了全面总结,并对如何克服杂交不育与利用杂种优势提出了自己的观点。     

水稻日本晴与广陆矮4号杂交F2群体SSR标记偏分离原因探析

以全基因组测序已经完成的材料粳稻日本晴和完成了第4染色体全序列测序的籼稻广陆矮4号的杂交F2作为构图群体,共90个单株,构建了一张含148个微卫星标记的水稻分子遗传图谱。该F2群体显著偏分离非常高,发现有49个分子标记表现偏分离（P〈0．05）,占总标记数的33．11％,这些偏分离标记中有36个偏向广陆4号,13个偏向杂合体,没有偏向日本晴的偏分离标记。讨论了配子体基因和孢子体基因导致偏分离的原因,通过已经定位的配子体基因和杂种不育基因分布在偏分离集中的区域来进一步说明配子体基因和杂种不育基因确实是导致偏分离形成的原因,而且还通过未定位的标记分析了偏分离的原因。     

水稻矮秆基因iga-1的序列变异和表达分析

该研究以水稻矮秆突变体cha-2为材料,对控制其表型性状的iga-1基因进行候选基因筛选,利用基因注释数据库对定位区间进行候选基因预测,通过ORF及其上下游调控区域的测序、序列比对及关键元件分析进行序列变异研究,半定量PCR检测目标基因的表达模式,明确其在基因序列、表达模式的变异,探讨其分子遗传调控机理。结果显示:(1)在隐性核基因iga-1精细定位基础上预测得到3个ORF,其中2个编码dnaJ分子伴侣(含有dnaJ结构域的蛋白),分别是LOC_Os05g26902和LOC_Os05g26926;另外1个为已克隆的水稻矮秆基因RGA1(LOC_Os05g26890)。(2)ORF序列分析表明矮秆突变体cha-2与野生型仅在RGA1基因座存在SNP变异,但未造成氨基酸编码的改变。(3)表达模式分析发现,矮秆突变体cha-2的RGA1基因在种子萌发期、二叶期、四叶期和分蘖期等4个发育时期均不表达,且在‘中花11’、‘石狩白茅’的遗传背景下稳定遗传,均显现出失活状态,初步确定RGA1为iga-1的候选基因。(4)对RGA1基因上游和下游调控转录关键区进行测序结果表明,突变体cha-2存在865bp的大片段缺失,包括第1外显子、部分第1内含子和转录起始上游区域。研究推断,突变体cha-2的矮秆基因iga-1正是没有活性的RGA1基因,其转录关键区域的大片段缺失,导致无法正常转录表达。     

主要农作物细胞质雄性不育系育性恢复基因研究进展

提升作物产量、抗逆性和品质的主要手段之一是利用杂种优势,其中细胞质雄性不育/恢复(CMS/Rf)系统是应用最广的雄性不育系统。研究细胞质雄性不育系育性恢复机理是“三系”法选育的重要分子遗传学基础。目前,各个作物已经创制了不同类型的不育系。随着分子技术、基因组学和测序技术的深入,大量育性恢复基因已被定位,且部分已被克隆和功能鉴定。针对主要作物中恢复基因的遗传模式,分子标记定位、克隆及CMS/Rf系统在杂交育种中的应用进行了系统总结。希望本文能为今后恢复系分子标记辅助选育,或利用转基因、基因编辑手段创制新恢复系提供思路。     

玉米隐性核不育突变体ms14的遗传分析与基因定位

玉米雄性不育材料是一种宝贵的种质资源,不育基因的遗传分析与定位研究对玉米分子育种和杂种优势利用具有重要价值。通过对从美国引进的玉米雄性不育突变体材料ms14进行雄花育性鉴定和花药I₂-KI染色,表明该突变体是无花粉型雄性不育;通过不育突变体ms14与正常自交系郑58、昌7-2杂交获得F₁,然后自交构建两个F₂遗传分离群体（ms14×郑58和ms14×昌7-2）,并进行雄花育性调查、数据统计和遗传分析,发现可育株数与不育株数的分离比是3∶1,表明该突变体由隐性单基因控制;通过SSR等分子标记与不育位点的连锁分析,将ms14基因定位在玉米第1染色体的SSR标记umc2025和umc1676之间,遗传距离分别是2.2cM和0.3cM。对玉米不育基因ms14的遗传分析和初步定位,为该基因的精细定位和克隆、不育机理的解析及其产业化应用奠定了基础。     

水稻优良性状控制基因的定位进展及其在染色体上的分布

利用分子标记可以寻找并且定位目的基因, 分子标记辅助育种技术则能够快速、高效地筛选出携带目的基因的优良品种。文章总结了近年来水稻中已被定位的优良性状控制基因及与其连锁的分子标记, 其中包括抗病虫害、抗寒、抗旱、不育、育性恢复等194个基因, 这些基因中已有14个被克隆测序。在此基础上探讨了这些基因在染色体上的分布趋势。     

栽培稻F1花粉不育基因座S—b的PCR标记定位

栽培稻 (OryzasativaL .)杂种F1花粉不育性至少由 6个基因座位所控制。为了定位其中的一个基因座位S b ,选用了 15 8个微卫星标记对粳型品种“台中 6 5”及其近等基因系TISL2之间的多态性进行了分析。结果发现第 5染色体短臂上的RM13在亲本间存在多态性。连锁分析表明 ,RM13与S b座位紧密连锁。根据微卫星标记分析的结果 ,在RGP(RiceGenomeResearchProgramofJapan)发表的遗传图谱的相应位置上选取了 11个RFLP标记 ,利用这些标记的末端序列设计特异PCR引物 ,进行ALP (ampliconlengthpolymorphism)分析 ,结果 11对引物均没有ALP。用6种四碱基识别位点的限制性内切酶进行PBR(PCR_basedRFLP)分析 ,发现由R2 2 13S和R830两克隆设计的STS(sequence_taggedsite)标记在T6 5与TISL2之间存在酶切多态性。R830STS、RM13和R2 2 13SSTS与S b座位的遗传距离分别为 3.3cM (centiMorgan)、5 .2cM和 5 .5cM。这些以PCR为基础的分子标记可以直接应用于分子标记辅助选择中 ,从而建立了基因定位与分子标记辅助选择一体化的技术体系 ,使S b座位在育种中可以得到有效的利用     

野败型水稻细胞质雄性不育恢复基因Rf-4的分子标记定位

为了用分子标记准确定位野败型水稻细胞质雄性不育恢复基因Rf-4,将日本水稻基因组项目（Rice Genome Program,RGP)构建的水稻遗传连锁图谱第10染色体分子遗传图上的分子标记R1877和G2155之间对应区域YAC物理图上的6个YAC克隆进行了亚克隆,获得119个片段,对这些探针进行多态性探查,获得了2个多态分子标记,用珍汕97A和恢复基因近等基因系的杂种F2分离群体中的117完全不育株进行连锁分析表明,从YAC4892获得的亚克隆Y3－8与Rf－4座位的连锁距离为0．9cM,从YAC4630获得的亚克隆Y1－10与Rf－4座位的连锁距离为3．2cM,根据以上结果把Rf－4座位定位于第10染色体的特定位置,为该基因的分子标记辅助选择和定位克隆打下了基础。     

定位于1p36.12～1p35.1 的良性家族性婴儿惊厥家系 8 个候选基因的排除克隆*

目的:克隆定位于1p36.12～1p35.1上微卫星标志D1S2864和D1S2830之间12.4cM的区间内的腓骨肌萎缩症2L型的致病基因。方法:应用生物信息学方法筛选8个候选基因(NHE1、SMN、STX12、OX1R、BDR2、DHHC18、FLJ10315和SESN2),设计合成扩增8个基因外显子及外显子与内含子交界的引物,DNA直接测序法进行序列变异分析。结果:未发现与BFIS共分离的致病突变,但发现3个已知的多态。结论:排除了8个候选基因为该BFIS致病基因的可能。     

栽培稻F_1花粉不育基因座S-α的分子定位

以栽培稻品种台中65及其等基因已不育系TISL4为材料,用RFLP和RAPD等技术,对F_1花粉不育基因座S－a定位。通过用RFLP和RAPD方法对亲本间进行多态性分析,发现亲本间的多态性很低,说明经多代回交后,在等基因系基因组中供体亲本的DNA片段所占的比例很小。通过连锁分析,将S－a定位在第1染色体上。S－a与分子标记CDO548、O11—1000、RG146和Y13－500之间的遗传距离分别为6.4cM、6.8cM、7.2cM和11.3cM。S－a基因座上S－a~i／S-a~j等位基因互作使携带S-a~j基因的花粉败育是寻致该F_2群体产生偏态分离的主要原因。     

大白菜细胞核复等位雄性不育基因定位

以大白菜不育材料"939A"为母本,携带恢复基因的材料YDQ56A为父本构建隐性雄性不育F1S4分离群体,利用混合分组分析法(BSA)对不育基因初定位;同时以"939A"为母本,携带保持基因的材料yellow sason为父本构建显性雄性不育F2分离群体,对不育基因进行精细定位。结果在F1S4群体中获得与不育基因连锁的标记2个,A08_1900和Br ID111035,与不育基因分别相距8.8c M和2.5c M,物理距离为804.1kb;F2群体中不育单株与可育单株分离比符合3∶1,不育基因表现为显性。通过标记验证,F2和F1S4两个群体定位结果一致,均位于A08染色体末端,通过新标记的筛选获得不育基因两侧紧密连锁的标记Br19470306和Br19675586,与不育基因分别相距1.6c M和2.4c M,物理距离205.28kb,其中包含58个基因。该结果为大白菜雄性不育系的利用以及转育奠定了基础。     

利用杂种细胞克隆板将猪CDC16基因定位于11号染色体

运用比较基因组学的方法,根据人的CDC16基因序列设计引物,从大围子猪和宁乡猪基因组DNA分离了CDC16基因内含子4和内含子8（GenBank收录号为AY880670和DQ206823）,通过扩增体细胞杂种克隆板上27个样品和辐射杂种克隆板上118个样品,确定了CDC16基因在猪染色体上的物理位置,首次将CDC16基因物理定位于猪SSC11 q11-17.该基因与微卫星SW1452标记紧密连锁,LOD值为16.08,存留率为22%,在放射杂交图谱上的图距为62 cR.CDC16基因区间定位结果与精细定位结果相一致,也与比较定位结果相一致,进一步验证了猪11号染色体和人13号染色体大部分片段存在同源性,这为该基因的克隆及和功能研究打下坚实基础.     

葡萄雄性不育基因的初步定位

为了对葡萄雄性不育基因进行定位研究,以可育葡萄‘魏可’(Vitis vinifera L.)为亲本构建的自交群体88株为试验材料,运用分离群体分组混合分析法(bulked segregant analysis,BSA),构建了可育株和不育株基因池,结合SSR技术对葡萄雄性不育基因进行定位研究和生物信息学分析。该研究筛选到2个与葡萄雄性不育基因连锁的SSR标记VVMD34和VVIB23,且位于该基因两侧,遗传距离分别为3.5cM和1.9cM。2个标记间物理距离为1 134kb,在该区域总共预测到了111个候选基因。该研究对葡萄雄性不育基因的精细定位及分子标记辅助育种奠定了良好的基础。     

五种基因克隆技术

经华中农业大学周国岭先生对国内外 6 4篇有关基因克隆技术的论文概括和分析 ,当前基因克隆技术主要有 5个类别 ,即体位克隆或状态克隆、转位或转ＤＮＡ标记法、同系位候选基因法、快捷顺序标记法、差接式快捷基因克隆法等。1　体位克隆或状态克隆首先将目的基因精确定位于分子标记连锁图上 ,用连锁标记筛选大片段ＹＡＣ ,ＢＡＣ ,ＴＡＣ ,ＰＡＣ或Ｃｏｓ ｍｉｄ等文库 ,构建含目的基因区的精细物理图谱 ,采用染色体操作法逐步接近目的基因 ,如拟南芥的ＷＩＧ ＧＵＭ基因克隆 ,人的ＮＰＣ1基因克隆。若侧翼标记与目的基因连锁非常紧密 ,就可…     

国内辣椒雄性不育育种及分子生物学研究进展

辣椒是常异花授粉植物,杂种制种成本较高。利用雄性不育育种可以降低杂种成本,近年来成为育种单位及科研院所研究的热点。介绍了国内开展辣椒雄性不育育种的情况,阐述了有关辣椒雄性不育研究的进展,涉及已被利用的遗传类型、不育系的来源和恢复系的研究,对近年来开发的不育和保持基因标记、恢复基因标记、基因的克隆进展进行了描述,为国内辣椒育种研究者提供参考。     

随机扩增多态DNA技术在遗传育种中的应用

RAPD是一项可以在没有任何分子生物学研究的情况下找出DNA的多态性的技术。本综述了RAPD技术在遗传多样性研究、分类及亲缘关系分析、品种(杂种)鉴定、杂种优势预测、构建遗传图谱、基因定位及基于图谱的克隆,分子标记辅助育种等方面的应用;还总结了RAPD技术的原理、优点、缺点及对策。     

分子标记在油菜杂种优势利用中的研究进展

杂种优势是一种普遍存在的生物学现象, 是提高作物产量的重要途径, 因而受到越来越广泛的重视。分子标记是近年兴起的一种新型的生物技术, 国内外已利用RFLP、RAPD、AFLP、SSR、ISSR和SRAP等多种分子标记技术对油菜的杂种 优势进行了广泛的研究, 取得了很多有价值的研究成果。本文综述了分子标记在油菜授粉控制系统中关键基因标记、亲本遗传多样性分析、杂种优势群划分、杂种纯度鉴定和杂种优势预测中的研究进展。通过对不同作物间的比较, 探讨了分子标记在油菜杂种优势利用中的研究深度, 并对分子标记在油菜杂种优势预测中应注意的问题进行了讨论。     

栽培稻F1花粉不育基因座S-b的PCR标记定位

栽培稻(Oryza sativa L.)杂种F1花粉不育性至少由6个基因座位所控制.为了定位其中的一个基因座位S-b,选用了158个微卫星标记对粳型品种"台中65"及其近等基因系TISL2之间的多态性进行了分析.结果发现第5染色体短臂上的RM13在亲本间存在多态性.连锁分析表明,RM13与S-b座位紧密连锁.根据微卫星标记分析的结果,在RGP(Rice Genome Research Program of Japan)发表的遗传图谱的相应位置上选取了11个RFLP标记,利用这些标记的末端序列设计特异PCR引物,进行ALP (amplicon length polymorphism)分析,结果11对引物均没有ALP.用6种四碱基识别位点的限制性内切酶进行PBR(PCR-based RFLP)分析,发现由R2213S和R830两克隆设计的STS (sequence-tagged site)标记在T65与TISL2之间存在酶切多态性.R830STS、RM13和R2213SSTS与S-b座位的遗传距离分别为3.3 cM (centiMorgan)、5.2 cM和5.5 cM.这些以PCR为基础的分子标记可以直接应用于分子标记辅助选择中,从而建立了基因定位与分子标记辅助选择一体化的技术体系,使S-b座位在育种中可以得到有效的利用.     

家蚕油蚕oc突变体突变基因的精细定位

【目的】油蚕oc突变体是家蚕Bombyx mori油蚕突变体的一种,经典遗传学连锁图谱已经将oc突变基因定位在5号染色体40.8 c M座位。本研究旨在对oc突变体候选基因进行精细定位并克隆,探究oc性状形成的分子机制。【方法】以油蚕oc突变品系和野生型家蚕品系大造(Dz)为亲本,其杂交产生的F1代雄性个体与oc突变的雌性个体进行回交得到的1 397头BC_1代个体为定位材料,以家蚕已经报道的基因组序列为参考设计markers,通过亲本及F1代个体筛选多态性markers,并利用多态性markers和BC_1代个体对oc突变基因进行精细定位。通过半定量RT-PCR和实时荧光定量PCR(q PCR)筛选oc紧密连锁区间内的候选基因,确定目标候选基因,继而克隆和测序该基因,分析油蚕oc突变的原因。【结果】利用1 397头BC_1代个体和11对有效的多态性markers将oc突变基因定位在M10与M11两个markers之间,物理图谱距离大约为234 kb。通过家蚕基因组数据库对oc连锁区域内的基因进行检索发现该区域有5个预测基因。对这5个预测基因在10个家蚕品系中进行的表达分析发现,只有BGIBMGA003572基因在oc突变个体体壁的表达量明显比正常个体中的低。通过基因的同源分析发现该基因编码的蛋白和人类单羧酸转运蛋白9(可能的尿酸转运蛋白)是同源蛋白,推测其为oc突变的候选基因。对BGIBMGA003572进行的克隆和测序结果显示其编码序列有5个氨基酸在oc突变体中发生了突变。【结论】通过定位克隆,本研究将oc突变基因定位在了234 kb的紧密连锁区间,其中编码单羧酸转运蛋白9的BGIBMGA003572可能和oc突变体的表型有关。