siRNA干扰PDGFRβ促进胃癌MGC-803/VCR细胞的凋亡

为研究血小板衍生生长因子受体β(PDGFRβ)在胃癌组织和长春新碱(vincristine, VCR)耐药胃癌细胞MGC-803/VCR中的表达,并探讨PDGFRβ沉默对MGC-803/VCR细胞增殖和凋亡的影响,本研究分别通过免疫组化和蛋白质印迹法(Western blotting)检测PDGFRβ蛋白在胃癌组织和耐药细胞株中的表达水平。通过Lipofectamine 2000将PDGFRβ小干扰RNA (si-PDGFRβ)转染到MGC-803/VCR细胞,Western blotting检测转染后PDGFRβ蛋白表达水平,Cell Counting Kit-8 (CCK-8)和流式细胞术分别检测si-PDGFRβ对VCR诱导人胃癌MGC-803细胞增殖和凋亡的影响。研究结果显示:PDGFRβ蛋白在胃癌组织中的表达显著高于正常胃组织;PDGFRβ蛋白在MGC-803/VCR细胞中的表达极显著高于MGC-803细胞,并且转染si-PDGFRβ后MGC-803/VCR细胞的PDGFRβ蛋白表达水平显著降低;1μmol/L、2μmol/L、4μmol/L、8μmol/L的VCR诱导MGC-803/VCR细胞后,si-PDGFRβ组细胞增殖抑制率分别为(21.97±0.84)%、(37.63±1.32)%、(55.77±1.39)%和(72.17±1.16)%,与对照组的(13.60±0.49)%、(22.33±1.01)%、(38.30±1.56)%和(52.90±1.08)%分别比较有极显著的差异(p<0.01);流式检测结果显示,与对照组的细胞凋亡率(13.61±0.49)%比较,发现si-PDGFRβ组胃癌MGC-803/VCR细胞凋亡率为(29.80±0.64)%,说明两者差异极显著(p<0.01)。本研究初步结论表明,si RNA干扰PDGFRβ能够促进VCR诱导的胃癌MGC-803/VCR细胞凋亡。     

siRNA干扰PDGF对新生儿血管瘤干细胞的增殖和分化的影响

婴儿血管瘤是一种血管瘤,表现出独特的快速生长的特征,然后随着时间而消退。血管瘤来自CD133+干细胞,当植入免疫缺陷小鼠时,它们分化成内皮细胞。同样克隆扩增的干细胞也产生脂肪细胞,从而重现血管瘤的消退期。本研究主要阐明了使用血管瘤来源的干细胞(hemSC)增殖和分化的内在机制。本研究发现血小板衍生生长因子(PDGF)在增殖期升高并可能抑制脂肪细胞分化。hemSC表达高水平的PDGF-b并且在基础(未刺激)条件下显示PDGF受体的持续酪氨酸磷酸化。PDGF受体信号传导的抑制导致hemSCs中的脂肪生成增强。此外,hemSCs暴露于外源性PDGF-b降低了脂肪含量和脂肪细胞特异性转录因子的表达。总之,本研究将PDGF信号传导鉴定为血管瘤退化的内在负调节因子,并强调了破坏PDGF信号传导治疗血管瘤的治疗潜力。     

血小板衍生生长因子受体β对骨肉瘤细胞株HOS增殖的影响

血管形成是肿瘤生长过程中不可或缺的因素。血小板衍生生长因子受体(platelet-derived growth factor receptor, PDGFR)通过与其配体结合刺激新生血管形成,与多种肿瘤的发生发展密切相关。研究表明其亚型PDGFRβ高表达于大多数骨肉瘤病人标本及细胞株中,促进肿瘤增殖,但具体机制仍未明确。在本研究中,分别对HOS骨肉瘤细胞株进行特异性配体PDGFBB刺激处理及小干扰RNA (siRNA)敲降PDGFRβ处理,然后检测其增殖、细胞周期及相关蛋白的表达。结果表明:经过PDGFBB刺激后细胞增殖能力增强;细胞周期结果显示处于G1期的HOS细胞数量增多,S期和G2/M期细胞数量减少,G2期相关蛋白Cyclin B1和CDK1以及G1期相关蛋白CyclinE2和CDK2表达增高,提示PDGFBB可能促进了G2/M期转化。而经siRNA干扰后,PDGFRβ在mRNA和蛋白水平均显示表达量下降;细胞增殖受到抑制。检测细胞周期结果发现在敲降PDGFRβ后,进入S期的细胞数量增加了约9.71%,而G2/M期的细胞数量约减少了6.78%,S期相关蛋白Cyclin A1和CDK2明显降低,提示发生了S期阻滞。因此我们推测,PDGFRβ通过调控细胞周期进程影响骨肉瘤细胞的增殖。本研究为PDGFRβ影响HOS细胞增殖及其潜在机制提供了理论依据,为PDGFRβ可以作为治疗骨肉瘤的潜在治疗靶点提供了理论依据。     

腺病毒介导siRNA抑制全反式维甲酸诱导的骨髓间充质干细胞RARβ表达

构建携带针对大鼠维甲酸受体β(Retinoic acid receptorβ,RARβ)基因的siRNA重组腺病毒,并感染全反式维甲酸(All-trans retinoic acid,ATRA)处理的骨髓间充质干细胞(Mesenchymal stem cells,MSCs),检测其对RARβ的表达及MSCs成神经分化的影响。设计针对大鼠RARβ的4对siRNA的DNA序列,体外退火形成双链,定向克隆至含有U6/H1双启动子的腺病毒穿梭质粒pSES-HUS,随后与腺病毒骨架质粒pAd-Easy1在BJ5183细菌中同源重组,并在HEK293细胞中包装获得重组腺病毒Ad-siRARβ。腺病毒感染大鼠MSCs后经ATRA处理24 h,Real-time、Western blotting及免疫荧光检测RARβ的表达情况。改良神经诱导培养基(Modified neuronal induction medium,MNM)诱导MSCs神经分化,Real-time PCR及免疫荧光检测神经相关蛋白表达。PCR、酶切及测序鉴定均证实siRNA正确克隆至腺病毒质粒中,腺病毒感染大鼠MSCs后可观察到60%以上的细胞有红色荧光蛋白(Red fluorescent protein,RFP)表达。经ATRA处理24 h,Real-time、Westernblotting及免疫荧光检测发现RARβ表达定位于细胞核,ATRA作用后MSCs中RARβ表达增高16.5±2.34倍(P<0.05),有3组siRNA能有效抑制ATRA诱导的RARβ表达增强,抑制率分别为(66.26±9.12)%、(48.70±5.78)%、(64.09±0.53)%(P<0.05),且以pool组效果最强,抑制率为(78.09±4.24)%(P<0.01)。ATRA联合MNM诱导MSCs成神经样细胞,表达相关神经特异蛋白Nestin、NSE、MAP-2、Tau,免疫荧光结果显示神经标志蛋白Nestin、NSE、Tju1表达阳性细胞率为(50-88)%,而腺病毒介导的siRARβ能有效抑制MSCs的神经标志物表达水平及阳性细胞率(P<0.05)。成功构建了携带针对大鼠RARβ基因的siRNA重组腺病毒,能有效感染MSCs并显著抑制ATRA诱导的RARβ表达增强和MSCs的神经分化。     

HCMV感染抑制人海马神经干细胞分化

研究HCMV感染对体外培养的人海马源性神经干细胞(Neural stem cells,NSCs)分化的影响。体外分离、培养人海马NSCs,应用免疫荧光方法检测其NSCs标记物-巢蛋白(Nestin)的表达。10%胎牛血清诱导NSCs贴壁分化,同时用MOI为5的HCMV AD169株感染NSCs,7d后使用激光共聚焦显微镜免疫荧光方法检测Nestin、神经胶质纤维酸性蛋白(GFAP)和HCMV即刻早期蛋白(IE)的表达,计算阳性细胞比率。本实验所培养的细胞(4～6代)95±8%表达Nestin;分化诱导7d后,感染组86±12%细胞表达IE,未感染组和感染组Nestin阳性率分别为50±19%和93±10%(t=6.03,P<0.01),GFAP阳性细胞率分别为81±11%和55±17%(t=3.77,P<0.01)。以上结果表明分化过程中的NSCs是HCMV的容许细胞;HCMV感染可以抑制NSCs的分化。     

Sunitinib对哮喘气道重塑小鼠PDGFR-β磷酸化和MMP-9表达的影响

目的:探讨sunitinib对支气管哮喘气道重塑的干预作用及可能的作用机制.方法:BALB/c小鼠随机分为正常对照组、哮喘气道重塑组、sunitinib干预组.鸡卵清蛋白致敏和激发建立哮喘小鼠气道重塑模型;收集支气管肺泡灌洗液(BALF)做细胞计数;取右肺组织行苏木精-伊红(HE)染色和Masson三色染色;免疫沉淀(IP法)测定小鼠肺组织PDGFR-β受体磷酸化及westernblot(WB)法检测MMP-9蛋白质的表达.结果:HE和Masson三色染色提示哮喘组黏膜下层和平滑肌增厚、气道管腔狭窄、胶原纤维增生、大量炎症细胞浸润,sunitinib干预组上述改变较哮喘组为轻;哮喘组BALF中炎症细胞总数和嗜酸性粒细胞(EOS)计数在哮喘组表达较对照组为高(P＜0.05),而sunitinib组低于哮喘组(P＜0.05);PDGFR-β受体的磷酸化和MMP-9的表达在哮喘组表达较对照组为高(P＜0.01),而sunitinib干预组表达量低于哮喘组(P＜0.01).结论:sunitinib能够抑制哮喘小鼠PDGFR-β的磷酸化和MMP-9表达,减轻气道炎症反应、延缓气道重塑进程.     

PDGF 及其受体介导的信号转导与妇科肿瘤关系研究进展

血小板衍生生长因子(Platelet-Derived Growth Factor,PDGF)是一类与生长、发育、癌症发生等密切相关的细胞因子,由多种细胞分泌产生,具有广泛的生物学活性,涉及多种疾病.目前关于PDGF分子结构、表达调控、生物学活性等已有较为深入的研究,本文在介绍上述研究成果的同,对PDGF在妇科肿瘤中的病理生理作用进一步综合分析.PDGF参与卵泡的发生;PDGF与子宫肌瘤、宫颈、卵巢癌等疾病相关联.PDGF在妇科肿瘤的发生、发展中起着重要的作用.     

Gli1蛋白和PDGFRα在大肠癌组织中的表达及临床意义

Gli1蛋白和血小板衍生生长因子受体α(PDGFRα)的表达在大肠癌的发生发展过程中的作用还不清楚.通过免疫组化法检测60例大肠癌及30例正常组织中Gli1和PDGFRα的表达,并与临床病理因素进行相关性分析,研究两者在大肠癌中的作用.研究发现,Gli1和PDGFRα蛋白在大肠癌组织中的阳性率分别为73.7%和78.3%,明显高于正常组织的表达(P<0.05).Gli1和PDGFRα蛋白表达与患者年龄、肿瘤大小、组织学类型等均无关(P>0.05),但是Gli1蛋白和PDGFRα表达与淋巴结转移状况和Duke分期相关(P<0.05).Spear-man相关分析显示,Gli1与PDGFRα蛋白表达正相关(r=0.298,P<0.05).结果表明Gli1和PDGFRα在大肠癌发生、发展中呈协同和相互调节作用,Gli1和PDGFRα的表达参与大肠癌的侵袭和转移过程.联合检测可作为判断大肠癌预后,筛选高危转移患者的有效指标,同时也可用于指导大肠癌的靶向药物治疗.     

人胚胎干细胞分化为神经干细胞诱导方法的对比研究

目的探讨人胚胎干细胞分化为神经干细胞过程中,经拟胚体（embryonic body,EB）法和直接分化法的不同效率。方法人胚胎干细胞常规培养消化后,分为两组：A组,经EB法分化;B组,添加noggin和ITSFn直接分化法。倒置相差显微镜观察细胞形态变化,RT-PCR检测细胞各阶段标志物,免疫荧光及流式细胞仪观察两组细胞Nestin阳性细胞率。神经干细胞继续分化,免疫荧光、RT-PCR法检测MAP2、GFAP表达。结果RT-PCR检测到OCT4、nestin表达。B组nestin阳性细胞率明显高于A组,差异有统计学意义（P〈0.01）,且诱导周期短于A组。神经干细胞继续分化,得到不同数量的神经元和胶质细胞,MAP2、GFAP分别阳性。结论在体外采用定向分化诱导,人胚胎干细胞不经EB,可直接定向分化为神经干细胞,且诱导效率比EB法高。因此直接分化法是一种经济实用的诱导方法。     

IL-1β和胎牛血清对大鼠神经干细胞分化的影响

在成年大鼠纹状体区分离神经干细胞,使用白介素－1β、神经生长因子、全反维甲酸和不同含量的胎牛血清作为诱导因子,通过免疫荧光化学方法和流式细胞仪检测细胞分化。结果表明胎牛血清有助于神经干细胞向星形胶质细胞和少突胶质细胞分化,IL－1β虽然对神经元数目没有明显影响,但对神经干细胞向多巴胺能神经元的分化却有明显促进作用。神经生长因子和全反维甲酸对神经干细胞向神经元、星形胶质细胞、少突胶质细胞和多巴胺能神经元的分化数量无明显影响。     

神经干细胞的分化影响其对肝细胞生长因子的趋化性迁移

神经干细胞（neural stem cells,NSCs）的定向迁移对神经系统发育和损伤后修复至关重要,但NSCs的定向迁移与NSCs的分化之间的关系鲜有研究。该研究以此为切入点,以肝细胞生长因子（hepatocyte growth factor,HGF）为趋化因子,神经干细胞系C17．2为研究对象,首先,建立了不同分化阶段的NSCs（分别分化0,12,24,72h）的分化模型;其次,运用Boyden chamber和Dunn chamber研究了不同分化状态下的NSCs对HGF的趋化性迁移。Boyden chamber结果显示：下室加入HGF后,分化12,24h的NSCs迁移至膜下方的细胞数目显著高于分化0,72h的NSCs;Dunn chamber结果显示：分化12,24h的NSCs迁移效率显著高于分化0,72h的NSCs。这些结果表明,NSCs的分化影响其对HGF的趋化性迁移,为在临床上更有效地利用NSCs治疗各种神经系统退行性疾病提供了理论依据。     

TGF-β1基因转染大鼠脂肪干细胞向软骨细胞分化的实验研究

目的TGF-β1基因转染大鼠的ADSCs(adipose stromal cells,ADSCs),诱导其向软骨细胞分化,为软骨组织工程学种子细胞提供新方法。方法分离、培养大鼠的ADSCs,免疫荧光法进行鉴定;TGF-β1基因转染ADSCs,对转染后细胞进行筛选;MTT法测定筛选后细胞的增殖活性;RT-PCR、Western blot对筛选后细胞的表达进行检测。结果成功分离、培养大鼠的ADSCs;细胞表面标志物CD29和CD44表达阳性,CD106和CD34表达阴性;基因转染后细胞的增殖力变强;转染TGF-β1的ADSCs在目的基因TGF-β1、SOX9、Aggrecan、Collagen II mRNA的表达和软骨特异性基质-Collagen II的分泌增强,明显高于对照组和转染空载体组;结果TGF-β1基因转染后ADSCs具有了软骨细胞的表型特征,可以用作软骨组织工程的种子细胞。     

低氧对 MSCs 增殖和分化的影响

摘要： 间充质干细胞(mesenchymal stem cells, MSCs)是具有自我更新、 多向分化和强可塑性的细胞, 具有分化为血液、 骨、 软骨、 脂 肪、 肌肉、 表皮、 上皮、 神经等组织的潜能, 受到再生医学研究的关注。目前已有研究表明将 MSCs 移植到多种损伤组织中都能改 善损伤组织的功能。文章在简要回顾了低氧环境对 MSCs 增殖和分化的研究内容和有关理论争论基础上重点介绍了缺氧诱导因 子 （ HIF ）通路对 MSCs 增殖和分化的影响。文章阐述了低氧环境对 MSCs 向成骨,成软骨,成脂及成神经元方向分化的影响。 由于 人体组织内生理条件下的氧张力远远小于大气中的氧张力 （21% ）, 采用低氧培养 MSCs 的研究方法得出的结论将更加贴近实际 MSCs 在人体内的增殖、分化情况。因此研究 MSCs 在低氧张力环境中增殖、分化的能力将为 MSCs 能成功移植到体内并发挥作 用提供保障。     

低氧对MSCs增殖和分化的影响

间充质干细胞（mesenchymal stemcells, MSCs）是具有自我更新、多向分化和强可塑性的细胞,具有分化为血液、骨、软骨、脂肪、肌肉、表皮、上皮、神经等组织的潜能,受到再生医学研究的关注。目前已有研究表明将MSCs 移植到多种损伤组织中都能改善损伤组织的功能。文章在简要回顾了低氧环境对MSCs增殖和分化的研究内容和有关理论争论基础上重点介绍了缺氧诱导因子（HIF）通路对MSCs 增殖和分化的影响。文章阐述了低氧环境对MSCs向成骨,成软骨,成脂及成神经元方向分化的影响。由于人体组织内生理条件下的氧张力远远小于大气中的氧张力（21%）,采用低氧培养MSCs 的研究方法得出的结论将更加贴近实际MSCs在人体内的增殖、分化情况。因此研究MSCs 在低氧张力环境中增殖、分化的能力将为MSCs 能成功移植到体内并发挥作用提供保障。     

脂肪干细胞与间充质干细胞体外诱导分化为心肌细胞的差别

本文旨在探讨脂肪干细胞(adipose-derived stem cells, ASCs)和骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells, MSCs)在组织含量、体外培养和诱导分化为心肌细胞方面的差别.ASCs从新西兰白兔皮下脂肪组织提取,MSCs从大鼠四肢长骨骨髓提取,体外培养扩增,免疫细胞学方法鉴定.采用细胞集落形成法检测组织中干细胞的含量.将不同代的干细胞用不同浓度的5-氮胞苷诱导,观察其形态变化,免疫细胞化学方法检测诱导后细胞是否转化为心肌细胞.结果显示,体外培养的ASCs呈短梭形,分布均匀,生长迅速,细胞形态单一、稳定.MSCs原代生长非常缓慢,呈簇生长,细胞纯度偏低,容易混杂其它细胞类型,传代细胞容易分化和老化.脂肪组织中ASCs含量显著高于骨髓中MSCs含量,且前者含量受年龄影响小.5-氮胞苷诱导ASCs分化为心肌细胞的有效浓度为6～9μmol/L,而MSCs在3～15μmol/L 5-氮胞苷诱导下可见心肌细胞形成.ASCs诱导分化的心肌细胞呈球形细胞团,MSCs分化的心肌细胞呈条形或棒状,其心肌细胞分化率低于ASCs.幼年动物MSCs的组织含量和心肌细胞分化率均高于老年动物,而ASCs受动物年龄影响较小.结果表明,ASCs在组织含量、细胞纯度、生长速度和心肌细胞分化率等方面均明显优于骨髓MSCs,在心肌细胞再生方面较MSCs具有更大的优势.     

RNA干扰抑制肾小管上皮细胞TSP1表达和TGF-β1活化

血小板反应蛋白1(TSP1)是转化生长因子-β1(TGF-β1)体内重要的活化因子,而后者又是致肾小管间质纤维化的关键因素。观察了针对TSP1的小双链干扰RNA(siRNA-TSP1),抑制由血管紧张素II(AngII)诱导的肾小管上皮细胞TGF-β1过度活化。将根据人TSP1基因序列设计的特异siRNA-TSP1转染人肾小管上皮细胞系(HK-2),利用Western印迹、RT-PCR、流式细胞仪及ELISA等方法,检测了TSP1、TGF-β1及其信号蛋白Smad2与p-Smad2、纤维连接蛋白(FN)和纤溶酶原激活剂抑制物-1(PAI-1)的基因转录水平、蛋白质表达或蛋白质活性。结果显示,siRNA-TSP1能有效转染HK-2细胞,并以剂量依赖方式显著抑制TSP1的基因转录与合成;其对TGF-β1的合成影响较小,但能明显抑制TGF-β1的活化。此外siRNA-TSP1可阻抑TGF-β1依赖的Smad2磷酸化,减少细胞外基质FN以及PAI-1的合成。研究结果提示,由于TSP1是TGF-β1重要的内源性活化因子,故针对TSP1的RNA干扰能在体外有效抑制TSP1表达并相应调抑了TGF-β1的活化。     

生长因子对骨髓间充质干细胞增殖、分化的影响

骨髓间充质干细胞(bone mesenchymal stemcell,BMSC)是骨髓基质细胞的重要组成部分,由于其不但能与其他细胞一起支持造血干细胞造血,而且还具有较强的增殖功能及多向分化潜能,在一定诱导因素下可定向分化成骨细胞、软骨细胞和脂肪细胞等,近年来已成为生物学和医学的研究热点。本文简要介绍了不同生长因子如血管内皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子、转化生长因子-β等对BMSC增殖、分化的影响。     

猕猴胚胎干细胞的诱导分化和凋亡

采用单层培养法研究维生素A酸(RA)、神经生长因子(NGF)、上皮生长因子(EGF)和碱性成纤维生长因子(bFGF)对猕猴胚胎干细胞系R366．4的诱导分化和凋亡的作用。结果表明：①不添加任何生长因子的条件下,细胞分化不定向,各种细胞所占的比例表现出明显的随机性;②添加单一生长因子能促进细胞的分化进程,并使某一类或某几类的分化细胞比例上升,RA和NGF均能促进神经样细胞的形成,EGF促进内皮样细胞的形成,bFGF提高成纤维样细胞的比例;③在分化的过程中伴有细胞早期和晚期凋亡的发生,RA和NGF可增加细胞凋亡的数量。这种由生长因子诱导的动物胚胎干细胞的分化可能存在种间差异。     

维甲酸和EGF对大鼠脑胚胎神经干细胞增殖和分化的影响

目的 观察全反式维甲酸(RA)和表皮生长因子(EGF)对大鼠胚胎神经干细胞增殖和分化的影响。方法 从大鼠胚胎脑中分离神经干细胞,经RA和EGF处理后,用台盼蓝确定细胞数量,BrdU标记分析细胞生长能力,采用免疫细胞化学法鉴定神经干细胞和分化的神经细胞。结果 20ng／ml EGF和1μmol／LRA处理的培养细胞均显示增殖效应,但EGF处理组增殖速度明显高于RA组,悬浮细胞中有大量nestin和BrdU阳性细胞。用EGF和EGE／RA诱导的神经元分化率分别为17％和31％,而RA处理的神经元分化率显升高至89％。由EGF、EGF／RA和RA诱导的星形胶质细胞分化率分别为83％、69％和11％。结论 EGF主要促进神经干细胞增殖并主要诱导星形胶质细胞的生成,RA主要诱导神经干细胞向神经元分化,二无明显协同效应。     

大鼠肺纤维化血小板源性生长因子、血小板源性生长因子—受体、转化生长因子—β、转化生长因子—β受体的表达

采用免疫组织化学方法观察实验性大鼠肺纤维化肺组织内转化生长因子（TGF－β）及其受体（TGF－βR）和血小板源性生长因子（PDGF）及其受体（PDGF－R）表达的变化。发现：（1）实验早期（1－3天）,TGF－β主要由单核巨噬细胞为主的炎症细胞所产生;7天以后直至实验结束（28天）,TGF－β阳性细胞主要为增生的间质细胞,TGF－βR的变化与之同步。（2）实验1－7天,病灶内单核巨噬细胞细胞PDGF染色呈强阳性反应,少量间质细胞呈阳性反应;14天以后,病灶内PDGF阳性的单核巨噬细胞减少,阳性间质细胞亦减少。PDGF－R的变化与PDGF相似。结果提示PDGF的主要来源是巨噬细胞,在肺纤维化的早、中期发挥重要作用,而TGF－β主要由间质细胞自身产生,在肺纤维化的中、后期发挥重要作用,促细胞外基质合成,使肺纤维化进行性进展。