含PR启动子的原核高效表达载体的构建及应用

组建了一个仅含PR启动子的原核高效表达载体pRC,它同时含有cⅠ调控基因、多酶切位点和两个强的转录终止序列.现已成功地用于表达重组人肿瘤坏死因子-α(hTNF-α)、重组人白细胞介素-3(hIL-3)和抗溶菌酶(HEL)抗体Fd基因,表达量均占菌体总蛋白的36%以上.同时还研究了不同的宿主菌和原核增强子序列等因素对PR启动子载体表达的影响.此外,还比较了分别以PR、PL或PRPL作为启动子时表达hTNF-α的情况,结果表明,单用PR或PL启动子可获得与使用PRPL串联启动子一样的高效表达.     

黑曲霉N-2植酸酶phy4基因的克隆及其重组酵母表达载体的构建

根据已发表的植酸酶phyA基因序列设计并合成1对引物,应用PCR技术,以黑曲霉N-2总DNA为模板,扩增出不包含假定信号肽序列的phyA基因,将其克隆到pMD18-T载体中,测定其核苷酸序列,并推导其氨基酸序列。该基因全长为1350bp,与已发表的黑曲霉NRRL3135的phyA基因的同源性为92．4％(不计内含子),编码1个含449个氨基酸残基的蛋白质,推导的氨基酸序列同源性为95．1％。将该基因与分泌型载体pPIC9K连接,构建了植酸酶基因的重组酵母表达载体pPIC9K／phyA。     

一种酿酒酵母附加型分泌表达载体pYES2/CT/α-factor的构建及鉴定

以pPIC9为模板,通过PCR扩增获得酿酒酵母的α-交配因子（α-factor）,并克隆至酿酒酵母胞内表达载体pYES2/CT中,构建了一种新型酿酒酵母附加型分泌表达载体pYES2/CT/α-factor（pYCα）。再将甘露聚糖酶基因（mannase,man）通过酶切、连接克隆至pYCα的α-factor的下游,构建了pYCα-man重组载体检验pYCα的分泌性能和稳定性。结果显示α-factor可引导甘露聚糖酶基因在胞外分泌表达,在曲利本兰培养基上形成明显的水解圈,进一步分析重组菌胞外和胞内酶活,结果显示对照INVSc1/pYCα的两种酶活都未检测到,而INVSc1/pYCα-man具有明显的胞外酶活,未检测到胞内酶活,说明构建的pYCα具有良好的分泌性能;稳定性实验表明重组质粒连续培养150 h仍具有良好的稳定性。     

利用T载体克隆快速构建布鲁氏菌缺失突变株

目的：建立一种基于T载体快速克隆构建布鲁氏菌突变株的方法,提高布鲁氏菌突变株构建的效率;方法：采用融合PCR的方法,将待缺失基因上下游的同源臂与卡那霉素抗性基因融合起来,构建突变盒,然后将突变盒直接与T载体连接,构建突变载体,将载体转入布鲁氏菌感受态细胞并筛选抗性克隆,进而获得布鲁氏菌的缺失突变株。结果：结合融合PCR和T载体快速克隆,能够在48h之内构建好突变载体,与传统的酶切连接相比,效率高、周期短。结论：基于T载体快速克隆是一种非常高效的构建突变株的方法,为布鲁氏菌突变株的构建提供了一种新方法。     

嘌呤核苷磷酸化酶基因的克隆及原核表达载体的构建

通过PCR方法从产气肠杆菌、胡萝卜软腐欧文氏菌、大肠杆菌扩增嘌呤核苷磷酸化酶(PNPase)基因,然后将扩增的约720bp的基因片段克隆到pET-28b表达载体上,构建重组PNPase的表达载体。核苷酸及推导的氨基酸序列分析表明,该基因在三个菌株之间有很高的同源性。SDS-PAGE电泳结果显示出明显的特异性蛋白质条带,其分子量约为29.8kDa.该载体的构建为进一步研究核苷及其类似物的生物合成奠定基础。     

sgna基因小麦高效表达载体的构建

利用在禾谷类作物中表达效率较高的启动子Ubi对含目的基因sgna的现有载体进行了改造,并引入筛选标记基因bar;为提高目的基因的表达水平,在目的基因5′端引入了Ω和kozak序列,3′端引入了poly(A)序列,成功构建了适用于小麦的抗虫基因植物表达载体pGU4AGBar和pGBIU4AGBar,基因pGU4AGBar含有顺向连接的Ubi-sgna及Ubi-bar基因表达盒,pGBIU4AGBar含有T-DNA边界序列,并在其左右边界中间插入了含有顺向连接的CaNV35S-nptⅡ,Ubi-sgna和Ubi-bar基因表达盒,人工合成的雪花莲外源凝集素基因sgna可以编码对同翅目昆虫具有毒杀作用的蛋白。     

含PR启动子的原核高效表达载体的构建及应用

组建了一个仅含P_R启动子的原核高效表达载体pRC,它同时含有cⅠ调控基因、多酶切位点和两个强的转录终止序列.现已成功地用于表达重组人肿瘤坏死因子-α（hTNF-α）、重组人白细胞介素-3（hIL-3）和抗溶菌酶（HEL）抗体Fd基因,表达量均占菌体总蛋白的36％以上.同时还研究了不同的宿主菌和原核增强子序列等因素对P_R启动子载体表达的影响.此外,还比较了分别以P_R、P_L或P_RP_L作为启动子时表达hTNF-α的情况,结果表明,单用P_R或P_L启动子可获得与使用P_RP_L串联启动子一样的高效表达.     

蝴蝶兰LFY基因克隆及高效植物表达载体的构建

根据NCBI中蝴蝶兰LFY花序分生组织基因序列设计2对引物,用RT-PCR法从蝴蝶兰花芽中扩增出LFY基因,对扩增产物进行克隆和测序.结果表明,获得的蝴蝶兰LFY基因约为1500 bp,与报道序列同源性达98.71％.将LFY基因插入pRI101-ON载体中,经PCR、双酶切及测序鉴定,证实重组表达质粒中含有目的片段,表明成功构建了高效植物表达载体pRI1O1-LFY.     

siRNA表达载体的构建及其表达

本研究用限制性内切酶消化质粒pCMV-tag-2B,除去巨细胞病毒(Cytomegalovirus,CMV)启动子核苷酸序列,剩下的核苷酸序列作为构建表达siRNA(Small interfering RNA,siRNA)载体的前体。依据文献提供的扩增H1RNA启动子核苷酸序列的引物序列合成一对引物,以带有H1RNA启动子序列的质粒DNA为模板扩增HIRNA启动子序列,插入前体,构建SiRNA的表达载体pCH1。另外将H1RNA启动子插入pGEM．1lfz相应位点,构建瞬时表达载体pGHl。依据EGFP的有效SiRNA抑制位点,合成两条分别为64bp的核苷酸链,通过体外退火,形成双链,然后插入已构建的两个表达载体。将这两个载体分别与表达EGFP蛋白的质粒pEGFP．N3共转染Bel．7402细胞,观察siRNA对EGFP的抑制效应。研究结果表明构建的载体有效表达了siRNA,这些载体可以用于与siRNA相关抗病毒治疗性试验研究。     

酵母表面展示T载体构建及目的蛋白的表面展示

构建一种能对PCR产物进行直接克隆并展示于酵母表面的新型T载体。根据酵母表面展示载体p YD1多克隆位点序列设计出利用两端带有XcmⅠ内切酶酶切位点的含有黄色荧光蛋白基因的XcmⅠ酶切盒,通过NheⅠ和XhoⅠ酶切位点插入到p YD1载体上形成质粒p YD-YFP,并对其进行酶切鉴定和DNA测序分析,再经XcmⅠ酶切后形成两端带有d T的表面展示T载体。利用PCR扩增两个含有荧光蛋白的融合蛋白PCAD-CFP和PSR-Ds Red的基因并直接克隆到所构建的T载体中,检测其表达功能。酶切鉴定和DNA测序结果显示PCAD-CFP和PSR-Ds Red正确插入载体上,分别转化至酿酒酵母EBY100中,激光共聚焦显微镜下观察到相应的荧光的酵母,表明克隆有融合蛋白基因片段的载体成功在酵母细胞中进行表面展示,证明了所构建的酵母表面展示T载体具有直接克隆和表面展示目的蛋白的功能。     

一种新型酿酒酵母附加型分泌表达载体的构建

用化学法合成克鲁维酵母的菊粉酶基因的信号肽序列(INU),将其嵌入酵母附加型表达质粒pYES2,得到一套新型的分泌表达载体pYES2I,pYES2Ⅱ,pYES2Ⅲ。然后用PCR方法分别扩增大肠杆菌的天冬酰胺酶基因(ASN)和短芽孢杆菌α乙酰乳酸脱羧酶(ALDC)基因,连接到INU下游,得到重组质粒pASN和pALDC。分别将这两个重组质粒转化酿酒酵母菌株INVScⅠ中表达,胞内和胞外的酶活分析表明ASN和ALDC基因都能在酿酒酵母中分泌表达,表明菊粉酶信号肽序列能很好地将酿酒酵母中的重组蛋白分泌到胞外。稳定性分析表明,重组酵母菌株在没有选择压力的条件下连续接种培养100h,未发现重组质粒的不稳定性。     

拟南芥AtNHX5基因的cDNA克隆及其正义、反义表达载体的构建

采用RT-PCR方法从拟南芥品种Landsberg的实生苗叶片中克隆AtNHX5基因的cDNA,核酸序列表明该基因编码区为1 554 bp,编码538个氨基酸.与GenBank发表的序列(AF490589)相比,有三处碱基不同,分别为850 bp处的G(GenBank的为A)、904 bp处的T(A)、985处的G(A).将该基因分别正向或反向置于CaMV35S启动子之后,可构建正义、反义表达载体.     

RS基因的植物表达载体和酵母表达载体构建

白藜芦醇合酶(RS)是Res生物合成的关键酶之一,它催化1分子4-香豆酰辅酶A和3分子丙二酰辅酶A反应合成Res.以花生中克隆的RS基因为基础,成功构建了RS基因的以Ubi为启动子的单子叶植物表达栽体pBIL-RS,为以后的基因工程遗传转化果蔗和其他单子叶植物改良其品质提供条件.同时构建了酵母表达载体pVT102U-RS,为下一步研究真核表达蛋白的生物活性提供条件,并为利用酵母生产Res提供了可能.     

pGEX-L系列表达载体的构建

对ｐＧＥＸ系列表达载体的多克隆位点（ＭＣＳ）进行了改造,改造前ＭＣＳ上仅有ＢａｍＨＩ、ＳｍａＩ和ＥｃｏＲＩ三个酶切位点。改造后的ＭＣＳ上含有８个酶切位点,它们分别是ＢａｍＨＩ、ＳａｃＩ、ＡｖａＩ、ＸｈｏＩ、ＢｇｌⅡ、ｐｓｔⅠ、ＫｐｎＩ和ＥｃｏＲＩ,改造后构建形成的ｐＧＥＸ－Ｌ系列载体对目的基因的插入有更强的适应性。     

酿酒酵母海藻糖—６—磷酸合成酶基因克隆及植物表达载体的构建

从耐热性极强的酿酒酵母菌株ＡＳ２．１４１６中分离纯化出总ＲＮＡ和mRNA,以ＡＭＶ逆录酶合成cDNA,采用保守引物,从该cDNA中扩增克隆出tps1基因,对该基因的全序列分析表明,该基因含有１５０７个核苷酸,与国外报道相关基因的同源性达９９．６５。利用ＢamＨⅠSacⅠ切点将tps1基因插入植物表达载体pBin438多克隆位点上,得到tps1基因植物表达载体重组质粒。     

梅PGIP基因超表达载体的构建及遗传转化

运用已克隆的梅PGIP基因构建植物超表达载体,将PGIP插入带有启动子super-promoter和终止子nos的中间载体P-Super1300 中,酶切鉴定表明,目的基因已正确地插入载体中.用根癌农杆菌介导法将其转入烟草中,共获得25株潮霉素抗性苗,对其中的13株进行PCR检测,有12株扩增出了目的条带;进一步对其中的7株进行Southern杂交检测和RT-PCR检测,发现7个株系均有杂交带出现,且均发生了基因转录,说明已成功获得了能够表达PGIP基因的转基因烟草.     

木酮糖激酶基因整合表达载体构建及在酿酒酵母中的过表达

【目的】以载体p406ADH1为构建骨架,构建一个酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)工业菌株的整合表达载体。【方法】通过酶切连接的方式,将4个元件片段:作为筛选标记的G418抗性基因KanR,用于基因表达的ADH1终止子片段,酿酒酵母W5自身木酮糖激酶基因,18S rDNA介导的同源整合区,插入到骨架质粒p406ADH1中,得到多拷贝整合表达载体pCXS-RKTr。将该载体线性转化酿酒酵母后,对转化子中木酮糖激酶酶活进行测定,检测其表达情况。【结果】重组质粒在酿酒酵母体内实现了木酮糖激酶的高水平稳定表达,其酶活力是初始菌株的2.87倍。【结论】本实验构建了一个酿酒酵母工业菌株整合表达载体,并用此载体过表达了其自身的木酮糖激酶基因。该重组质粒载体的构建可以有效解决酿酒酵母中自身木酮糖激酶酶活较低的情况,这为利用木糖高产乙醇酿酒酵母基因工程菌株的构建和其它酵母重组质粒载体的构建奠定基础。     

产朊假丝酵母整合表达载体的构建

[目的]构建一个产朊假丝酵母(Candida utilis,C.utilis)整合表达载体.[方法]该载体以质粒pBR322为骨架,包括3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAP)启动子和终止子、放线菌酮(CYH)抗性基因和18S rDNA介导的同源整合区.再以木聚糖酶基因为目标基因,插入pGLR9K载体上,构建重组表达载体,电击转化C.utilis.对阳性转化子进行酶活测定,检测其表达情况.[结果]转化子的胞内外都可检测到木聚糖酶酶活,酶活可达60 U/mL.[结论]本实验构建了一个C.utilis载体,并用此载体表达了木聚糖酶基因,本研究将为产朊假丝酵母工程菌在饲料添加剂及食品行业中的应用提供又一个新的实验平台.     

一种带增强子的原核高效表达载体的构建及初步应用

构建的pTO-T7大肠杆菌高效融合表达载体,调控序列中有一个Ω序列和一个T7启动子串联;多克隆位点(MCS)包括8个常用酶切位点;可进行融合表达或者非融合表达,根据不同的需要加以选择;融合蛋白N端为T7g10的12个起始氨基酸,C端为His标签;含kan抗性基因作为选择标记。将增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因克隆至pTO-T7载体,在E.coli中的表达结果表明,融合EGFP达到菌体总蛋白量的50%以上,90%以上的融合蛋白以可溶性形式存在,融合后的EGFP仍保持原有的荧光性质。与同时构建的不含Ω序列的pT-T7载体的表达产量的比较研究结果表明,Ω序列在pTO-T7载体中能显著提高表达效率。