禾本科植物联合固氮研究及其应用现状展望

综述了近年来从禾本科植物体内和根际发现的内生固氮菌和根际固氮菌的种类、特征及对宿主的促生机理,以及固氮菌接种剂在农业生产中的应用现状和存在的问题,指出影响联合固氮菌接种效果的主要因素有土著微生物的竞争;植物基因型差异和环境条件的变化,如结合态氮(氨、亚硝酸盐、硝酸盐等)对固氮酶的合成阻遏和较高的氧分压对联合固氮菌的固氮效率影响．提出了发掘和利用禾本科植物的生物固氮潜力的努力方向：从自然界分离筛选获得广谱高效固氮菌株;应用基因工程构建耐铵、泌铵型联合固氮菌;诱导禾本科植物形成固氮根瘤;充分发挥植物内生固氮菌的优势．     

固氮螺菌CWV-22突变株与玉米、小麦联合体的固氮作用

应用乙炔还原法和同位素15N示踪技术证明固氮螺菌CWV-22是具有耐高铵、泌铵能力的突变株。它在含有50mM NH+4浓度的纯培养固氮试验中,吸收”N量为135μg／mg蛋白,不接种的对照吸收“N量为零,接种Sp7的只有1／~g]mg蛋白,在测试允许误差之内,证明Sp7的固氮作用是不耐铵的。在密闭培育装置中,用15N示踪植物试验：1．种植玉米或小麦,接种不耐铵的。P7或耐铵的CWV一22菌株,不论在有或无NH,Ac的条件下,植物吸收的生物固定”N量均远远高于不接种细菌的对照植物,达4．5—9．0倍;2．接种耐铵CWV一22菌株不受NH(Ac存在的抑制,接种不耐铵sp7菌株则受到显著的抑制,但仍有一定的固氮作用,并将固定的”N输送到植物根、茎、叶里。经检测,在有NH．Ac条件下,根际砂中含nil+量降低到l--2mM(远离根际的砂中含N时为29．1raM),低于对。P7菌株的抑制浓度,可能是。P7仍有固氮活性。     

水稻对耐氨固氮工程菌株的响应

耐氨固氮工程菌（下称工程菌）催娩克氏杆菌（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）ＮＧ１３９０和阴沟肠杆菌（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｃｌｏａｃａｅ）Ｅ２６１３的基因组带有组成型ｎｉｆＡ,其固氮酶的生成不受氨的阻遏,因此在有氨条件下具有固氮能力。接种固氮菌分别在两个水稻品系,即籼稻品种Ｃ５４４４和粳稻品种秀水－０４进行试验。水稻种植在灭菌土壤的塑料桶,生长至扬花后期取样分析表明,接种固氮菌能促进水稻的生长和植株含氮量的增加。接种工程菌ＮＧ１３９０的植株其生物量、总氮和固氮率（Ｎｄｆａ％）超过接种野生型ＮＧ１３的水稻。Ｅ２６１３接种Ｃ５４４４也获得类似的结果。应用１５Ｎ同位素稀释法证明了固氮菌接种水稻形成的联合固氮体系,存在细菌的固氮作用,而植株中氮素成分的增加可能来自细菌固定的氮。     

一株高效甘蔗内生固氮菌NN08200的鉴定及其对甘蔗的促生长作用

【背景】生产上过高的氮肥投入是我国农业可持续发展的重要限制因子之一。利用生物固氮是减少氮肥施用量最为有效的途径,植物内生固氮菌资源的挖掘和利用对我国农业可持续发展具有重要实践意义。【目的】筛选高效甘蔗内生固氮菌,并对其联合固氮效率及促生长功能进行评价。【方法】从广西甘蔗茎基部组织分离筛选到一株内生固氮菌株NN08200,利用乙炔还原法测定固氮酶活性,通过菌落PCR扩增nif H基因确定菌株为固氮菌;通过菌株培养性状和菌体形态观察、Biolog细菌鉴定系统和16SrRNA基因序列分析确定该菌株的分类;采用盆栽接种测定菌株对甘蔗的实际促生长作用,并利用15N同位素稀释法测定其相对固氮效率。【结果】菌株NN08200的固氮酶活性达到2445nmolC2H4/(h·m L),菌株的nif H基因长度为339bp,与甘蔗内生固氮醋酸杆菌Gluconacetobacter diazotrophicus PAL5菌株的nif H相似性达99%;根据菌株培养性状和菌体形态观察、Biolog细菌鉴定系统和16SrRNA基因序列分析结果,菌株NN08200属于泛菌属(Pantoeasp.)细菌;盆栽接种菌株NN08200能显著提高甘蔗幼苗的株高和干重,15N同位素分析结果表明接种该菌株甘蔗植株的根、茎和叶从空气中获得氮素的百分率分别为7.49%、15.02%和10.79%,其联合固氮效率显著优于甘蔗内生固氮模式菌株G. diazotrophicus PAL5,利用后者接种的甘蔗根、茎和叶从空气中获得氮的百分率分别为3.53%、9.44%和4.87%。【结论】菌株Pantoea sp. NN08200是高效甘蔗内生固氮菌,其固氮促生长效果明显高于G. diazotrophicus PAL5菌株,可望研发成为优良固氮微生物肥料生产菌种,并可进一步用于甘蔗联合固氮菌作用机理的相关研究。     

内蒙古典型草原的生物量与生产力

氮素是植物生长和作物高产的限制因素。氮素来源主要是生物固氮和化学固氮。生物固氮是地球表面氮素的主要来源。在生物固氮中,目前最有效的还是豆科根瘤菌固氮。但近年来,禾本科植物根系与固氮菌的联合固氮作用引起了人们的广泛重视。联合固氮是自生固氮和共生固氮体系的中间类型,固氮细菌与相应联合植物之间具有较密切的相互影响,但又不象形成根瘤那样具有共生结构。这种联合固氮作用在自然界中广泛存在,各种作物,热带和亚热带牧草的根际和根表均有联合固氮菌存在,它们能提供土壤氮素。经测定水稻根际每个生长季非藻类的生物固氮量达25—30     

玉米联合固氮菌Kosakonia radicincitans GXGL-4A的分离鉴定与固氮特性研究

【目的】固氮微生物是生物固氮的主体,其菌种的选育更是生物固氮研究的基础。本实验室分离鉴定出一株新的固氮菌,并对其固氮相关活性进行初步研究。【方法】固氮菌采用Ashby无氮培养基进行分离纯化。通过形态特征分析、生理生化特征分析、16S r RNA基因序列分析和基因组扫描对固氮菌进行鉴定。利用靛酚蓝-分光光度法检测固氮菌的泌铵能力。固氮酶活性的测定使用乙炔还原法。【结果】从玉米根部分离到一株固氮菌株GXGL-4A,菌体短杆状,大小约为1.5μm×0.5μm,单个或常见2个菌体细胞串联在一起,革兰氏染色结果为阴性。16S r RNA基因序列分析结果表明该菌株与Kosakonia oryzae Fo8A1d 16S r RNA基因序列有95%的相似性,结合形态特征、生理生化特征和基因组扫描,将其命名为K.radicincitans GXGL-4A。对其进行固氮基因nif H的检测,经PCR扩增得到预期的296 bp条带;采用靛酚蓝-分光光度法,测得发酵液中铵态氮含量为2.5 mg/L,表明该菌株具有较好的泌铵能力。乙炔还原法测其固氮酶活性,以乙烯生产量表示,结果显示GXGL-4A菌株在无氮培养基上能够有效地还原乙炔,达到232.94 nmol C2H4/(m L·h)。【结论】菌株GXGL-4A是一株可较好地分泌铵的新的固氮菌,具有很好的研究价值。     

一株高效甘蔗内生固氮细菌GXS16的鉴定及其对甘蔗的促生长作用

[背景] 我国甘蔗生产中氮肥过量施用严重,导致生产成本居高不下,充分发挥甘蔗与内生固氮菌的联合固氮作用,减少氮肥施用量,对促进我国甘蔗产业可持续发展具有重要意义。[目的] 筛选优势甘蔗内生固氮菌,对其基本特性、联合固氮效率及促生长功能进行评价。[方法] 从甘蔗根系分离到一株内生固氮菌GXS16,利用乙炔还原法测定固氮酶活性,通过PCR扩增nifH基因确定菌株为固氮菌;通过形态观察、Biolog检测和16S rRNA基因序列分析等对菌株进行分类;通过接种盆栽甘蔗检测菌株的促生长作用,采用¹⁵N同位素稀释法检测菌株相对固氮效率。[结果] 菌株GXS16固氮酶活性为2.42μmol-C₂H₄/（h·mL）,根据菌株培养性状和菌体形态观察、Biolog检测、16S rRNA、nifH、acdS基因序列分析结果,菌株GXS16属于伯克氏菌属（Burkholderia）;菌株GXS16还具有1-氨基环丙烷-1-羧酸脱氨酶（1-Aminocyclopropane-1-Carboxylate Deaminase,ACC）活性及合成生长素吲哚乙酸（Indoleacetic Acid,IAA）、降解无机磷的功能;接种GXS16处理甘蔗植株的株高比对照增长15%以上,干重增长20%以上,¹⁵N同位素测定显示甘蔗根、茎、叶从空气中获得氮的百分比分别为7.69%、15.64%和8.72%,效率显著优于模式菌株G.diazotrophicus PAL5。[结论] Burkholderia sp.GXS16是一株高效甘蔗内生固氮菌,具有良好应用前景。     

联合固氮细菌在生态系氮素循环中的意义

七十年代提出了联合固氮作用的概念,由于它给人们以农田生态系中应用生物固氮作用的新希望,因此掀起了研究这一问题的热潮。本文首先对联合固氮微生物的种类以及分类作简单介绍,然后着重以固氮螺菌属(Azospirillum)为代表来探讨联合固氮菌在生态系氮素循环中的作用。     

联合固氮菌叶面接种剂的优化及其在玉米叶际的定殖

【背景】联合固氮菌由于不具有宿主专一性,在土壤、叶际中广泛存在,对生态系统氮素供应有着重要贡献,它还可以通过分泌生长激素等间接作用促进植物生长,可作为重要的农业生产菌剂。土壤接种剂由于受土著微生物的竞争和土壤抑菌物质等的影响,接种效果不稳定,难以推广使用。相比于土壤环境,叶际生境相对简单且表面积巨大,进行叶际接种是固氮菌剂推广应用的一个新思路。【目的】优化联合固氮菌菌株W12接种添加剂,制备液体接种剂并研究其在玉米叶际的定殖效果。【方法】对菌株W12进行菌落PCR测序,构建系统发育树并确定分类地位。分别在培养液中添加不同浓度梯度的羧甲基纤维素(Carboxymethyl cellulose,CMC)和甘油(Glycerol,Gly),测量菌株W12生长曲线和固氮酶活性,优化添加剂浓度并制备液体接种剂,对接种剂的有效保存时间进行检测。将接种剂喷洒到玉米叶际,测量其对玉米产量和植株含氮量的影响,并通过低氮培养基进行回收计数。【结果】固氮菌菌株W12的16S r RNA基因序列与变栖克雷伯氏菌(Klebsiella variicola)的相似性高达99%,在培养液中添加CMC和甘油对菌株W12的生长无明显促进和抑制效果,但均提高了固氮酶活性。添加甘油制备的接种剂在盆栽和大田玉米叶面喷施后,在玉米生长末期叶际回收到的W12类似菌分别为4.3×105 CFU/g叶片和1.7×105 CFU/g叶片,显著高于未接种的处理;而且大田玉米籽粒、茎部和叶片的含氮量高于不接种的对照处理。经过90 d贮藏后,4°C保存的接种剂剩余活菌数均高于1.0×108 CFU/m L。【结论】羧甲基纤维素和甘油的添加不仅有利于固氮菌液体接种剂在叶片的附着,并能显著提高联合固氮菌菌株W12的固氮酶活性,低温冷藏可保证液体接种剂的有效活菌数;液体接种剂在玉米叶际喷施后,菌株W12能够成功定殖,并显著提高玉米植株和籽粒含氮量。研究结果为固氮菌叶面接种剂的制备和应用,以及实现农业氮肥减施保产的目标提供了借鉴意义。     

利用15N稀释法研究小麦接种肺炎克雷伯氏菌联合固氮作用

利用15N稀释法研究小麦接种肺炎克雷伯氏菌(Ktebsiella pneumoniae)43菌株的联合固氮作用。在小麦种子萌动后播种于土盆中,用43菌株接种,定苗后每盆施人15N丰度为30％的标记硫酸铵25rag,培育70d后测定根、茎的干物质重、含氮量和15N％原子趣,并用乙炔还原法测定根系存在的固氮酶活性。结果表明,小麦根系存在固氮有机体,直接为植株提供氮素占其总氮量的15.3—22．1％,干物质重和15N％含量与对照相比差异显著。     

甘蔗固氮内生菌——重氮营养醋杆菌的研究进展

在巴西,许多地区甘蔗的栽培已有几十甚至几百年的历史,尽管氮素供应明显不足,但甘蔗的产量和土壤中的氮素储备并没有随时间的推移而下降。认为甘蔗可能得益于生物联合固氮。通过氮平衡和１５Ｎ技术已证明生物的联合固氮作用对牧草和甘蔗等农作物的生长有重要的农学意义。认为甘蔗所吸收的氮素中有８０％可能来自生物固氮作用,只有少数来自施放到土壤中的化合态氮［１］。迄今已从甘蔗根际中分离到１１个属的固氮细菌,但是这些存在于甘蔗根际固氮菌的数量都不足以解释发生于甘蔗中的高效固氮作用．对甘蔗与固氮菌的联合共生固氮作用的深…     

利用15N稀释法研究小麦接种肺炎克雷伯氏菌联合固氮作用

利用15N稀释法研究小麦接种肺炎克雷伯氏菌(Ktebsiella pneumoniae)43菌株的联合固氮作用。在小麦种子萌动后播种于土盆中,用43菌株接种,定苗后每盆施人15N丰度为30％的标记硫酸铵25rag,培育70d后测定根、茎的干物质重、含氮量和15N％原子趣,并用乙炔还原法测定根系存在的固氮酶活性。结果表明,小麦根系存在固氮有机体,直接为植株提供氮素占其总氮量的15.3—22．1％,干物质重和15N％含量与对照相比差异显著。     

肺炎克氏杆菌nifA基因在巴西固氮螺菌固氮基因表达的铵调节中的作用

固氯螺菌(Azospirillum)是一类仅在限铵和微好氧条件下固氮的微生物,它可与许多禾本科作物联合共生⑴,具有较大的应用潜力。铵作为固氮作用的调节信号,在固氮螺菌的实际应用中是首要的限制因素。在固氯螺菌中,铵不但具有与肺炎克氏杆菌(Klebsiella pneumoniae)相似的阻遏固氮酶合成的作用,而且还对已合成的固氮酶进行活性调节⑵。研究表明,其固氮酶翻译后活性调节的机制类似于深红红螺菌(Rhodospirillum rubrum)⑶,即在有铵条件下其固氮酶铁蛋白的一个亚基被共价修饰而丧失活性,这一过程是可逆的。由于铵在固氮螺菌中双水平地调节固氮作用,使得在野生菌株中研究其固氮基因表达水平上的调节较为困难。Zhang等⑷利用区域定位诱变技术获得了巴西固氮螺菌Sp7（A．Brasilense Sp7)的draT-突变株,在该突变株中铵不再影响固氮酶的活性,这为其固氮基因表达调节的研究提供了一个良好的材料。本文将组成型表达的肺炎克氏杆菌nifA基围引入该突变株中,通过分析讨论铵对巴西固氮螺菌固氮基固表达的调节作用方式。     

广西甘蔗根际高效联合固氮菌的筛选及鉴定

对广西主要甘蔗产区的根际联合固氮细菌进行了收集和评价,拟筛选获得对甘蔗具有潜在促生性能的联合固氮菌,为甘蔗生产节肥减耗提供依据。结合nifH基因扩增和固氮酶活性分析方法筛选获得36个固氮细菌菌株;进一步对所获得固氮菌株的固氮能力、溶磷性、分泌植物生长素IAA的特性等促进植物生长潜能进行评价,获得了5个同时具有较强固氮能力、降解无机磷和分泌植物生长激素IAA的功能菌株;通过Biolog鉴定系统和16S rRNA序列分析对5个具有较好应用潜力的固氮菌进行分类鉴定。结果表明这5个菌株分别属于Klebsiella sp.、Bacillus megaterium、Pseudomonas sp.、Pantoea sp.和Burkholderia sp.。本研究结果表明广西甘蔗根际联合固氮菌具有较大的开发利用潜力。     

碳氮比对固氮菌株WN-F合成胞外多糖的影响北大核心CSCD

从沈阳农业大学棕壤长期定位试验站的栽培玉米土壤样品中分离筛选到高产多糖固氮菌株WN-F,从菌株鉴定、培养条件优化和固氮与产糖关系进行初步研究。对其进行形态学观察和分子生物学鉴定,酶标仪分析菌体生物量法确定菌株的生长培养条件,并分析其固氮与产糖之间的关系。结果表明,该菌株为阿氏芽孢杆菌,并命名为Bacillus aryabhattai WN-F。WN-F菌株在37℃,180 r/min情况下12 h时生长量达最高值。其培养基优化配方为(L^(-1)):蔗糖20.0 g,牛肉膏2.0 g,KH_2PO_4 0.4 g、MgSO_4·7H_2O 0.4 g、NaCl 0.4 g、CaSO_4·2H_2O 0.4 g和CaCO_3 2.0 g。菌株WN-F的产糖情况随着初始氮浓度的增加,呈现出抛物线关系,适宜碳氮比促进菌体合成胞外多糖。Bacillus aryabhattai WN-F是长期定位试验玉米土壤中的优势菌株,高产胞外多糖且有固氮作用,是发挥玉米联合固氮作用,减少化肥施用的候选菌株。     

碳氮比对固氮菌株WN-F合成胞外多糖的影响

从沈阳农业大学棕壤长期定位试验站的栽培玉米土壤样品中分离筛选到高产多糖固氮菌株WN-F,从菌株鉴定、培养条件优化和固氮与产糖关系进行初步研究。对其进行形态学观察和分子生物学鉴定,酶标仪分析菌体生物量法确定菌株的生长培养条件,并分析其固氮与产糖之间的关系。结果表明,该菌株为阿氏芽孢杆菌,并命名为Bacillus aryabhattai WN-F。WN-F菌株在37℃,180 r/min情况下12 h时生长量达最高值。其培养基优化配方为(L~(-1)):蔗糖20.0 g,牛肉膏2.0 g,KH_2PO_4 0.4 g、MgSO_4·7H_2O 0.4 g、NaCl 0.4 g、CaSO_4·2H_2O 0.4 g和CaCO_3 2.0 g。菌株WN-F的产糖情况随着初始氮浓度的增加,呈现出抛物线关系,适宜碳氮比促进菌体合成胞外多糖。Bacillus aryabhattai WN-F是长期定位试验玉米土壤中的优势菌株,高产胞外多糖且有固氮作用,是发挥玉米联合固氮作用,减少化肥施用的候选菌株。     

固氮螺菌耐高铵突变株的生物学特性

本文报道9株固氮螺菌耐铵突变株,在培养基中有30—120m mol/L NH₄⁺存在时,具有强弱不等的固氮酶活性。而出发菌株在有微量NH_4~+存在时,固氮酶活性完全被抑制。耐铵突变株的其它特性与出发菌株相似。     

耐氨固氮菌分泌物对水稻秧苗生长的影响*

研究了催娩克氏菌(Klebsiella oxytoca)的不同菌株(耐氨固氮型、野生型、不固氮型)对杯栽水稻秧苗生长的影响,发现耐氨固氮菌可分泌某种植物生长促进物质。此类物质可被阳离子树脂吸附,在80℃下活性不受影响。在适宜浓度下,可使水稻秧苗的根重和苗重增加30％。     

耐氨固氮菌接种水稻所需最低活菌数的测定

耐氨固氮菌在谷芽上能生长,每粒谷芽上的菌数可达１０４－１０５个。当７０％以上的秧苗带有耐氨固氮菌时,经根系交叉感染能使所有的秧苗根系带上耐氨固氮菌。菌液浸泡谷芽接种水稻,耐氨固氮菌数／谷芽数达２０时,可使７０％的谷芽接种上菌,有２１０以上时,可使１００％的谷芽接种上菌。菌液淋施秧苗接种水稻,耐氨固氮菌数／秧苗数为１６００以上时,１００％的秧苗带有耐氨菌。菌液浸泡秧根接种水稻,耐氨固氮菌数／秧苗数为７０个以上时,可使１００％的秧苗根部带有耐氨菌。     

多功能固氮菌筛选及其在土壤生态修复中的应用

以固氮酶和ACC(1-aminocyclopropane-1-carboxylate,1-氨基环丙烷-1-羧酸)脱氨酶活性为指标筛选功能菌株,研制菌剂,用于修复生荒地土壤生态。采用乙炔还原法测定菌株固氮酶活性;比色法定量测定ACC脱氨酶活性;PCR扩增得到菌株16S r RNA,通过序列分析、比对研究菌株的系统发育地位;通过形态、生理生化特征和16S r DNA序列比对鉴定菌种。结果显示,筛选到固氮酶活性大于9 nmol/(h·mg)的菌株共计47株,其中43株的固氮酶活性大于阳性对照固氮菌剂生产菌株圆褐固氮菌ACCC11103。筛选到产生ACC脱氨酶的菌株20株,ACC脱氨酶活性为0.326-21.980μmol/(h·mg)。将筛选到的功能菌株接种小白菜测试促生效应,其中47株使普通白菜(Brassica campestris)鲜重增加。16S r RNA测序鉴定显示筛选到的51株功能菌株系统发育地位上属于农杆菌、节杆菌、芽孢杆菌、伯克氏菌、鞘氨醇杆菌、屈挠杆菌、剑菌、肠杆菌、溶杆菌、微球菌、类芽孢杆菌、叶杆菌、假单胞菌、根瘤菌、中华根瘤菌、芽孢乳杆菌等16属31种。选取高效菌株7012、7134、7144和7164作为核心菌株制备了固氮多功能菌剂,应用于生荒地,试验地土壤微生物数量显著提高,土壤蔗糖酶、过氧化氢酶、脲酶、磷酸酶、纤维素酶、木聚糖酶活性极显著高于未施用菌剂的对照处理。多功能固氮菌制剂对于提高生荒地土壤生物活性、改善土壤生态环境具有重要作用和应用价值。