On the contractile mechanism of insect fibrillar flight muscle

Zusammenfassung Zur Erfassung der dynamischen Vorgänge bei der Muskelkontraktion wurde das System des fibrillären Insektenflugmuskels unter Bedingungen, die eine Linearisierung zulassen, untersucht. Um die Frequenzantwort als das Systemverhalten im sinusförmigen stationären Zustand zu erhalten, wurden die durch aufgeprägte sinusförmige Längenänderungen erzeugten Spannungsänderungen gemessen. Die Frequenzganganalysen beziehen sich auf die Annahme eines zeitinvarianten Systems mit konzentrierten Elementen. Die dominanten passiven Strukturen des Muskels, die Verbindungs-filamente und die Myosinbrücken, können in dem Frequenzbereich, der den Arbeitsfrequenzen des Insektenflugmuskels entspricht, durch ein aus drei Elementen bestehendes viscoelastisches System des Maxwell-Typs mit Zeitkonstanten vergleichbarer Größe beschrieben werden. Für die Frequenzantwort des aktivierten Muskels wurde mit hinreichender Genauigkeit die Übertragungsfunktion eines Phasenminimum-systems ermittelt. Eine theoretische Übertragungsfunktion für aktive Seite der Kontraktion ist durch Differenzbildung experimentell erhaltener Ortskurven bestätigt worden. Auf der Grundlage dieser theoretischen Differenzkurve wurde eine Beziehung zwischen oscillatorischer Arbeit und enzymatischer Hydrolyse des Adenosintriphosphates (ATP) als Energiequelle hergestellt. Bis zur optimalen Frequenz der Oscillation unter den benutzten Bedingungen wird eine Proportionalität zwischen diesen Größen festgestellt, die durch einen konstanten mechanochemischen Kopplungsfaktor bestimmt ist.     

On the contractile mechanism of insect fibrillar flight muscle

Zusammenfassung Als bestimmend für die Dynamik des Langzeitvorganges des Spannungsabfalles im Muskel nach aufgebrachten stufen- und rampenförmigen Längenänderungen ist das Übertragungsverhalten eines s ^k -Elementes mit einer elastischen Komponente ermittelt worden. Vergleichende Betrachtungen über die Veränderung der H-Zonenlänge und des Exponenten k haben zu einer Lokalisierung der Übertragungseigenschaften in der in der Mitte des Sarkomers befindlichen H-Zone geführt. Es wird vorgeschlagen, daß die elastische Rückstellkraft des Muskels in den parallel zur H-Zone befindlichen m-Filamenten generiert wird; diese Strukturen stellen zusätzliche Verbindungen zwischen den Myosinfilamenten in den beiden Halbsarkomeren dar. Aus der Modellierung mit einem Analogrechner folgt, daß das s ^k -Element physikalisch einer Kombination einer stark nichtlinearen Feder mit einem konventionellen Dämpfertopf entspricht. Durch vektorielle Subtraktion des s ^k -Anteiles mit elastischer Komponente von der Ortskurve der Dehnbarkeit des entspannten Insektenflugmuskels ist mit sehr guter Genauigkeit die Übertragungsfunktion von zwei in Serie befindlichen viskoelastischen Elementen des Maxwell-Typs ermittelt worden. Durch die Annahme, daß in einem der drei bereits früher postulierten Maxwell-Elemente, die als konzentriert in den dominanten passiven Strukturen — den Verbindungsfilamenten, den Myosinfilamenten und der H-Zone — angenommen wurden, die Feder in Serie mit dem Dämpfertopf eine stark nichtlineare Kraft-Längen-Charakteristik hat, wird es möglich, die Gültigkeit eines schon früher formulierten Modelles auf Langzeitveränderungen ausdehnen.Die Möglichkeit der Beschreibung von Spannungsabfällen, gemessen für verschiedene andere Muskeln, durch die Übertragungseigenschaften eines s ^k -Gliedes läßt eine Allgemeingültigkeit der am Insektenmuskel erzielten Ergebnisse als wahrscheinlich erscheinen. Die Möglichkeit ist diskutiert, daß die für Dehnungsreceptoren abgeleitete Übertragungsfunktion das im Muskel lokalisierte s ^k -Glied mit einbezieht.     

On the contractile mechanism of insect fibrillar flight muscle

Zusammenfassung Aus sinusoidalen Analysen im Frequenzbereich von 0,01–70 Hz ist es gelungen, das dynamische Verhalten des passiven Muskels durch eine Serienschaltung dreier Maxwell-Elemente zu approximieren. Die MaxwellElemente werden den im entspannten Zustand bestimmenden morphologischen Strukturen — Verbindungsfilament, Myosinfilament und H-Zone — zugeordnet. Der passive Muskel kann als ein lineares System mit konzentrierten Parametern aufgefaßt werden, da viscose Zwischenwirkungen zwischen den Actinfilamenten und den dominanten passiven Elementen vernachlässigbar klein sind. Über die aus elektronenmikroskopischen Untersuchungen und Röntgenstrukturanalysen bekannten Dehnbarkeiten der einzelnen Filamentstrukturen des Muskels ist es möglich, Steifigkeitswerte für das Verbindungsfilament (1,4 (g/m), das Myosinfilament (34,2 g/m) und die H-Zone (4,6 g/m) zu bestimmen. Der elastische Modul des Myosinfilamentes, 1,5×10¹⁰ dyn/cm² ist vergleichbar mit den in der Literatur für andere natürliche Polymere angegebenen Elastizitätswerten.Für den Muskel im Zustand der Totenstarre, wo alle Myosinbrücken am Actinfilament festhalten, wird die Dehnbarkeit der H-Zone zum bestimmenden Faktor.Die Dynamik des passiven Muskels ist im beträchtlichen Maße abhängig von der Verstärkung der Restaktivität bei sehr niedrigen Ca⁺⁺-Konzentrationen. Bei zunehmender Dehnbarkeit des Myosinfilamentes wird dieser Verstärkungsfaktor größer und die resultierende Phasennacheilung wird dominant über die durch die passiven Strukturen hervorgerufene Phasenvoreilung. Bei hoher Ionenstärke wird das Myosinfilament so weich, daß die vorhandenen niedrigen Ca⁺⁺-Konzentrationen von 10^–9M, bei denen der Muskel sich normalerweise im entspannten Zustand befindet, für eine Aktivierung ausreichen; der Muskel leistet oszillatorische Arbeit.     

Calcium binding and the activation of fibrillar insect flight muscle

A new method has been used to measure calcium binding in intact glycerol extracted muscle fibres; results with rabbit psoas muscle are in agreement with previous work. Lethocerus cordofanus flight muscle bound up to 140 μM calcium at high affinity in the presence of ATP; removal of the ATP increased the maximum amount bound to 210 μM and the affinity approx. 3-fold. Calcium binding in the presence of ATP correlated with calcium activation of the ATPase but no changes in calcium binding occurred when the muscle was further activated by stretching.     

Evidence from insect fibrillar muscle about the elementary contractile process

Bundles of myofibrils prepared from the dorsal longitudinal flight muscles of giant water bugs show oscillatory contractile activity in solutions of low ionic strength containing ATP and 10^-8-10^-7 M Ca²⁺. This is due to delay between changes of length and changes of tension under activating conditions. The peculiarities of insect fibrillar muscle which give rise to this behavior are (1) the high elasticity of relaxed myofibrils, (2) a smaller degree of Ca²⁺ activation of ATPase activity in unstretched myofibrils and extracted actomyosin, and (3) a direct effect of stretch on ATPase activity. It is shown that the cross-bridges of striated muscle are probably formed from the heads of three myosin molecules and that in insect fibrillar muscle the cycles of mechanochemical energy conversion in the cross-bridges can be synchronized by imposed changes of length. This material is more suitable than vertebrate striated muscle for a study of the nature of the elementary contractile process.     

Phosphate starvation and the nonlinear dynamics of insect fibrillar flight muscle

The nonlinear mechanical dynamics of glycerinated insect fibrillar flight muscle are investigated. The most striking nonlinearity reported previously, which often resulted in oscillatory work being limited to frequencies below those of natural flight, disappears if 5 mM or more orthophosphate is added to the experimental solutions. We show that two further asymmetric nonlinearities, which remain even though phosphate is present, are predicted by cross-bridge theory if one takes account of the expected distortion of attached cross-bridges as filament sliding becomes appreciable. Adenosine triphosphate and adenosine diphosphate have opponent effects upon the mechanical rate constants, suggesting a scheme for the sequential ordering of the events comprising the cross-bridge cycle.     

Identification of a connecting filament protein in insect fibrillar flight muscle

A major component on sodium dodecyl sulfate-containing gels of solubilized isolated Z-discs, purified from honeybee flight muscle, migrates with an apparent molecular weight of 360,000. Antibodies to this high molecular weight polypeptide have been prepared by injecting rabbits with homogenized gel slices containing the protein band. With indirect immunofluorescence microscopy these antibodies are localized to a region extending from the edge of the Z-band to the A-band in shortened or stretched sarcomeres. Similarly, glycerinated flight muscle treated with antiserum and prepared for electron microscopy shows enhanced density from the ends of the thick filaments to the I-Z junction regardless of sarcomere length. Evidence indicates that antiserum is directed toward a structural protein of connecting filaments, which link thick filaments to the Z-band in insect fibrillar muscle, rather than to a thin filament component. In Ouchterlony double-diffusion experiments a single precipitin band is formed when antiserum is diffused against solubilized Z-discs; no reaction occurs between antiserum and proteins from native thin filaments prepared from honeybee flight muscle. Further, antibody stains the I-band in flight muscle fibrils from which thin filaments are removed. Finally, honeybee leg muscle myofibrils, in which connecting filaments have not been observed, are not labelled with antibody. Since antibody binds to the short projections which extend from the flat surfaces of isolated Z-discs, these projections are assumed to be remnants of connecting filaments and the source of the 360,000 M_r protein.The amino acid composition of this high molecular weight material, purified by Sepharose chromatography, is presented. The protein has been named “projectin”.     

Structure of insect fibrillar flight muscle in the presence and absence of ATP

Low-angle X-ray diffraction pictures were taken of Lethocerus flight muscle in one or other of its two inactive states, relaxation and rigor. They showed more detail than previous pictures and the parameters of the actin and myosin helices could be deduced from the spacings of the observed layer lines. Subunits consisting of actin monomers and of myosin heads were arranged on helices so as to conform to these parameters, and the diffraction patterns from these models were calculated. When these model systems resembled the structures observed in the electron microscope, the calculated diffraction patterns had layer Unes similar in radial distribution and relative intensity to those observed, with certain exceptions. The fit was quite critical, in that variation of the size and orientation of the subunits affected it considerably. The results support the idea that in rigor (i.e. without ATP) all of the myosin heads attach to actin monomers in a regular angled configuration. In contrast, on relaxation (i.e. on addition of ATP but no Ca²⁺) most or all of the myosin heads detach from the actin and are arranged with a specific symmetry around the myosin filament. It is not necessary, however, to assume that they change shape or move far from the actin filament in this process. Features of the X-ray diffraction pattern which remained unaccounted for by this model can be explained on the basis of an arrangement of actin helices on a further helix around a thick filament. Types of extended lattices containing actin helices in statistical axial or azimuthal positions are discussed.     

The role of proctolin and glutamate in the excitation-contraction coupling of insect visceral muscle

Proctolin (1 X 10(-10) to 1 X 10(-9) M) had a minimal effect on the spontaneous and evoked electrical events of the hindgut of the cockroach Leucophea maderae. Spontaneous action potentials and contractile activity stopped when the hindgut was exposed to 2 mM Mn2+. Eighty per cent of the response of the hindgut to glutamate was blocked by manganese, but only 35% of the response to proctolin. Hindguts were responsive to proctolin in a calcium-free medium, but not to glutamate. Moreover, proctolin appeared to facilitate the reentry of calcium after depleted preparations were returned to normal levels of external calcium. The results offer evidence for two calcium transmembrane channels in insect visceral muscle.     

Studies of the chemo-mechanical conversion in artificially produced streamings. I. Reconstruction of a chemo-mechanical system from acto-HMM of rabbit skeletal muscle.

Steady and uniform streamings (SUS) of HMM solutions were set up in the presence of Mg-ATP in a circular slit, on both side-walls of which a Millipore filter was fixed; F-actin filaments from rabbit skeletal muscle were bound onto the Millipore filter by cyanogen bromide in the flow. The direction of the SUS was specificially determined by that of the flow during the fixing of F-actin and was independent of the direction of the initial velocity applied externally to the HMM solutions. The SUS continued for about 90 min with a velocity of about 20 mum/s at 20 degrees C. There was a strong correlation between the acto-HMM ATPase activity and the velocity of SUS when the salt concentration was varied. Moreover, this was also the case when the ATPase activity was controlled by Ca2+, when native tropomyosin was bound to F-actin in the circular slit. Careful examination led to the conclusions that F-actin filaments are fixed on the Millipore filter with a specific polarity and that a chemo-mechanical system had been successfully reconstituted in our "stream cells," in which chemical energy from ATP is converted to the mechanical energy of streaming.