两株中和性抗hTNFa单抗可变区与hTNFa相互作用的计算机模拟及实验研究

在ＳＧＩ图形工作站上，用同源蛋白结构预测的方法，建立了２－株中和性抗ｈＴＮＦα小鼠单抗（１Ｃ３Ｅ６，３Ｆ６Ａ１０）可变区的三结构模型，并在实验研究２株单抗表位表异性的基础上，根据２株单抗与ｈＴＮＦα分子表面的形状、静电性、疏水性、氢键等性质，对２株单抗可变区与ｈＴＮＦα分子的可能结合模式进行了模拟和分析，再根据结合模型，设计并制备了２个ｈＴＮＦα突变体，然后从实验与计算机模拟两方面着手，对比研究了     

人α型肿瘤坏死因子基因在昆虫细胞中的表达

将人肿瘤坏死因子α(Tumoor Necrosis Factor α,TNF-α)cDNA片段克隆到转移载体pat610上．然后与苜蓿尺蠖核型多角体病毒(Autogropha californica Nuclear PolyhedrinVirus,AcNPV)DNA共转染草地贪夜蛾细胞(Sptodoplet frugiperda)Sf21,获得含hTNF-a基因的重组病毒。以L929细胞毒方法测得重组病毒感染Sf21细胞72小时时的表达量最高,为1．0×10^-4u／lO 6细胞;同时,培养液中小牛血清浓度对hTNF－α表达量有较大影响,当浓度为6%时hTNF—α表达量最高．感染72小时表达量可达5．2×10⁴u／1O⁶细胞,ELISA实验结果证明其产物确为hTNF—α。     

抗人重组肿瘤坏死因子(rHTNFα)单克隆抗体的研制

肿瘤坏死因子(TNF)对许多肿瘤细胞具有细胞毒和抑制生长的作用。为进一步研究TNFα的结构和功能,并为临床研究提供rHTNFα纯品。本实验应用杂交瘤技术制备了一组抗rHTNFct单克隆抗体3、H₂、B₃,B₅、E₆、Zl₂、Z₈和Z₂₀)。ELISA结果证实它们鼻rlL－1、rlL-2、rlFNγ、rlFNα₁及E．Coli菌裂解液(MM₂₉₄)无均交叉反应,仅与rHTNFα有反应。Western blot结果进一步证实这组抗体对rHTNFα的特异性。这组抗体具有不同程度中和rHTNFα细胞毒能力。用抗rHTNFα抗体制备的亲和层析柱纯化rHTNFα,可以得到在SDS-PEAG上分子量为17000道尔顿的rHTNFα纯品。     

二硫键稳定的抗肝癌人源化Fv-突变体人TNFα融合基因的构建与表达

利用引物PCR和重叠延伸PCR法,将抗肝癌人源化抗体hscFv25重链可变区和轻链可变区各定点突变出一个半胱氨酸,将hTNFα改造成高抗肿瘤活性的突变体,分别原核表达重链可变区突变体、轻链可变区突变体-突变体hTNFα融合基因,然后将两种表达的产物混合进行复性,目的获得具有高稳定性和高抗肿瘤活性的抗肝癌靶向细胞因子.结果重链可变区突变体和轻链可变区突变体-突变体hTNFα融合基因在大肠杆菌中均获得高效表达.表达产物以包涵体形式存在,混合复性结果未获得活性产物.     

抗CD3基因工程嵌合抗体IgG在哺乳动物细胞中的表达和活性测定

利用基因工程方法将鼠源性抗CD3抗体HIT3a的可变区和人源抗体(IgG)的完整的恒定区连接起来,构建全抗型抗CD3嵌合抗体,该型抗体具有较低的免疫源性可作为免疫抑制剂应用于器官移植,减少受体产生免疫排斥,提高移植器官的存活率。利用PCR方法从抗CD3 ScFv重组噬菌体表达载体pCANTAB 5E上扩增抗CD₃抗体的轻链和重链可变区,将轻链和重链可变区组装到含有人抗体（IgG）恒定区的表达载体中,构建抗CD3嵌合抗体IgG的轻链和重链表达载体PKN100和PG1D105,并用脂质体法共转染CHO细胞。结果证明,抗CD₃嵌合抗体的V_L和V_H与HIT3a抗体的V_L和V_H完全相符,ELISA和Western blot检测结果证实转染细胞的培养上清中含有抗CD₃嵌合抗体IgG的表达,表达产物能与Jurkat细胞结合,并能竞争性抑制HIT3a抗体和Jurkat细胞结合活性,³H-TdR掺入实验表明, 抗CD3嵌合抗体与亲代抗体HIT3a一样,具有促进外周血单核细胞增殖的作用。我室构建的全抗型抗CD3嵌合抗体分子表达载体可在CHO细胞中稳定表达,表达产物有较好生物活性,具有潜在的临床应用价值。     

碳酸钙促进丙酮酸发酵过程中α-酮戊二酸的形成

在多重维生素营养缺陷型菌株光滑球拟酵母CCTCC M202019发酵生产丙酮酸的摇瓶和发酵罐实验中发现,CaCO₃的添加对发酵液中α-酮戊二酸（α-KG）的积累有重要影响。在维生素浓度不变且供氧充分的前提下,延迟CaCO₃添加时间可明显抑制α-KG的产生,并提高丙酮酸与α-KG的碳摩尔比(C_PYR/C_αKG);而增加培养基中的CaCO₃浓度会导致αKG积累的增加。用不同物质调节发酵液中pH的实验证实：在丙酮酸发酵过程中, Ca²⁺对αKG的积累起主要作用,CO₃^2-起辅助作用,两者对α-KG的积累具有协同效应。维持培养基中CaCO₃浓度不变,改变培养基中硫胺素的浓度,对αKG的积累,特别是对C_PYR/C_α-KG值没有影响;而增加培养基中生物素的浓度,则导致αKG的浓度不断上升且C_PYR/C_α-KG值不断下降。当有Ca2+存在时,胞内丙酮酸羧化酶的活性最高可提高40%,而丙酮酸脱氢酶系的活性没有明显变化。结果表明,丙酮酸发酵过程中α-KG的形成是由于CaCO₃促进了丙酮酸羧化反应,其中Ca²⁺可显著提高丙酮酸羧化酶的活性,而CO₃^2-则有可能作为丙酮酸羧化反应的底物。     

二硫键稳定的抗肝癌人源化Fv—突变人TNFα融合基因的构建与表达

利用引物PCR和重叠延伸PCR法,将抗肝癌人源化抗体hscFv25重链可变区和轻链可变区各定点突变出一个半胱氨酸,将hTNFα改造成高抗肿瘤活性的突变体,分别原核表达重链可变区突变体,轻链可变区突变体-突变体hhTNFα融合基因,然后将两种表达的产物混合进行复性,目的获得具有高稳定性和高抗肿瘤活性的抗肝癌靶向细胞因子。结果重链可变区突变体和轻链可变区突变体-突变体hTNFα融合基因在大肠杆菌中均获得高效表达,表达产物以包涵体形式存在,混合复合结果未获得活性产物。     

原生质体融合技术构建糖化型啤酒酵母的研究

融合亲株B_6-5（Ala^-,Cys^-α）和T_3-4（His,Thr^-α）细胞于35％PEG（6000）－50mmol／LCaCl₂溶液,28℃下诱导融合30min,筛选出融合株,融合频率为6．2×10^-5。融合株细胞的体积和DNA含量均为两系株细胞之和。融合株有水解淀粉的能力,又有发酵度高于生产用酵母的特点。     

抗CD20嵌合抗体片段Fab′突变体的表达和活性研究

利用PCR方法从抗CD20单链抗体（ScFv）表达载体上扩增抗CD20抗体轻链可变区基因（V^L）、重链可变区基因（V^H）,同时在抗体的可变区引入突变,然后将V^H、V^L基因重组到Fab′表达载体pYZF1中,构建抗CD20嵌合抗体Fab′片段表达载体,并在大肠杆菌16c9中进行高效可溶性分泌表达。经大量的筛选,获得一个产量和活性均有所提高的突变克隆。其突变位点在轻链可变区的CDR1区,即G77→A（Ser→Asn）。突变的抗体的表达量为每克干菌3.8 mg,而未突变抗体的表达量为每克干菌1.3 mg。突变体的亲和力常数K_a为2.2×10⁹ L/mol,约为突变前的2倍。竞争性免疫荧光抑制实验表明,突变的Fab′片段能竞争性抑制鼠源性抗CD20抗体HI₄₇和CD20表达细胞Raji细胞的结合,使HI₄₇的结合阳性率由98%下降至37.55%,体外细胞生长抑制试验亦证明突变的Fab′片段的抑制活性明显高于未突变的抗体。     

Ca2＋对蝮蛇蛇毒溶血毒素构象的影响

利用荧光光谱学对BPLA₂和Ca^2＋相互作用的研究表明,Ca^2＋在BPLA₂中十分重要.在Ca^2＋存在时,底物与BPLA₂的结合使酶中色氨酸残基周围的环境变得较为疏水,荧光发射谱蓝移达9nm,而无Ca^2＋存在时却无此现象发生;实验证明BPLA₂分子中有一较强的疏水区,Ca^2＋可明显增强这一区域的疏水性;另外,我们还发现Ca^2＋与酶的结合与酶中唯一的His残基有关.     

消癥止痛汤联合耳穴压豆对气滞血瘀型子宫内膜异位症痛经患者炎症因子和PGE2、PGF2α的影响

摘要 目的：观察消癥止痛汤联合耳穴压豆对气滞血瘀型子宫内膜异位症（EMT）痛经患者炎症因子和前列腺素E₂（PGE₂）和前列腺素F2α（PGF2α）的影响。方法：选取2021年3月至2022年12月期间在广州中医药大学附属中山中医院收治的98例EMT痛经患者作为研究对象。采用随机数字表法将其分为对照组（常规西医治疗，n=49）和研究组（对照组的基础上消癥止痛汤联合耳穴压豆，n=49）。对比两组疗效、疼痛情况评分[疼痛视觉模拟评分（VAS）、COX痛经症状积分、]、中医证候评分、炎症因子[白细胞介素-6（IL-6）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-8（IL-8）]和PGE₂和PGF2α水平。结果：研究组的临床总有效率高于对照组（P<0.05）。治疗3个疗程后，研究组VAS、COX痛经症状积分、中医证候总评分低于对照组（P<0.05）。治疗3个疗程后，研究组IL-6、TNF-α、IL-8低于对照组（P<0.05）。治疗3个疗程后，研究组PGE₂高于对照组，PGF2α低于对照组（P<0.05）。结论：消癥止痛汤联合耳穴压豆治疗气滞血瘀型EMT痛经患者，可有效改善痛经症状，降低中医证候评分，调节血清炎症因子和PGE₂、PGF2α水平。     

抗人IL-6单克隆抗体的制备及鉴定

用基因重组人IL-6免疫Balb/c小鼠,采用小鼠杂交瘤技术,筛选克隆到分泌抗人重组IL-6单克隆抗体的杂交瘤细胞株,并对其中2H₂、 1D₂ 和4B₄瘤细胞株进行了鉴定.其抗体类别均为IgG,亚类分别为IgG1和IgG2a.用多种细胞因子和无关蛋白的鉴别试验结果证实它们均特异地识别rhIL-6.免疫转染结果显示,该单抗识别分子质量为21 ku的IL-6单一条带.IL-6单克隆抗体的亲和常数K_aff= 1.62×10⁹ (mol/L)^-1.     

苦绳（Dregea sinensis）中多氧化孕烷糖苷与免疫蛋白相互作用的研究

目的 基于化学结构特点研究植物苦绳（Dregea sinensis）中多氧孕烷糖苷的生物活性,以及化合物分子与靶蛋白分子间的作用机理。方法 本研究采用分子对接和表面等离子体共振方法,对191个多氧化孕烷糖苷类成分（>800 u）进行了免疫活性及其与免疫蛋白的动力学评价。结果 通过分子对接方法筛选出7个配体分子（6、18、23、30、78、79和80）和3个免疫相关蛋白（IL-2Rα、TLR4和TNF-α）。研究表明,化合物30和78在SPR实验中与靶蛋白IL-2Rα和TLR4具有显著的结合趋势,与IL-2Rα的结合常数K_D分别为2.41×10^-6和2.14×10^-6 mol/L,与TLR4则分别为1.96×10^-5和5.60×10^-6 mol/L。分子动力学研究进一步表征SPR阳性分子6、18、30、78和80与靶蛋白之间的相互作用基团。结论 研究揭示多氧化孕烷糖苷类成分可以通过形成氢键和Pi-Pi相互作用与靶蛋白结合。研究内容对快速评价多氧化孕烷糖苷类成分的活性具有重要意义,为揭示低丰度药效物质的潜在作用机制进行了有益探索。     

前列腺素E2、HSP90α、C-myc在肝细胞癌患者血清中的表达水平及意义

摘要 目的：探究前列腺素E₂、热休克蛋白90α（HSP90α）、C-myc基因（C-myc）在肝细胞癌患者血清中的表达水平及意义。方法：选取2017年12月-2019年6月在我院接受治疗肝细胞癌的患者50例,作为肝细胞癌组,另选同时段健康人群50例,作为本研究对照组。抽取两组研究对象清晨空腹静脉血5 mL并进行离心处理,使用酶联免疫吸附试验法检测前列腺素E₂水平,免疫透射比浊法检测HSP90α水平,Western blot法检测C-myc相对表达量,并对前列腺素E₂、HSP90α、C-myc在肝细胞癌患者血清中相关性进行研究。结果：对照组研究对象血清中前列腺素E₂、HSP90α、C-myc的相对表达量低于肝细胞癌组研究对象（P＜0.05）;肿瘤体积＜5 cm³的患者前列腺素E₂、HSP90α、C-myc的相对表达量低于肿瘤体积≥5 cm³患者;有淋巴结转移情况的患者前列腺素E₂、HSP90α、C-myc的相对表达量高于无淋巴结转移情况的患者;浸及浆膜的患者前列腺素E₂、HSP90α、C-myc的相对表达量高于未浸及浆膜的患者;低分化的患者前列腺素E₂、HSP90α、C-myc的相对表达量高于中、高分化的患者;Ⅰ+Ⅱ期的患者前列腺素E₂水平低于Ⅲ+Ⅳ期的患者（P＜0.05）。前列腺素E₂、HSP90α、C-myc三者在肝细胞癌患者血清中表达呈正相关。结论：前列腺素E₂、HSP90α、C-myc在肝细胞癌中表达异常,而且三者之间具有一定的相关性,对前列腺素E₂、HSP90α、C-myc在肝细胞癌中相对表达量进行检测分析,对了解患者的病情具有一定的指导参考意义。     

重组人VEGF165的表达纯化及单抗的初步筛选

血管内皮细胞生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)是抑制肿瘤生长和转移的重要靶点。为获得抗VEGF单抗细胞株,构建了rhVEGF₁₆₅工程菌,并利用复合自动诱导获得高效表达。经纯化获得高纯度rhVEGF₁₆₅蛋白,经检测具有促人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells, HUVECs)增殖活性,其EC₅₀为2.4ng/ml。免疫小鼠,获得了3株能稳定分泌抗VEGF单抗的杂交瘤细胞株,为开发VEGF治疗性单抗提供了重要基础。     

简便快速纯化人血清α1-酸性糖蛋白的方法

本文采用(NH₄)₂SO₄和CCl₃COOH沉淀,及Cibacron blue F3G-A-SephadexG-100凝胶柱层析,经二步提纯了人血清α₁-酸性糖蛋白。PAGE鉴定,在阳极端仅显示一条蛋白带。Schiff氏试剂染色阳性,证实为糖蛋白。SDS-PAGE测得其分子量为45000。免疫电泳结果表明,纯化的α₁-酸性糖蛋白与兔抗人全血清及免抗人α₁-酸性糖蛋白均呈现单一沉淀弧。氨基酸组成测定亦与文献报告的结果基本一致。本方法简便、省时。     

P2-DNA的转染及提纯

P₂-DNA即Phage 2型噬菌体的染色体DNA,是一条线状双股螺旋的DNA分子,分子量为2．2×10⁷Da。有19个碱基的牯性末端．可以连接成环状^[1]．1970年Bertani L.E. 和 Bertani G分离纯化得到P₂噬苗体并对其遗传学及理化特性进行了研究^[2],发现它在DNA复制,溶源性的控制以及基因重组等方面与温和性λ菌体不同;1979年Saint R B 等和Westoo A等先后研究了P₂-DNA的几种限制酶的切割图谱^[3]。P₂-DNA可望成为分子生物学研究的重要工具和实验材料。目前国内尚无这种材料．我们试图将少量的P₂-DNA转染获得P₂噬菌体,加以扩增纯化．抽提得到大量的P₂-DNA。为分子克隆和限制酶的研究提供有实用价值的材料和研究工具。     

螺环哌啶类似物作为DOR激动剂的特征结构研究

阿片受体激动剂与特定阿片受体亚型结合,常用来治疗与外伤、癌症或心脏病相关的严重疼痛,是十分有吸引力的药用物质．阿片受体有3种经典亚型(δ, κ, μ),均有与其对应的激动剂．δ阿片受体(DOR)激动剂因其还有明显的抗焦虑、抗抑郁和器官保护作用,是非常有前景的药物．本文研究了一批共102个N-取代螺环哌啶类似物作为δ阿片受体激动剂的分子,采用比较分子力场(CoMFA)和比较分子相似性指数(CoMSIA)两种分析方法对所有分子进行了三维定量构效关系(3D-QSAR)研究,其中基于疏水场和氢键供体场参数建立的CoMSIA模型最佳,其模型结果为：Q²=0.501,R²_ncv=0.787,R²_pre=0.780,证明模型自我吻合良好,同时有较强的内部及外部预测能力．而模型的等势线图分析表明,在R₁处引入疏水性的取代基及在R₂处引入亲水性的取代基或氢键供体基团对提高激动剂活性有利．这些结论有助于更好地理解N-取代螺环哌啶类似物作为DOR激动剂的机理,为新型的δ阿片受体激动剂的设计和优化提供一定的指导．     

慢性阻塞性肺疾病患者血清8-iso-PGF2α、HIF-1α、NGAL、caspase-3水平与肺功能及认知功能障碍的关系研究

摘要 目的：探讨慢性阻塞性肺疾病（COPD）患者血清8-异前列腺素F2α（8-iso-PGF2α）、低氧诱导因子（HIF-1α）、中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白（NGAL）、半胱氨酸天冬酶-3（caspase-3）水平与肺功能及认知功能障碍的关系。方法：选取2018年3月至2020年6月期间我院收治的62例COPD合并认知功能障碍患者（认知功能障碍组）,另选取50例COPD未合并认知功能障碍患者为对照组。比较两组血清8-iso-PGF2α、HIF-1α、NGAL、caspase-3水平和肺功能、蒙特利尔认知评估量表（MoCA）评分,分析COPD合并认知功能障碍患者血清8-iso-PGF2α、HIF-1α、NGAL、caspase-3与肺功能、MoCA评分的相关性。结果：认知功能障碍组血清8-iso-PGF2α、HIF-1α、NGAL、caspase-3水平高于对照组（P＜0.05）,认知功能障碍组第1秒用力呼气容积（FEV₁）、FEV₁与用力肺活量比值（FEV₁/FVC）、 FEV₁占预计值百分数(FEV₁%pred)、MoCA评分均低于对照组（P＜0.05）。Pearson相关分析结果显示COPD合并认知功能障碍患者血清8-iso-PGF2α、HIF-1α、NGAL、caspase-3水平与FEV₁、FEV₁/FVC、FEV₁%pred、MoCA评分均呈负相关（P＜0.05）。结论：COPD合并认知功能障碍患者血清8-iso-PGF2α、HIF-1α、NGAL、caspase-3水平较COPD未合并认知功能障碍患者明显升高,8-iso-PGF2α、HIF-1α、NGAL、caspase-3升高与肺功能下降和认知功能受损均存在相关性,对COPD患者病情及认知功能障碍具有一定预测价值。     

江浙蝮蛇毒碱性磷脂酶A2正交晶体分子置换法结构测定

江浙蝮蛇(Agkistrodon halys pallas)毒碱性磷脂酶A2具有很强的溶血作用.P2₁2₁2₁晶型的晶体学不对称单位中含有2个分子.用自身旋转函数研究了此2分子的相对空间关系,用交叉旋转函数和平移函数测定了2分子在晶胞中的取向与位置.在此基础上进行了初步的三维结构模型构建与结构修正.碱性磷脂酶A2正交晶体不对称单位中2个分子的排布呈现非晶体学二重对称关系.