转石蒜凝集素基因烟草的抗蚜虫性

利用农杆菌介导法将质粒pBILRA转化烟草(Nicotianatabacum L.),该质粒含有由花椰菜花叶病毒35S启动子(CaMV35S)引导的筛选基因新霉素磷酸转移酶基因(nptⅡ)及石蒜凝集素基因(lra).通过卡那霉素筛选获得了25株独立转基因烟草植株.Western blot分析表明,石蒜凝集素蛋白在不同转基因植株中表达量不同.对转基因T1代植株的遗传分析表明,lra基因在大多数独立转基因植株后代中以孟德尔3:1的分离比方式遗传.抗虫试验表明,表达较高水平石蒜凝集素蛋白的转基因烟草对桃蚜种群的生长具有明显的抑制作用.首次报道了表达石蒜凝集素基因的烟草对蚜虫具有抗性.石蒜凝集素基因可用于植物抗虫基因工程研究及应用.     

激发子基因peaT1转化三生烟及其对TMV抗性的提高

通过根癌农杆菌(Agrobactrium tumefaciens)介导转化法,将含有激发子基因peaT1的植物表达载体pCAM-BIA2300-G4AS-peaT1转化三生烟,获得了转基因烟草植株。用PCR检测确认了阳性转化株,用Southern杂交、RT-PCR和Western杂交进一步证实了peaT1基因的整合、转录和表达。对T1代转基因阳性株进行TMV接种试验,结果显示,与非转基因对照相比,表达peaT1的烟草叶片枯斑数量减少,表明蛋白激发子基因peaT1的表达提高了转基因烟草对TMV的抗性。     

转金属硫蛋白及其突变体αα基因烟草的T1代性状分析

转金属硫蛋白MT及其突变体αα的烟草自交得到T1代,转基因植株的重金属抗性和除草剂抗性在后代中得到保持,不同的转基因株系在含有除草剂的培养基中萌发时表现出不同的抗性分离比,说明外源基因在植物染色体内可能有不同的整合拷贝数。两种转基因烟草在含有不同浓度Cd的培养基中萌发时表现出高的重金属抗性,其中转αα基因烟草对Cd的抗性优势在T1代种子萌发实验中更加明显。以MT cDNA为探针进行Southern blot杂交,在T0代和T1代同时检测到两种转基因烟草外源基因的存在,证明外源基因确实整合到烟草基因组内并稳定传递到后代。Western blot结果证明了外源基因在烟草第二代的表达,纯合株系仍需要进一步的筛选。     

利用双T-DNA载体系统培育无选择标记转基因烟草

建立了一种利用双T-DNA载体培育无选择标记转基因植物的方法.通过体外重组构建了双T-DNA双元载体pDLBRBbarm.载体中,选择标记nptⅡ基因和另一代表外源基因的bar基因分别位于2个独立的T-DNA.利用农杆菌介导转化烟草(Nicotiana tabacum L.),在获得的转化植株中,同时整合有nptⅡ基因和bar基因的频率为59.2%.对4个同时整合有nptⅡ和bar基因植株自交获得的T1代株系进行检测分析,发现在3个T1代株系2个T-DNA可以发生分离,其中约19.5%的转基因T1代植株中只存在bar基因而不带选择标记nptⅡ.这一结果说明双T-DNA载体系统能有效地用于培育无选择标记的转基因植物.研究还利用位于2个不同载体上的nptⅡ基因与 bar基因通过农杆菌介导共转化烟草,获得共转化植株的频率为20.0%～47.4%,低于使用双T-DNA转化的共转化频率.     

利用双T-DNA载体系统培育无选择标记转基因烟草

建立了一种利用双T-DNA载体培育无选择标记转基因植物的方法。通过体外重组构建了双T-DNA双元载体pDLBRBbarm。载体中,选择标记nptⅡ基因和另一代表外源基因的bar基因分别位于2个独立的T-DNA。利用农杆菌介导转化烟草(Nicotiana tabacum L.),在获得的转化植株中,同时整合有nptⅡ基因和bar基因的频率为59．2％。对4个同时整合有nptⅡ和bar基因植株自交获得的T1代株系进行检测分析,发现在3个T1代株系2个T-DNA可以发生分离,其中约19．5％的转基因T1代植株中只存在bar基因而不带选择标记nptⅡ。这一结果说明双T-DNA载体系统能有效地用于培育无选择标记的转基因植物。研究还利用位于2个不同载体上的nptⅡ基因与bar基因通过农杆菌介导共转化烟草,获得共转化植株的频率为20．0％～47．4％,低于使用双T-DNA转化的共转化频率。     

抗草甘膦抗虫植物表达载体的构建及其转基因烟草的分析

构建了含草甘膦抗性突变基因（aroAM12）和人工合成重组Bt抗虫基因（Bts1m）的植物表达载体pCM12_s1m。aroAM12基因的表达由CaMV35S启动子控制,Bts1m基因的表达由2E_CaMV35S启动子和Ω因子控制。通过农杆菌介导,将aroAM12和Bts1m基因转化到烟草中,转基因烟草通过在含草甘膦的MS培养基上筛选而获得。Southern blot分析表明所有经过草甘膦筛选出的转化植株都整合有aroAM12基因,约70%的转化植株同时整合有aroAM12和Bts1m基因。Northern blot、Immunodot blot分析进一步证明整合的两个基因在转录、翻译水平上均进行了表达,不同植株之间表达存在着差异。草甘膦抗性和虫试实验证明,获得的转基因烟草对草甘膦和烟青虫具有很强的抗性。     

转OsMAPK4基因烟草的抗旱性研究与遗传分析

以低温处理的水稻辽盐241植株叶片总RNA为模板, 用OsMAPK4基因特异引物通过RT-PCR扩增出OsMAPK4基因, 构建了由E12启动子调控的OsMAPK4基因植物表达载体pBME12。通过农杆菌介导法将OsMAPK4基因导入烟草, 筛选获得25株转基因植株。抗旱性研究结果表明, OsMAPK4基因的超量表达提高了T1代转基因植株的抗旱性。卡那霉素抗性在T1代转基因植株中的分离情况表明, 大多数转基因株系符合单基因遗传规律。     

口蹄疫病毒VP1基因在番茄中的表达及转基因番茄对豚鼠诱导免疫保护

构建克隆有O型口蹄疫病毒China99株VP1基因的植物双元表达载体pBin438/VP1。通过农杆菌介导法转化番茄子叶,经卡那霉素抗性筛选,获得60株抗性植株。对抗性植株分别做PCR、RT-PCR检测目的基因的整合与转录,ELISA筛选约40%的卡那抗性植株阳性,分别提取两株ELISA和Western blot检测阳性的转基因番茄叶片蛋白与弗氏佐剂乳化,于0、15、30d经肌肉途径免疫豚鼠,第三次免疫后28d用100ID50的同源强毒攻击,根据豚鼠抗体水平的消长动态和免疫豚鼠抗强毒攻击的保护率进行转基因植物疫苗免疫原性的评估。结果表明,双元表达载体pBin438/VP1构建正确,PCR、RT-PCR结果证实口蹄疫病毒VP1基因已整合到番茄基因组并在转录水平表达,ELISA和Western blot检测重组蛋白能够与FMDV阳性血清反应。转基因番茄第三次免疫豚鼠后21d血清效价最高可达1∶64,攻毒后两组免疫豚鼠保护率分别达80%和40%,证明转基因番茄表达的VP1蛋白具有良好的免疫原性。     

转金属硫蛋白及其突变体αα 基因烟草的Tl代性状分析

转金属硫蛋白MT及其突变体αα的烟草自交得到T1代,转基因植株的重金属抗性和除草剂抗性在后代中得到保持.不同的转基因株系在含有除草剂的培养基中萌发时表现出不同的抗性分离比,说明外源基因在植物染色体内可能有不同的整合拷贝数.两种转基因烟草在含有不同浓度Cd的培养基中萌发时表现出高的重金属抗性,其中转αα基因烟草对Cd的抗性优势在T1代种子萌发实验中更加明显.以MTcDNA为探针进行Southernblot杂交,在T0代和T1代同时检测到两种转基因烟草外源基因的存在,证明外源基因确实整合到烟草基因组内并稳定传递到后代.Westemblot结果证明了外源基因在烟草第二代的表达.纯合株系仍需要进一步的筛选.     

烟草质体多顺反子定点整合表达载体的构建和转化

构建了烟草质体多顺反子定点整合表达载体pLM4(-psaA-Prrn-RBS-man-RBS-gfp-RBS-aadA-psbA3'-psbC-).用基因枪将该载体轰击烟草叶片5次,用添加了壮观霉素的选择分化培养基筛选,获得质体转基因烟草6株.用PCR、激光扫描、Western blot和RFLP等方法检测都证实多顺反子表达盒中的3个基因甘露聚糖酶基因(man)、绿荧光蛋白基因(gfp)、氨基糖苷3'-腺苷酰基转移酶基因(aadA)已整合到烟草质体基因组中,且均得到表达.     

转拟南芥ICE1基因增强烟草抗寒性的研究

ICE1是CBF冷响应通道的上游转录调控因子,通过与CBF启动子中MYC顺式作用元件的结合激活CBF3基因表达.采用RT-PCR方法,从拟南芥获得AtICE1基因,将AtICE1导入pCAMBIA1301构建35S:AtICE1植物表达载体.通过根癌农杆菌GV3101,将AtICE1基因导人烟草,T1代植株经潮霉素抗性筛选,PCR、RT-PCR检测,结果表明AtICE1基因已经整合到烟草基因组中,并在转录水平表达;在正常生长条件下,转基因烟草与对照烟草的生长未见明显区别,而在瞬时低温冻害下,转基因烟草存活率明显高于对照烟草植株,说明Atl-CEI基因可以提高低温敏感作物的耐寒性.     

甘菊DlNAC1转录因子基因提高烟草耐高温能力

研究针对从甘菊中克隆获得的DlNAC1基因（GenBank登录号为EF602305）进行生物信息学分析,并利用根癌农杆菌介导的叶盘转化法将该基因在烟草中进行过表达研究。结果发现DlNAC1蛋白具有较高亲水性,二级结构中占比最高的为无规则卷曲,并具有N糖基化位点等6类潜在的模体结构和典型的由一个扭曲的反平行β片层和α螺旋组成的NAC结构域。将DlNAC1基因在烟草中过表达后,通过PCR方法从55株转化植株中鉴定出36株为阳性植株,并且转基因烟草T₀代植株在45℃高温胁迫后,转35S：DlNAC1基因阳性植株生长状况良好,而对照植株发生萎蔫,并且转基因植株叶片含水量显著高于对照植株。然而,在4℃低温胁迫后,发现转基因烟草T₁代植株没有提高耐低温能力。甘菊DlNAC1基因能够提高烟草植株耐高温能力,为今后菊花抗逆育种提供了科学依据。     

人工合成的纳豆激酶基因转化烟草的研究

根据植物偏爱密码子人工合成的纳豆激酶基因sNK和其中插入番茄果实特异表达基因E8第一内含子的纳豆激酶基因sNK-E8i,通过农杆菌侵染的方法转化到烟草NC89中。经PCR检测,得到12株转sNK基因烟草植株和10株转sNK-E8i基因烟草植株,初步证明目的基因已整合到烟草基因组中;RT-PCR检测有9株转sNK基因烟草植株和10株转sNK-E8i基因烟草植株为阳性;通过RT-qPCR将两种基因在烟草中的表达量进行比较,结果表明转sNK-E8i基因的植株中纳豆激酶的表达量比转sNK基因的植株中高;通过纤维蛋白平板法检测其活性,共有5株转sNK基因烟草植株和3株转sNK-E8i基因烟草植株检测到溶圈,说明目的基因在部分转基因烟草中可正常转录和翻译并表现出溶栓活性。经加代培养已得到T1代转基因植株。     

利用转基因烟草表达人胰高血糖素样肽1的研究

人胰高血糖素样肽1(hGLP1)是一种短肽激素,是近年来备受关注的治疗糖尿病最有前景的候选药物。在设计合成hGLP1基因并构建植物表达载体的基础上,通过农杆菌介导将hGLP1基因导入烟草基因组中,获得转化再生植株,经过PCR扩增和Southern blot分析,证实hGLP1基因已整合进入6个株系的烟草基因组中。GUS组织化学染色表明,与目的基因融合的报告基因在转基因烟草中获得表达。Western blot检测表明,其中2个株系转基因烟草叶片中能够检测到hGLP1融合蛋白的表达。初步的动物试验表明该融合蛋白具有一定的降血糖生物活性。     

拟南芥CYCD2;1基因植物表达载体的构建及在烟草中的遗传转化分析

细胞分裂是生物的基本特征之一,在植物生长发育的过程中,发挥着极其重要的作用,细胞周期蛋白CYCD2;1基因作为一个调控因子,对调节细胞周期具有重要作用。本文以拟南芥细胞周期蛋白(At CYCD2;1基因)作为研究对象,利用PCR技术从拟南芥花序c DNA扩增出At CYCD2;1基因,构建植物表达载体(pROKIIAt CYCD2;1)并利用农杆菌介导的叶盘法转化野生型烟草。转基因植株的PCR检测结果表明,At CYCD2;1基因已经整合到了烟草基因组中。在T2代植株中,通过实时定量荧光PCR检测显示,At CYCD2;1在mRNA水平也均有表达。过量表达CYCD2;1的转基因烟草在花器官中存在明显表型,与野生型相比主要表现为转基因植株花冠宽度变大,花瓣和萼片长度变长,果实变大,上述结果表明At CYCD2;1基因影响花的发育。     

人干扰素α-2b基因在烟草中的表达研究

应用PCR的技术从质粒pAIFN中扩增人干扰素α-2b(Human interferon α-2b,HuIFN α-2b)编码基因,将其连接到pBI121双元载体构建植物真核表达载体pBIFN;用冻融法将该载体转染根癌农杆菌LBA4404;并用叶盘浸染法转化烟草叶片,经转化的烟草叶片的组织培养,诱导愈伤获得再生植株。通过应用PCR,RT-PCR,Wes-tern blot和WISH/VSV方法检测获得的烟草再生植株,结果表明HuIFN α-2b基因已成功整合进烟草核基因组并表达出具有活性的HuIFN α-2b蛋白。本文对HuIFN α-2b基因在烟草核系统中的表达进行了研究,为进一步在烟草叶绿体系统中该基因的表达研究奠定了基础。     

转小麦冷胁迫蛋白截短基因烟草及其抗病性分析

TA3-13是克隆于小麦冷胁迫蛋白基因的截短片段。原核表达的TA3-13蛋白能够诱导烟草产生显著的抗烟草花叶病毒(TMV)的作用。文章将TA3-13基因片段克隆到植物表达载体pBI121上,构建成转基因重组体pB-3-13,通过冻融法转化农杆菌EHA105,构建成转基因侵染菌株。采用叶盘法将pB-3-13转化三生烟草,经卡那霉素抗性筛选,获得48株T0代再生植株。通过PCR检测,鉴定出33株转基因单株,收获了20株种子作为T1代株系。PCR-Southern杂交结果显示,PCR阳性条带与TA3-13探针有特异性杂交,说明外源基因被转化到烟草的基因组中。选取两个T1代株系的烟草植株用于各项测定。GUS组织化学活性鉴定和RT-PCR检测结果显示,外源基因可以成功地表达。接种TMV病毒后,转基因烟草抗TMV的能力较转空载体烟草提高3～5倍。转基因烟草具有抗TMV侵入和抗病毒病害发展的作用,同时转基因烟草可以抗细菌软腐病菌的扩展。     

农杆菌介导蜡质基因WIN1转化烟草的初步研究

WIN1与蜡质代谢过程中基因的表达相关,本研究首先从野生型拟南芥花蕾中提取总RNA扩增成SHN1/WIN1,以载体PBI121为基础构建植物表达载体PBI121-SHN1/WIN1,然后利用农杆菌介导法将目的基因WIN1导入烟草k326中,在不同阶段选择四种不同培养基进行培养,其中烟草叶盘共培养培养基T1为：MS+1 mg·L^-1 6-BA+0.1 mg·L^-1 NAA;烟草滤菌培养基T2为：MS+1 mg·L^-1 6-BA+0.1 mg·L^-1 NAA+500 mg·L^-1 Carb;烟草筛选培养基T3为：MS+100 mg·L^-1 Kan;烟草继代培养基T4为：MS+80 mg·L^-1 Kan+300 mg·L^-1 Carb。本实验利用植物基因工程手段将WIN1基因整合入烟草K326中,改变烟草k326总基因序列。通过PCR、RT-PCR检测方法对转基因烟草k326一代进行鉴定得出WIN1基因成功导入烟草K326,最终获得了转基因烟草K326一代品种。本实验研究目标通过转基因技术将WIN1基因插入烟草K326,使其角质膜厚度和成分有所改变,以此来提高烟草K326抗旱、抗寒和抗病等性能,为提高烟草抗逆性特别是抗旱和抗寒性奠定基础。该项初步研究结果不仅对认识和揭示植物角质膜的结构功能具有重要理论意义,而且对应用植物基因工程技术改良和培育抗逆性强的植物优良品种和农业生产都具有重要的应用价值。     

转望江南核糖体失活蛋白基因cassin烟草及其对烟草花叶病毒的抗性

通过构建植物表达载体,由农杆菌介导,将望江南核糖体失活蛋白基因cassin转入烟草。PCR和Southern blot杂交结果证明：外源基因已经以单拷贝整合到烟草基因组内,并且在后代发生遗传分离。RT—PCR和Northern blot杂交结果显示：外源基因可以正常转录。用不同浓度的TMV机械摩擦接种转基因T1、T2代各3个自交株系,以非转基因烟草为阴性对照,实验结果表明转基因烟草对TMV表现出不同程度的抗性。     

马铃薯Y病毒蚜传辅助成分介导PVX/PVY协生作用

构建了马铃薯Y病毒中国株系（PVY－C）蚜传辅助成分（HC－Pro）基因的正义、反义和缺失三种植物表达载体,通过农杆菌介导法转化烟草品种NC89。Southern blot分析表明,HC－Pro基因及其突变体已经整合到烟草染色体中,Western blot分析证明,正义HC－Pro基因及其缺失突变体在转基因烟草中有表达产物,攻毒试验结果表明,转正义,HC－Pro基因及其缺失突变体不仅能够提高T1转基因烟草中PVY－C的病毒积累和致病,而且对异源病毒PVX具有同样的作用,而转反义HC－Pro基因烟草对PVY－C和PVX的致病性无影响,因此,PVY－C HC－Pro基因介导PVX／PVY的协作作用。