肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体的表达及其活性检测

目的:构建肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)高表达工程菌株,以获得具有生物学活性的重组TRAIL蛋白.方法:合成TRAIL基因,转到大肠杆菌中,IPTG诱导获得成功表达;进一步优化,增加可溶形式的蛋白质.利用硫酸铵对发酵液进行沉淀,经Ni柱、阴离子和阳离子交换柱层析,最终获得蛋白质纯品,对其进行体外活性检测.结果:经过IPTG诱导后,TRAIL达到菌体总蛋白的30％;经过优化,可溶形式蛋白达到55％.纯化获得纯度高于95％的TRAIL样品,体外测活结果表明:TRAIL蛋白能有效抑制多种肿瘤细胞增殖,抑制率达到70％-92％.结论:重组TRAIL以可溶形式得到高效表达,且具有较好的生物学活性,为其开发成药用蛋白奠定基础.     

人源抗菌肽LL-37的原核表达及活性鉴定

目的:实现大肠杆菌高效可溶表达人源抗菌肽LL-37。方法:LL-37基因克隆至原核载体pET32a,于大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达。运用相关生物信息学软件分析重组蛋白Trx-LL-37的理化性质、亲/疏水性、蛋白质二级结构及其可溶表达概率。实验还考察了不同诱导温度对重组蛋白可溶表达比例的影响。结果:生物信息学分析显示,Trx-LL-37分子量21.5kD,理论等电点6.3,物理性质稳定,二级结构简单,具有可溶表达倾向。重组蛋白最佳诱导温度为17℃,与37℃相比,可溶表达比例由37.2%提高至50.2%,并且总表达量也提高了5%左右。抑菌结果显示纯化产物对多种常见细菌的生长具有抑制作用。结论:可采用融合方式通过原核系统高效可溶表达LL-37,为LL-37的功能研究打下基础。     

人β2-glycoprotein I及其第V结构域蛋白的原核表达、纯化和活性鉴定

目的:旨在重组表达人源β₂-GPI及其第V结构域基因,探讨后者在抗自身免疫性动脉粥样硬化实验中的干预作用。方法:以实验室保存的CTA727-1重组质粒为模板克隆β₂-GPI及其第V结构域基因,构建pET32-β₂-GPI和pET32-DV重组表达载体,分别转化至大肠杆菌Rosetta-gami。经IPTG诱导表达,镍离子亲和层析柱纯化重组蛋白,并采用Western blot、HPTLC和ELISA方法验证了重组蛋白的活性与功能。结果:β₂-GPI及其第V结构域目的基因被分别克隆至原核表达载体pET-32a-c(+),诱导出具备CL和oxLig-1结合活性的β₂-GPI 及第V结构域融合蛋白,ELISA实验显示第V结构域融合蛋白可抑制oxLig-1/(r)β₂-GPI/Antibody免疫复合物的形成。结论:成功构建了pET32-β₂-GPI及pET32-DV表达载体,获得高水平表达且具备活性的β₂-GPI 和第V结构域重组蛋白,为研究治疗动脉粥样硬化等疾病的多肽药物奠定了基础。     

重组人半乳凝集素-1的原核表达、纯化及生物活性检测

目的:在大肠杆菌中表达半乳凝集素-1(galectin-1),并进行纯化及生物活性检测。方法:将人半乳凝集素-1基因克隆至带有His融合标签的原核表达载体pQE-30上,转化大肠杆菌M15,经IPTG诱导表达,表达产物经亲和层析纯化后,进行Western印迹鉴定,并用红细胞凝集试验检测其生物学活性。结果:双酶切鉴定和核苷酸序列测定表明重组表达质粒pQE-30-Galectin-1构建正确;重组蛋白的表达量约占菌体总蛋白的50%,主要以可溶形式表达,纯化后蛋白纯度达95%以上,且具有良好的红细胞凝集活性。结论:在大肠杆菌中表达了重组人半乳凝集素-1,且具有良好的生物活性。     

亚洲玉米螟酚氧化酶原的原核表达和性质分析

【目的】昆虫体内酚氧化酶原（PPO）是一种重要的天然免疫蛋白,参与昆虫的体液免疫和细胞免疫过程。本研究采用原核表达体系,大量表达可溶且具有活性的重组PPO蛋白,可用于各种酚氧化酶（PO）抑制剂的筛选,从而为创制抑制昆虫免疫系统的新型杀虫剂提供条件。【方法】利用从亚洲玉米螟Ostrinia furnacalis 5龄幼虫体内克隆获得PPO基因,构建了pET-28b-PPO原核表达载体,在大肠杆菌Escherichia coli中重组表达了亚洲玉米螟PPO蛋白;采用Ni-NAT亲和层析柱快速纯化目的蛋白,进行了Western杂交鉴定;测定分析了重组PPO蛋白激活为PO后的酶学性质以及不同金属离子（Mg²⁺,Cu²⁺和Fe²⁺）对PPO二级结构的影响。【结果】融合蛋白PPO得到了表达和纯化。重组PPO蛋白激活为PO后最适反应温度为30℃,最适pH为7.2,以L-DOPA为底物时PO催化反应的V_max为140.8 U/mg·min,Km为2.96 mmol/L。Fe²⁺存在的情况下重组PPO蛋白中β-折叠结构成分显著增加至53.7%±4.6%,α-螺旋结构成分则显著下降至2.6%±1.2%（P<0.05）;有Mg2+存在的情况下,重组PPO蛋白中β-折叠结构成分显著下降,α-螺旋结构成分稍有上升。有Cu²⁺存在的情况下,重组PPO蛋白中β-折叠结构成分显著下降为10.0%±1.6%,而α-螺旋结构成分则上升至35.3%±6.9%。【结论】结果说明不同金属离子对重组PPO蛋白的二级结构有显著影响。     

重组人βNGF在大肠杆菌中的可溶表达、纯化及活性鉴定

旨在大肠杆菌中可溶表达重组人神经生长因子(Recombinant humanβnerve growth factor,rhβNGF),并对表达产物进行分离纯化和生物学活性鉴定。成功扩增h NGFβ亚基基因,将其克隆入pMAL-c2X表达载体,构建了hβNGF-MBP的大肠杆菌表达体系并进行诱导表达,表达产物经纯化后以Factor Xa酶切去除麦牙糖结合蛋白(MBP),Western blot鉴定后以TF-1细胞法检测生物学活性。结果显示,pMAL-c2X-hβNGF经酶切和测序证实构建正确,25℃、180 r/min、0.5 mmol/L IPTG诱导下可溶表达hβNGF-MBP融合蛋白。hβNGF-MBP经Factor Xa酶切后可去除MBP标签,SDS-PAGE分析纯化的hβNGF位于13 k D左右,纯度可达95%。Western blot鉴定为hβNGF,结果表明,比活约为1×10~6 U/mg。在大肠杆菌中成功可溶表达hβNGF,并具有较高的生物学活性。     

线虫抗凝血蛋白c2的融合表达及其抗凝活性分析

目的:在大肠杆菌中表达硫氧还蛋白-线虫抗凝血蛋白c2(Trx-NAPc2)融合蛋白,并检测其抗凝活性。方法:将扩增的NAPc2基因经BamHⅠ和HindⅢ双酶切后连接到表达载体pET-32a中,转化至大肠杆菌BL21(DE3),分别经IPTG和乳糖诱导表达;表达产物经镍琼脂糖凝胶FF纯化后,用体外凝血酶原时间(PT)和活化部分凝血活酶时间(aPTT)试验检测抗凝血活性。结果:构建了pET-32a/NAPc2表达质粒,并在大肠杆菌BL21(DE3)中高效表达,表达产物主要以可溶形式存在,纯化的Trx-NAPc2融合蛋白能明显延长PT及aPTT。结论:在大肠杆菌中高效表达了具有生物活性的Trx-NAPc2融合蛋白,为进一步研究NAPc2的功能及应用奠定了基础。     

人Fas N端融合蛋白的原核表达、纯化及初步分析

目的：对Fas蛋白N端的30～108位肽段进行原核表达,制备可溶性蛋白,并完成二级结构分析。方法：利用BLAST程序进行同源性分析,确定所要构建的FasN端半胱氨酸富集结构域（CRD）,PCR扩增目的基因片段,将其克隆入表达载体pGEX-6P-1,并转化大肠杆菌BL21（DE3）,于16℃用0.2mmol/L的IPTG诱导25h表达GST-Fas融合蛋白;用Glu-tathione Sepharose 4B柱分离GST-Fas融合蛋白,用PreScission蛋白酶切去GST标签,将洗脱的蛋白样品经Superdex 75凝胶预装柱进一步纯化;对所获得的可溶性、高纯度蛋白进行圆二色谱分析。结果与结论：获得重组质粒pGEX-6P-1-fas,并在大肠杆菌中可溶性表达了FasN端CRD功能结构域蛋白;经亲和层析、酶切、分子筛层析后,获得了可溶的、高纯度的FasN端CRD功能结构域蛋白;圆二色谱结果揭示目标蛋白富含β-折叠,为进一步研究Fas的结构和功能奠定了基础。     

人类肠道病毒68型3A蛋白可溶区的表达及其结构初步研究

为了解人类肠道病毒68型3A蛋白可溶区的结构,本研究构建了EV-D68 3A蛋白可溶区的原核表达载体,在大肠杆菌中表达、纯化并对其结构进行了初步研究。首先,采用PCR的方法扩增EV-D68 3A(1~61)基因片段,克隆至原核表达载体pET-28a-His-SUMO中,转化进入BL21(DE3)感受态细胞,诱导表达出His-SUMO-3A(1~61)融合蛋白。经Ni-NTA树脂亲和层析初步纯化后得到大量融合蛋白,利用ULP酶酶切去除His-SUMO标签,通过Ni-NTA树脂亲和层析、阴离子交换层析柱、分子筛层析等方法分离标签并进一步纯化目的蛋白。最后通过化学交联反应检测目的蛋白的多聚化状态。结果显示,利用pET28a-His-SUMO-3A(1~61)原核表达载体能够在大肠杆菌中成功表达出大量可溶性的融合蛋白;经过多步纯化方法得到了大量高纯度的目的蛋白,平均每升大肠杆菌可得到约5mg目的蛋白,纯度达95%以上;通过化学交联反应证明了该蛋白的多聚化存在形式。本研究成功建立了EV-D68 3A蛋白可溶区的表达和纯化系统,为进一步获得3A蛋白晶体、研究3A蛋白功能以及设计以3A为靶点的抗病毒药物奠定了基础。     

人泛素结合酶9的原核表达与纯化

目的:表达和纯化高纯度的人泛素结合酶9(hUBC9)。方法:将hUBC9基因克隆到原核表达载体pGEX-6p-1上并转化大肠杆菌BL21(DE3),于30℃、1mmol/LIPTG诱导4h,表达GST-hUBC9融合蛋白。用Glutathione-Sepharose4B柱分离GST-hUBC9融合蛋白,用鼻病毒3C蛋白水解酶切去GST-hUBC9融合蛋白的GST标签,再用FPLC分子筛层析法进一步纯化hUBC9。结果和结论:获得了重组表达质粒GST-hUBC9并在大肠杆菌中可溶性表达,经亲和层析、酶切、分子筛层析后获得了可溶的、高纯度的hUBC9,为进一步研究hUBC9的功能和结构奠定了基础。     

A fungal enzyme with the ability of aflatoxin B₁ conversion: purification and ESI-MS/MS identification

Armillariella tabescens, a Chinese edible and medicinal fungus, whose multienzyme exist ability of AFB₁-converting, and ADTZ (aflatoxin-detoxizyme) had previously purified from the A. tabescens multienzyme monitored by AFB₁ conversion_. However, the enzyme now confirmed an oxidase and renamed aflatoxin-oxidase (AFO). In this paper, AFO was purified by an economical and practical three-step procedure monitored by AFB₁ conversion. And ESI-MS/MS analysis was done for identification of AFO. The following database searching (Protein Blast on NCBI) results did not show any homologous oxidase protein, which implied that AFO was mostly a new oxidase differing from other reported aflatoxin-converting enzymes such as fungal laccase and horse radish peroxidase. HPTLC analysis of the purified AFO activity suggested that the enzyme reacted at the bisfuran ring of AFB₁ which was the key toxic structure. Therefore, all these investigations implied a new choice for biodegradation of aflatoxin in foods and feeds with the practical application of AFO.     

家蚕抗菌肽CD高效表达及其抗BmNPV感染作用

通过大肠杆菌JM109诱导家蚕,提取其脂肪体总mRNA后,通过RT-PCR得到cDNA,根据GenBank上家蚕抗菌肽CecropinD的cDNA序列,设计并合成引物,然后PCR扩增得到CecropinD肽基因并克隆到pGEM-T载体中,经过EcoRΙ和XhoI酶切,连接并将CecropinD肽基因插入pET32a表达载体中。用重组质粒pET32a-ecropinD转化大肠杆菌BL21(DE3),在IPTG诱导下,融合蛋白Trx-CecropinD以可溶形式得到高效表达,经SDS-PAGE检测显示分子量为23kDa与预期大小相符,表达量约为总蛋白的30%。融合蛋白经Ni2 柱纯化后通过肠激酶切割后释放为Trx(18kDa)和CecropinD(5kDa),最后通过超滤管分离得到重组抗菌肽。通过抑菌实验测得重组CecropinD对于革兰氏阴性及阳性菌均有抑菌活性。并将重组CecropinD与家蚕病毒BmNPV作用混合4h后,一起投喂家蚕,发现病毒感染力有明显降低,说明其有抗病毒感染作用。     

质粒介导的AmpC β-内酰胺酶共有抗原表位的预测及原核表达

目的 应用生物信息学方法预测质粒介导的AmpC β-内酰胺酶(pAmpCs)共有抗原表位,并实现pAmpCs共有抗原表位-Trx融合蛋白的原核表达、纯化和鉴定。 方法 运用多序列比较工具找出各型质粒介导的AmpC β-内酰胺酶的共有相对保守区域,并利用分子生物学软件Biosun预测各亚型pAmpCs的可及性、抗原性、抗原表位、柔性、亲水性等参数,通过综合分析后找出其共有的抗原表位区域pAmpCs1。根据大肠杆菌的密码子偏好性,把氨基酸序列pAmpCs1转变为核苷酸序列pampcs1,采用重叠延伸PCR合成pampcs1片断,并构建原核表达载体pET32a(+)/pampcs1。通过测序验证,对含有该重组质粒的大肠杆菌BL21(DE3)进行诱导表达,表达产物经SDS-PAGE电泳分析后,用Ni-NTA亲和层析法纯化pAmpCs1-Trx融合蛋白,利用western blotting方法鉴定融合蛋白的抗原性。 结果 根据预测结果找到了一段各型pAmpCs共有的抗原表位区域pAmpCs1,成功构建了原核表达载体pET32a(+)/pampcs1,经IPTG诱导后得到了分子量约为23KD的融合蛋白,经Ni-NTA亲和层析柱纯化后,通过western blotting鉴定该蛋白能被抗AmpC β-lactamases多抗识别。 结论 成功构建了pAmpCs1-Trx融合蛋白原核表达载体,并获得了高纯度的pAmpCs1-Trx融合蛋白,初步证明它的抗原性,为制备特异性抗体及建立快速检测方法打下了良好的基础。     

原核表达载体pOPE101-8E5的改构及单链抗体的表达鉴定

本研究利用基因重组技术将链亲和素(core-streptavidin)cDNA插入原核表达载体pOPE101-8E5的3′端,并用单链抗体scFv-C4的重链和轻链可变区cDNA取代其scFv-8E5,构建重组表达载体pOPE101-C4::core-streptavidin。将该表达载体转化入在大肠杆菌中进行诱导表达,用聚丙烯酰胺凝胶电泳和免疫印迹法分析表达产物的表达量和产物活性。结果提示我们成功地获得一个分子量约为45kDa的scFv-C4::core-streptavidin的融合蛋白,它可结合KG1a细胞裂解物中分子量约为60kDa、45kDa的蛋白带,且其结合功能可以通过融合蛋白中的链亲和素基因直接测定。     

抗菌肽Cec4a的重组表达和抗菌活性研究*

目的:构建Cec4a的原核重组表达体系,通过诱导表达、酶切纯化获得重组蛋白,并检测产物的抗菌活性。方法:基于Cec4a的序列设计引物,克隆Cec4a基因的DNA片段。利用原核表达载体(pCold-SUMO)构建重组原核表达质粒,并将其转化到大肠杆菌C41(DE3)等感受态细胞,使用IPTG进行诱导表达。通过Ni-NTA亲和层析柱纯化,获得含有His-SUMO标签的重组Cec4a融合蛋白。在SUMO蛋白酶酶切后,再次使用Ni-NTA亲和层析纯化,得到目的蛋白,最后用鲍曼不动杆菌(ATCC19606)作为指示菌检测表达产物的抗菌活性。结果:成功构建pCold-SUMO-Cec4a原核表达质粒,测序分析其序列与预期结果一致。Cec4a融合蛋白表达量为42.8mg/L,纯化后的Cec4a重组蛋白对鲍曼不动杆菌的MIC为4 μg/mL。结论:通过原核表达,并经Ni-NTA亲和层析纯化,获得了具有抗菌活性的重组蛋白Cec4a,为研究Cec4a的生物活性、抗菌机制及应用奠定了基础。     

重组人肠激酶轻链的原核表达、纯化及活性分析

【目的】在原核表达系统中实现人肠激酶轻链(Human enterokinase light chain,hEKL)的表达和纯化。【方法】通过PCR扩增得到编码hEKL的基因片段,利用基因重组技术构建原核表达质粒pMAL-s-hEKL,在Escherichia coli中进行诱导表达,菌体经超声破碎后利用Amylose亲和柱对目标蛋白进行纯化,并利用Tricine SDS-PAGE检测酶的切割活性。【结果】目的基因能够以可溶形式表达,每升发酵液可纯化得到40 mg纯度在97%以上的MBP-hEKL蛋白,活性检测表明该酶可以对含有肠激酶识别序列的蛋白进行特异性切割,酶活力达到6.0×105U/mol。     

Expression in <Emphasis Type="Italic">Escherichia coli</Emphasis> and purification of bioactive antibacterial peptide ABP-CM4 from the Chinese silk worm, <Emphasis Type="Italic">Bombyx mori</Emphasis>

The antibacterial peptide CM4 (ABP-CM4), isolated from Chinese Bombys mori, is a 35-residue cationic, amphipathic α-helical peptide that exhibits a broad range of antimicrobial activity. To explore a new approach for the expression of ABP-CM4 in E. coli, the gene ABP-CM4, obtained by recursive PCR (rPCR), was cloned into the vector pET32a to construct a fusion expression plasmid. The fusion protein Trx-CM4 was expressed in soluble form, purified by Ni²⁺-chelating chromatography, and cleaved by formic acid to release recombinant CM4. Purification of rCM4 was achieved by affinity chromatography and reverse-phase HPLC. The purified of recombinant peptide showed antimicrobial activities against E. coli K₁₂D₃₁, Penicillium chrysogenum, Aspergillus niger and Gibberella saubinetii. According to the antimicrobial peptide database (http://aps.unmc.edu/AP/main.html), 116 peptides contain a Met residue, but only 5 peptides contain the AspPro site, indicating a broader application of formic acid than CNBr in cleaving fusion protein. The successful application to the expression of the ABP-CM4 indicates that the system is a low-cost, efficient way of producting milligram quantities of ABP-CM4 that is biologically active.     

死亡素与泛素在大肠杆菌中的高效融合表达

死亡素是由21个氨基酸残基组成的广谱抗菌肽。为了高效表达可溶性的死亡素,本研究利用递归式PCR（recursive PCR, rPCR）扩增了死亡素基因thanatin,并将其和家蝇Musca domestica泛素基因ubiquitin构成嵌合基因,克隆到表达载体pET-32a,再与硫氧还蛋白融合后构建表达载体pET-TRX-UBI-THA。将酶切和测序鉴定正确的质粒转化表达宿主菌BL21,经0.6 mmol/L IPTG诱导,TRX-UBI-THA融合蛋白得到了高效可溶性表达。SDS-PAGE和Western blot检测结果表明融合蛋白的分子量为28.9 kD,与预期的结果一致,表达量占菌体总蛋白的46％。Western blot分析结果显示融合蛋白能与Ni-NTA鏊合物特异性的结合,表明在融合蛋白的N-端带有6×His标签。利用C-端带有6×His标签的泛素C-端水解酶对融合蛋白进行切割,切割产物经Ni²⁺-NTA亲和柱和HPLC纯化（纯化量为5.4 mg/L）,Tricince-SDS-PAGE电泳得到单一的泛素蛋白条带。电喷雾质谱(ESI-MS)分析表明,纯化的泛素分子量为2.57 kD,与通过氨基酸预测的分子量完全一致。利用琼脂孔穴扩散法对泛素活性进行检测,结果显示纯化的泛素对大肠杆菌K12D31和金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus具有较强的活性抑制。本研究表明,利用泛素融合技术可以高效表达可溶性的死亡素。     

2型猪链球菌表面蛋白 Hp0272的原核表达及其结合人血清 IgA 的活性分析

目的：构建带GST标签的2型猪链球菌功能未知表面蛋白Hp0272的原核表达质粒并在大肠杆菌中表达,获得纯度较高的GST-Hp0272重组融合蛋白,鉴定其与人血清IgA（higA）的结合活性。方法：采用分子生物学方法构建pGEX-4T-1-0272重组表达载体,将其转入大肠杆菌BL21（DE3）菌株,IPTG诱导表达后,通过SDS-PAGE分析蛋白表达情况;用GSTrap柱亲和纯化目的蛋白并经Western印迹验证,采用配体印迹和ELISA方法鉴定GST-Hp0272与hlgA的结合活性。结果：构建了GST融合蛋白原核表达质粒,并获得GST-Hp0272融合蛋白,鉴定到Hp0272特异性地与hisA结合,且结合区域位于Hp0272的N端（41-318an）。结论：获得了GST-Hp0272融合蛋白,并鉴定到其能特异性结合hlgA,为进一步了解Hp0272在猪链球菌致病过程中的作用提供了基础。